乙型肝炎病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途
【专利摘要】本发明涉及乙型肝炎病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列和编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列的嵌合核酸序列，包含该嵌合核酸序列的重组载体和宿主细胞，以及所述重组载体的制备方法和在制备用于预防或治疗乙肝病毒和沙眼衣原体相关疾病的嵌合疫苗中的用途。本发明的疫苗对HBV和Ct相关的疾病具有高效、安全的免疫预防和治疗作用，且制备工艺和免疫过程简单、效果明显、可重复性强。
【专利说明】乙型肝炎病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药技术和免疫学领域，具体而言涉及一种乙肝病毒和沙眼衣原 体嵌合核酸疫苗、其制备方法、及其在防治乙肝病毒感染和相关肿瘤（如原发性肝癌）和沙 眼衣原体感染中的应用。
【背景技术】
[0002] 乙肝病毒（HBV)感染是全球性公共卫生问题，我国是乙型肝炎的高流行区。慢性 HBV感染威胁着人类健康，持续感染可发展为慢性肝炎、肝硬化或肝癌等。目前对乙型肝 炎尚缺乏有效的治疗方法，而进行乙肝疫苗免疫接种是预防和控制乙型肝炎切实有效的途 径。
[0003] 沙眼衣原体（Ct)为性传播疾病（STDs)的主要病原之一。感染后引起男性尿道炎 和女性宫颈炎，据报道男性尿道炎中有50-60%由Ct感染引起（Tiodorovi. J，Randelovi. G, Koci. B et al,Bacteriological finding in the urethra in men with and without non-gonococcal urethritis，2007,64(12) :833-6)，并常与其它病原混合感染，通过性传 播感染女性泌尿生殖道，导致不良妊娠，如流产、死胎等，并与宫颈癌发生密切相关。Ct感 染经治疗后极易复发，WHO估计全球约有9千万名Ct患者，每年用于治疗Ct感染耗资数十 亿美兀（Wang SA，Papp JR, Stamm WE et al, Evaluation of antimicrobial resistance and treatment failures for Chlamydia trachomatis ：a meeting report. J Infect Dis. 2005,191 (6) :917-23.)。
[0004] 近年来，我国由Ct引起的STDs发病呈持续上升趋势，已对人类健康构成了极大危 害。对于HBV和Ct，尤其对Ct感染性疾病，迄今尚缺乏有效的防治方法。而寻求有效的疫 苗，尤其是能同时防治HBV和Ct感染性疾病的疫苗研究，是各国相关学科工作者的重要课 题之一。
[0005] 核酸疫苗，即DNA疫苗，是一种新型疫苗，其由编码目的抗原的基因和质粒的表达 载体组成，直接导入宿主细胞后并不与宿主染色体整合，而是通过细胞的转录系统表达蛋 白抗原，诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫。
[0006] 核酸疫苗的发展被称为继完整病原体疫苗和基因工程重组蛋白疫苗后的"第三 次疫苗革命"。与传统的减毒或灭活疫苗相比，核酸疫苗具有便于储存和运输的优点；与亚 单位疫苗相比，核酸疫苗具有能长期激活机体全面免疫反应（细胞免疫反应和体液免疫反 应）、制备工艺简单和费用低廉（不用纯化蛋白）的优点。
[0007] 研究证明：乙肝病毒表面抗原（HBsAg)具有良好的免疫原性，对预防乙肝病毒 感染具较好的效果，已经成为预防乙肝病毒感染的蛋白疫苗，并广泛应用。HBsAg是具有 糖基并通过二硫键连接的蛋白质，可在其上插入一些外源性抗原形成一嵌合蛋白，以增强 外源性蛋白的免疫原性（Michel ML，Manciai M，RiviereY，et al. T and B Iymphocyto responses to Human Immunodeficiency Virus(HIV)Type I in Macaques immunized with hybrid HIV/hepatitis B surface antigen particles. J of virology, 1990 ;64(5)： 2452-2455)。目前，HBsAg DNA疫苗的研究已显示具有与HBsAg蛋白同样的免疫保护作用 (产生特异性的体液免疫和细胞免疫）。
[0008] Ct有19个血清型别，其中D-H等血清型主要引起泌尿生殖道感染，而其中E和 D型则是国内外报道（参见：陈丽丽，吴移谋，邓仲良等.中国南方部分城市泌尿生殖道沙 眼衣原体基因分型研究·中华皮肤科杂志，2006, 39 :275-277 ;Suchland RJ，Eckert L0， Hawes SE et al, Longitudinal assessment of infecting serovars of Chlamydia trachomatis in Seattle, public health clinics : 1988-1996. Sex Transm Dis,2003, 30:357-361.)中最为常见的型别。Ct主要以其主要外膜蛋白（MOMP)作为疫苗的研究 基石出（可参见：Pal S, Theodor I, Peterson EM, de la Maza LM. , Immunization with the Chlamydia trachomatis mouse pneumonitis major outer membrane protein can elicit a protective immune response against a genital challenge. Infect Immun, 2001,69(10) :6240-7;以及 Zhang D, Yang X, Berry J et al. DNA vaccination with the major outer-membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis(mouse pneumonitis)infection. Infect Dis. 1997 ；176 (4) :1035_40)〇
[0009] 目前Ct疫苗的研究包括：①亚单位疫苗：选用MOMP或其可变区的肽链作为抗原， 但效果不理想，其主要原因可能是每一血清型别的MOMP抗原性不一样。②重组疫苗：通过 基因工程将MOMP基因克隆到大肠杆菌，使之高效表达，分离纯化后作为疫苗，其免疫保护 作用有待进一步研究。③合成多肽疫苗：以MOMP的可变区为基础，选择CTL或Th表位，人 工合成肽链，可产生一定的保护性细胞和体液免疫，但免疫原性较弱。④DNA疫苗：将编码 MOMP或其上的某一段肽链基因克隆到质粒上后作为疫苗，由于抗原的产生是内源性的并且 具天然结构，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，被认为是目前研究中最有希望的Ct疫 苗。
[0010] 由于天然的MOMP蛋白含有二硫键很难制备获得并保持其活性，并且研究表明可 能会引起病理性免疫应答，故选择MOMP蛋白中具有免疫优势的多个T细胞表位（包括CTL 表位和Th表位）和B细胞表位，组成Ct MOMP多表位（Ct MOMP multiepitope，Ct MOMPm), 将该多表位基因克隆至真核质粒并鉴定后免疫小鼠，分别在小鼠血清和阴道分泌物中检测 到针对Ct的特异性抗体IgG、SlgA及特异性CTL细胞免疫，并且对小鼠模型生殖道Ct攻击 具有一定的保护作用。但该表位DNA疫苗的免疫原性较弱，因此增强其免疫原性及免疫保 护作用有待进一步研究（参见：朱珊丽，石朝辉，李文姝等.沙眼衣原体主要外膜蛋白多表 位基因的免疫原性研究.中华预防医学杂志，2009,43(3) :232-236)。
[0011] 综上所述,本领域迫切需要开发出一种可增强Ct多表位DNA疫苗的免疫原性及免 疫保护作用的疫苗，同时具备防治多种疾病的多价疫苗，尤其是一种可同时防治HBV和Ct 的更安全、高效的核酸疫苗。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于提供一种可用于同时防治乙肝病毒感染、其相关肿瘤（如原发 性肝癌）和沙眼衣原体感染的乙肝病毒和沙眼衣原体嵌合核酸疫苗。
[0013] 在本发明的第一方面，提供了一种嵌合核酸序列，所述序列包含：
[0014] (a)编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列；和
[0015] (b)编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列。
[0016] 在一个优选例中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白是含有多个CTL表 位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列。
[0017] 在另一优选例中，所述多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列是串联 排列的。
[0018] 在另一个优选例中，（a)和（b)中的核酸序列经人源密码子优化修饰。
[0019] 在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列连接 于编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列的羧基端或氨基端。
[0020] 在另一优选例中，（a)和（b)中的核酸序列直接连接或通过连接序列连接。
[0021] 在本发明的一个实施方式中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的序列如 SEQ ID NO : 2 所示。
[0022] 在本发明的另一个实施方式中，所述乙肝病毒表面抗原的序列如SEQ ID NO :5所 /Jn 〇
[0023] 在本发明的另一个实施方式中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的 核酸序列选自：SEQ ID NO :1(即未经人源化密码子优化的原序列）和SEQ ID NO :3(即经 人源化密码子优化的序列）。
[0024] 在本发明的另一个实施方式中，所述编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列选自：SEQ ID NO :4(即未经人源化密码子优化的原序列）和SEQ ID NO :6(即经人源化密码子优化的 序列）。
[0025] 在本发明的第二方面中，提供了一种重组载体，所述载体包含本发明上述的嵌合 核酸序列。
[0026] 在一个优选例中，所述载体选自：真核表达载体或原核表达载体，优选细菌质粒、 噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优选pcDNA3. I (+)、pSIREN_NE0、 pET32a (+)、pQE30、pGEX-4T-l、pPICZA。
[0027] 在本发明的第三方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有 本发明上述的载体。
[0028] 在一个优选例中，所述宿主细胞选自原核细胞、低等真核细胞或高等真核细胞，优 选动物细胞、大肠杆菌、或酵母菌，更优选C0S-7细胞、C0S-1细胞、E. coli或GS115。
[0029] 在本发明的第四方面中，提供了本发明上述的嵌合核酸序列、重组载体或宿主细 胞在制备用于预防或治疗乙肝病毒和沙眼衣原体感染相关疾病的嵌合疫苗中的用途。
[0030] 在一个优选例中，所述乙肝病毒和沙眼衣原体相关疾病选自：乙肝病毒感染、乙肝 病毒感染相关肿瘤、或沙眼衣原体感染，优选乙型肝炎、原发性肝癌、尿道炎、宫颈炎、沙眼。
[0031] 在本发明的第五方面中，提供了一种组合物，其包含有效量的本发明前述的嵌合 核酸序列、重组载体或宿主细胞和药学上或免疫学上可接受的载体、赋形剂或佐剂。
[0032] 在一个优选例中，所述组合物为免疫组合物或药物组合物，优选疫苗。
[0033] 在一个优选例中，所述载体、赋形剂或佐剂选自：脂质体、淀粉、明胶、铝盐佐剂、皂 苷佐剂或Ribi佐剂。
[0034] 在另一优选例中，所述组合物中含有0.01-99. 9wt %的权利要求4所述的重组载 体，优选 〇· 1_99. Owt%。
[0035] 在另一优选例中，所述组合物为肌肉注射、皮肤免疫或粘膜免疫。
[0036] 在本发明的第六方面，提供了一种制备本发明上述重组载体的方法，所述方法包 括：
[0037] (i)提供编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列以及编码乙肝病毒 表面抗原的核酸序列；
[0038] (ii)连接所述核酸序列，形成嵌合核酸序列；
[0039] (iii)将步骤（ii)所得嵌合核酸序列克隆到载体中。
[0040] 在一个优选例中，所述沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的序列如SEQ ID NO : 2所示。所述乙肝病毒表面抗原蛋白的序列如SEQ ID NO :5所示。
[0041] 在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列选 自：SEQ ID NO :1 (即未经人源化密码子优化的原序列）、SEQ ID NO :3(即经人源化密码子 优化的序列）。
[0042] 在另一优选例中，所述编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列选自：SEQ ID NO :4(即 未经人源化密码子优化的序列）、SEQ ID NO :6 (经人源化密码子优化的序列）。
[0043] 在另一优选例中，所述编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列连接 于编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列的羧基端或氨基端。
[0044] 应理解的是，本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言 是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图 I :pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm-HBsAg 重组质粒鉴定图。
[0046] 图中，"Ml" 表示：DL1000DNA 标记；"1" 表示：重组质粒 pcDNA3. I (+)/Ct MOMPm-HBsAg ;"2"表示：pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm-HBsAg/EcoR I+Xho I ;"3"表示：Ct MOMPm PCR 产物；"4"表示：pcDNA3. l(+)/Ct MOMPm-HBsAg/Hindlll+EcoR I ;"5"表示：HBsAg PCR 产物；"M2"表示：DL250DNA标记。
[0047] 图 2 :pcDNA3. I (+) /HBsAg-Ct MOMPm 重组质粒鉴定图。
[0048] 图中，"Ml" 表示：DL1000DNA 标记；"1" 表示：重组质粒 pcDNA3. I (+VHBsAg-Ct MOMPm ;"2" 表示：pcDNA3.1 (+)/HBsAg-Ct MOMPm/EcoR I+Xho I ;"3" 表示：HBsAg PCR 产 物；"4"表示：pcDNA3. I (+)/HBsAg-Ct MOMPm/BamH I+EcoR I ;"5"表示：Ct MOMPmPCR产物； "M2" 表示：DL250DNA 标记。
[0049] 图3 :间接免疫荧光检测HBsAg在C0S-7细胞中的表达。
[0050] 图4 :间接免疫荧光检测Ct MOMPm在C0S-7细胞中的表达。
[0051] 图5 =RT-PCR鉴定嵌合重组质粒真核细胞内HBsAg目的基因转录的mRNA。
[0052] 图中，"Μ"表示：IOObp DNA Ladder ;"Γ'表示：pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm 质粒转染的 C0S-7 细胞 RT-PCR 产物；"2" 表示：pcDNA3. I (+) /Ct MOMPm-HBsAg 质粒转染的 C0S-7 细胞 RT-PCR产物；"3"表示：pcDNA3. 1(+)/HBsAg-Ct MOMPm质粒转染的 C0S-7 细胞RT-PCR产物； "4"表示：？。0嫩3.1(+)/冊8六8质粒转染的0^-7细胞1?1'-?0?产物 ；"5"表示：？。0嫩3.1(+) 质粒转染的C0S-7细胞RT-PCR产物。
[0053] 图6 =RT-PCR鉴定嵌合重组质粒真核细胞内Ct MOMPm目的基因转录的mRNA。
[0054] 图中，"Μ"表示：IOObp DNA Ladder ;"1"表示：pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm 质粒转染的 C0S-7 细胞 RT-PCR 产物；"2" 表示：pcDNA3. I (+) /Ct MOMPm-HBsAg 质粒转染的 C0S-7 细胞 RT-PCR产物；"3"表示：pcDNA3. 1(+)/HBsAg-Ct MOMPm质粒转染的 C0S-7 细胞RT-PCR产物； "4"表示：？。0嫩3.1(+)/冊8六8质粒转染的0^-7细胞1?1'-?0?产物 ；"5"表示：？。0嫩3.1(+) 质粒转染的C0S-7细胞RT-PCR产物。
[0055] 图7 :各组小鼠免疫后血清中Ct特异性IgG抗体的动态变化。
[0056] 图8 :各组小鼠免疫后血清中HBsAg特异性IgG抗体的动态变化。
[0057] 图9 :各组小鼠免疫后阴道分泌物中Ct特异性SlgA抗体的动态变化。
[0058] 图10 :免疫小鼠脾淋巴细胞对携带Ct MOMP多表位蛋白抗原靶细胞的特异性CTL 杀伤率。
[0059] 图11 :Ct攻击后各组小鼠外阴炎症情况。
[0060] 图12 :各组小鼠 Ct攻击后生殖系统病理切片观察。
[0061] 图13 :各组小鼠 Ct攻击后生殖道Ct分离培养和IFU计数情况。
【具体实施方式】
[0062] 本发明人以HBsAg和Ct MOMP多表位基因为基础，并经人源化密码子优化，制备了 HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合DNA疫苗。经免疫实验证明了 HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合DNA 疫苗兼具免疫预防和治疗小鼠生殖道Ct感染作用，且其对Ct的免疫防治效果显著优于非 嵌合的Ct MOMP多表位疫苗。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0063] 具体而言，本发明人通过生物软件分析并预测了多个血清型Ct MOMP的免疫优势 区，筛选共有的含有多个CTL表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列，并对该基因进行了 人源密码子优化修饰，获得了 Ct MOMP多表位基因。同时，本发明人还对以HBsAg基因进行 了人源密码子修饰。然后，通过分子生物学技术，制备了 HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合DNA疫 苗。
[0064] 发明人进一步通过免疫小鼠检测了该DNA疫苗的免疫保护作用：通过ELISA方法 检测免疫后小鼠血清IgG和阴道分泌物SlgA抗体水平、脾淋巴细胞CTL特异性杀伤活性等 来评价表位疫苗的免疫效应及在小鼠生殖道感染Ct模型中的免疫保护作用。结果显示， HBsAg-Ct MOMPm DNA疫苗兼具免疫预防和治疗小鼠生殖道Ct感染作用，且其对Ct的免疫 防治效果显著优于非嵌合的Ct MOMP多表位疫苗。
[0065] 本发明通过实验研究证实，所制备HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合DNA疫苗，能刺激机 体产生较强的针对HBsAg和Ct MOMP特异性体液免疫效应，尤其是局部生殖道粘膜的保护 性抗体，及针对Ct MOMP的细胞免疫，具有同时针对HBsAg和Ct感染免疫预防和治疗作用， 为采用一种疫苗防治多种疾病的深入研究和应用奠定基础，具有重要的科研价值。
[0066] 同时，本发明还通过动物实验验证了 HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合基因，增强Ct MOMP多表位基因的免疫效应。研究结果证实，HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合基因，可诱导机体 产生增强的Ct特异性的体液免疫和细胞免疫，尤其是粘膜局部的SlgA的抗体反应，这些免 疫效果显著优于非嵌合的Ct MOMP多表位疫苗，从而增强免疫保护效应。
[0067] 术语说明
[0068] 本文中的术语"免疫活性"或"免疫原性"指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳 动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语"核酸疫苗" "DNA疫 苗"或"嵌合（核酸）疫苗"指可引发哺乳动物免疫应答的本发明的嵌合核酸序列。
[0069] 本文中的术语"免疫应答"包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防 止感染；或防止或抑制由乙肝病毒和沙眼衣原体所导致的疾病。
[0070] 本文中的术语"对象"或"个体"或"患者"指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤 其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受 关注的是那些易受或己受乙肝病毒和/或沙眼衣原体感染的对象。
[0071] 本文中的术语"核酸"和"核酸序列"指聚合形式的任意长度的核苷酸（核糖核苷 酸或脱氧核糖核苷酸）。它包括（但不限于）单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和CDNA。
[0072] 本文中的术语"有效量"或"免疫有效量"指以单剂或连续剂一部分给予个体的量 对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类 别（如非人灵长类等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗 医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通 过常规实验来确定。
[0073] 嵌合核酸序列
[0074] 本发明的嵌合核酸序列包含：(a)编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白（Ct Μ0ΜΡ)的核酸序列；和（b)编码乙肝病毒表面抗原的核酸序列。
[0075] 术语"沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白（Ct Μ0ΜΡ) "是指含有多个MOMP CTL 表位、Th表位和B细胞表位的氨基酸序列。所述多表位蛋白的获得可通过预测和筛选多种 血清型别Ct MOMP的共同表位基因，将同时含有多个HLA-A2特异性的CTL表位和Th及B细 胞表位组成多表位基因。例如可应用网络资源数据库获取Ct各血清型的MOMP基因和氨基 酸序列，对各血清型别的Ct MOMP氨基酸序列进行HLA-A*0201限制性T细胞表位（CTL)、Th 表位和B细胞表位预测，选择分值高的优势表位连接成多表位基因，优选串联连接。所述的 优势表位包括（但不限于）：HLA_A2限制性CTL表位（l-9aa，18-26aa，16-24aa，26_34aa， 27-35&&，29-37&&，38-46&&、40-48&&)、111表位（8-27&&)和8细胞表位（2-15&&)，其中包括 h-2d 型的 CTL 表位（18-26aa)。
[0076] 术语"乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg) "是指乙肝病毒的主要结构蛋白一乙肝表面 抗原，其编码序列在本领域中是己知的（例如参见Yong-Lin Y，Qiang F，Ming-Shun Z，et al. Hepatitis B surface antigen variants in voluntary blood donors in Nanjing, China. Virol J.2012Aprl4;9(l) :82. doi :10. 1186/1743-422X-9-82·)。本领域普通技术 人员应理解，这些已知的HBsAg编码序列可用于本发明的嵌合核酸序列中。
[0077] 应理解，本发明的核酸序列还可包括在严格条件下与上述编码序列杂交且具有相 同或类似活性的分子。术语"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度下的杂交 和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C ;或⑵杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰胺， 0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或⑶仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优 选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80% 25以上、85%以上或90%以 上，更优选是95 %以上时才发生杂交。例如，所述序列可为互补序列。
[0078] 在本发明的一个优选实施方式中，对本发明Ct MOMP编码序列或HBsAg编码序列 进行人源密码子优化修饰，从而使得所得的基因可在表达系统中获得更高的表达。优选嵌 合核酸序列中的一者或两者均为经过人源密码子优化修饰的核酸序列。所述的"人源密 码子优化修饰"可采用本领域中已知的常规方法进行（例如可参照Pan W，RavotE，Tolle R 等的 Vaccine candidate MSP-1 from Plasmodium falciparum ：a redesigned4917bp polynucleotide enables synthesis and isolation of full-length protein from Escherichia coli and mammalian cells. Nucleic Acids Res. 1999Feb5 15 ；27 (4)： 1094-103)。较佳地，使得核酸序列中的GC含量提高5-40 %，优选10-30 %，更优选13-23 %， 但保持其编码的氨基酸不变。
[0079] 本发明的核酸序列可直接连接，或通过连接序列连接。本文中术语"连接序列"是 指位于编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白的核酸序列和编码乙肝病毒表面抗原的 核酸序列之间，起到连接作用的序列。连接序列的长度没有特别限制，通常为0-100个。连 接肽的长度也可为0,此时表示基因序列直接相连。通常，连接序列不影响或不显著影响所 连接序列的表达和所产生抗原的免疫效应。
[0080] 在本发明的一个优选实施方式中，Ct MOMP编码序列连接于HBsAg编码序列的羧 基端或氣基端。
[0081] 载体及宿丰细朐
[0082] 在获得了编码本发明的嵌合核酸序列之后，可将其连入合适的表达载体，再转入 合适的宿主细胞。
[0083] 本发明中，术语"载体"与"重组载体"可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬 菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复 制和稳定，任何质粒和载体都可以用。本发明中可使用选自下组的载体：真核表达载体或原 核表达载体，优选细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优 选 pcDNA3. 1 (+)、pSIREN-NEO、pET32a、pQE30、pGEX-4T-l 或 pPICZA。
[0084] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如植物细胞、动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细 胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用C0S-7细胞、C0S-1细胞、E. coli、GSl 15。
[0085] 本发明的核酸疫苗由编码目的抗原的基因和质粒的表达载体组成，直接导入宿主 细胞后并不与宿主染色体整合，而是通过细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导机体产生特 异的细胞免疫和体液免疫。
[0086] 鉬合物
[0087] 本发明还提供了包含本发明的重组载体的各种组合物，包括药物组合物和疫苗组 合物。该组合物可用于预防或治疗乙肝病毒和沙眼衣原体相关疾病，所述疾病包括（但不 限于）：乙肝病毒感染、乙肝病毒感染相关肿瘤、或沙眼衣原体感染，优选乙型肝炎、原发性 肝癌、尿道炎、宫颈炎、沙眼。
[0088] 包含本发明的重组载体的各种组合物可以包含按重组载体的实际用途所选用的 缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领 域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋 形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物 已有详述，包括如"Remingtor^ s Pharmaceutical Sciences"（《雷明顿药物科学》，第19 版（1995)Mack Publishing Co·)。
[0089] 可将药物组合物或疫苗组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓 齐U、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物（如贴片等）、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用 的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合 物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂 和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适PH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅 助性材料。
[0090] 当用作疫苗时，本发明的重组载体可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知 的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体（vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适 的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无 菌悬浮液（己知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体）。
[0091] 另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调 节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括（但不限制于）铝 盐佐剂；阜苷佐剂；Ribi 佐剂（Ribi ImmunoChem Research In. ,Hamilton,MT) ；Montanide ISA 佐剂（Seppic, Paris, France) !Hunteri s TiterMax 佐剂（CytRx Corp. , Norcross, GA) ;Gerbu 佐剂（Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包 含调节免疫应答的其它成分（IL-12、CpG寡脱氧核苷酸（CpG-ODN)等）。
[0092] 给药涂径和剂量
[0093] 当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组载体施用于对象。通常采用与常 规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的 形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂 等。
[0094] 给予本发明药物组合物或疫苗组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、 肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可 以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予， 且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
[0095] 应以"有效量"给予重组疫苗，即重组载体的量在所选用的给药路径中足以引发免 疫应答，能有效促使保护宿主抵抗乙肝病毒和沙眼衣原体感染或乙型肝炎和衣原体感染症 状。
[0096] 在各疫苗剂份中所选用的重组载体的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的 副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1 μ g-10mg，较佳地 为5 μ g-2mg，更佳地10 μ g-lmg蛋白质。以重组载体核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通 常包括给予约1 μ g-l〇mg嵌合核酸/kg体重，优选1 μ g-10mg嵌合核酸/kg体重，更优选 1 μ g-10mg嵌合核酸/kg体重。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究 方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强 剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/ 或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
[0097] 本发明的丰要优点
[0098] 本发明的主要优点在于：
[0099] (1)提供了一种HBsAg-Ct MOMP多表位嵌合DNA疫苗，所述嵌合DNA疫苗能诱导机 体产生有效的HBsAg和Ct MOMP特异性的体液免疫和细胞免疫，同时对HBV和Ct相关的疾 病具有免疫预防和治疗作用；
[0100] ⑵本发明的疫苗相对于Ct MOMP多表位DNA疫苗而言，对Ct具有有效的免疫效 应，可用于Ct相关疾病的更有效预防和治疗；
[0101] (3)本发明的疫苗制备工艺简单，费用低廉，使用方便安全，易于储存和运输，且能 长期激活机体全面免疫反应，具有免疫过程简单、接种安全、效果明显、可重复性强等优点。
[0102] 实施例
[0103] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件（例如可参照如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或 Immunology Methods Manual,Ivan Lefkovits,CRC,1998)或 按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0104] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0105] 实施例I. HBsAg某闵的修饰和获得
[0106] 以温州地区HBsAg阳性患者血清标本为模板，设计合成PCR引物，两端引入酶切位 点（BamH I和EcoR I)，扩增出HBsAg完整开放读码框，将PCR产物和载体pcDNA3. 1 (+)同 时经双酶切后连接，构建重组质粒pcDNA3. I (+) /HBsAg (wt)，经测序鉴定。
[0107] 为增强HBsAg的表达量，对HBsAg全长核苷酸（SEQ ID NO :4)进行修饰和设计， 即进行人偏好密码子优化，同时排除了糖基化位点以及转录终止序列等，选择第3位为G 和C的同义密码子，确保优化后的氨基酸与野生型完全一致，将其GC含量由42. 4%提高至 60. 1%，但保持其编码的氨基酸不变（SEQ ID NO :5)。在优化修饰后的HBsAg碱基序列两 端分别添加 BamH I、EcoR I酶切位点，委托上海生工生物工程公司合成全基因序列。合成 的HBsAg密码子优化序列，用BamH I、EcoR I酶切后连接到载体pcDNA3. 1(+)上，构建重组 质粒pcDNA3. I (+) /HBsAg (优化），并经测序鉴定。
[0108] 实施例2. HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗的制各及体外表汰分析
[0109] 设计并合成PCR引物，两端分别引入酶切位点EcoR I和Xho I，以经人源密码子 优化的Ct MOMP多表位基因为模板扩增PCR产物，将该PCR产物经EcoR I和Xho I酶切后 连接至重组质粒pcDNA3. I (+) /HBsAg (优化）中，构建HBsAg羧基端含Ct MOMP多表位基因 的重组真核表达质粒，并通过酶切（图1、2)和测序鉴定。结果表明：HBsAg-Ct MOMPm和Ct MOMP m-HBsAg嵌合重组质粒构建成功。
[0110] 将所得重组真核质粒转染C0S-7细胞，分别采用HBsAg和Ct MOMPm特异性引物， 用RT-PCR方法检测转染后C0S-7细胞中HBsAgXt MOMPm基因的mRNA转录情况（图3、4)。 结果显示，分别得到约700bp的HBsAg和170bp的Ct MOMPm基因 DNA片段，与预期的目的 基因片段大小相符（图3);为避免mRNA中有遗留的重组质粒污染，所有提取的mRNA直接用 HBsAg和Ct MOMPm特异性引物做PCR扩增，均未扩增出明显的目的条带，表明上述RT-PCR 产物源于重组质粒转染C0S-7细胞后的转录mRNA。
[0111] 进一步用间接免疫荧光法鉴定了重组质粒在C0S-7细胞中的表达情况（图5、 6)。结果显示：以人 HBsAb 阳性血清为一抗，pcDNA3. I (+) /HBsAg、pcDNA3. I (+) /HBsAg-Ct MOMPm、pcDNA3. I (+) /CtMOMPm-HBsAg在COS-7细胞内均可表达HBsAg蛋白（胞浆内绿色 荧光点）。以沙眼衣原体全菌体免疫家兔的血清为一抗，pcDNA3.1 (+)/HBsAg-Ct MOMPm、 pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm-HBsAg和pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm在C0S-7细胞内均可表达Ct MOMP 多表位蛋白（胞浆内绿色荧光点）。
[0112] 该结果表明：含HBsAg-Ct MOMPm重组质粒在体外真核细胞内能有效表达。
[0113] 实施例3. HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗的免疫保护效应
[0114] 选择6?8周龄雌性BALB/c小鼠（购自上海斯莱克实验动物有限责任公司）， 随机分为6组，每组21只，分别为：PBS对照组、pcDNA3. 1 (+)组、pcDNA3. I (+)/HBsAg组、 pcDNA3. I (+)/HBsAg-Ct MOMPm重组质粒组、pcDNA3. 1(+)/Ct MOMPm-HBsAg重组质粒组和 Ct MOMPm DNA免疫组。分别于0、2、4周取100 μ 1测试样品（1 μ g/μ 1)，对小鼠进行股四头肌 注射免疫。于免疫后〇w、2w、4w、6w、8w、10w、12w、14w、18w、22w分别采集尾静脉血和阴道分 泌物，用ELISA方法检测血清IgG抗体和分泌物中slgA抗体；第7周取脾脏制备脾细胞悬 液，采用乳酸脱氢酶（LDH)释放法检测针对Ct MOMP的CTL特异性杀伤活性。每组剩余小 鼠，均用E血清型Ct进行攻击，攻击后每天观察小鼠的活动情况和外阴炎症的严重程度，并 拍照记录。
[0115] (1)免疫小鼠血清特异性抗体IgG的测定结果：
[0116] 采用间接ELISA方法，将纯化后的Ct全菌体和HBsAg包被聚乙烯微量反应板，封 闭后，加入免疫小鼠1 : 50稀释血清，37°C反应2h，洗板，分别加入1 : 2000稀释的HRP-羊 抗鼠18610(^1，371：反应211，洗板后邻苯二胺（0?0)显色，加入2111〇1/1450 4终止反应，酶 标仪测A490值。每份血清标本均重复3孔检测，测定各组免疫小鼠血清特异性抗体IgG水 平。结果如图7、8所示。
[0117] 结果显示，HBsAg-Ct MOMPm免疫组、Ct MOMPm-HBsAg免疫组、Ct MOMPm免疫组小鼠 血清中Ct特异性抗体IgG水平随免疫次数的增加，相应抗体水平不断升高，术次免疫后3w 达到最高，以后逐渐降低，持续至18w仍有一定的抗体水平（图7) ;Ct MOMPm-HBsAg组和Ct MOMPm组的抗体水平接近，在8-14w时均低于HBsAg-Ct MOMPm组（F = 216. 96, P < 0. 05)， 但在在2?18w时明显高于pcDNA3. 1 (+)组及PBS对照组相比，差异有统计学意义（F = 153. 04, P < 0· 05)。
[0118] 与此同时，免疫后小鼠也能产生针对HBsAg特异性的IgG抗体（图8)。HBsAg-Ct MOMPm组、Ct MOMPm-HBsAg组、HBsAg组小鼠血清的HBsAg特异性抗体IgG水平均随免疫次 数的增加，抗体水平不断升高，末次免疫后Iw达到高峰，持续至22w仍有一定的抗体水平， 与pcDNA3. 1 (+)组及PBS组相比，均有显著性差异（F = 234. 31，P < 0. 05)。
[0119] (2)免疫小鼠分泌物特异性抗体SlgA的测定：
[0120] 采用间接ELISA方法，方法同上，结果如图9所示。
[0121] 结果显示，HBsAg-Ct MOMPm组、Ct MOMP m-HBsAg组、Ct MOMPm组阴道分泌物中特 异性抗体slgA水平随免疫次数的增加，相应抗体水平不断升高，末次免疫后2w达到高峰， 然后逐渐降低，但HBsAg-Ct MOMPm组降速较缓。HBsAg-Ct MOMPm组小鼠阴道分泌物特异性 抗体 slgA 水平与 Ct MOMPm-HBsAg 组、Ct MOMPm 组、pcDNA3. 1 (+)组及 PBS 相比，在 4-10w 时均有显著性差异（F = 196. 67, P < 0. 05);同时，Ct MOMPm-HBsAg组小鼠阴道分泌物中 特异性抗体slgA的水平也高于Ct MOMPm组，差异也有统计学意义（F = 17. 4, P < 0. 05)。
[0122] (3)免疫小鼠特异性CTL杀伤活性结果：
[0123] 取脾脏制备脾细胞悬液调整浓度至2X106个/ml，采用乳酸脱氢酶（LDH)释放法 检测CTL特异性杀伤活性。结果如图10所示。
[0124] 免疫后，HBsAg-Ct MOMPm免疫组小鼠效应细胞与靶细胞比（E : T)为20 : 1、 10 : 1和5 : 1时，针对Ct MOMPm特异性的CTL杀伤活性较Ct MOMPm组、Ct MOMPm-HBsAg 组，以及其它对照组的杀伤活性均有显著性差异（P < 〇. 05)(图10);
[0125] (4) HBsAg-Ct MOMPm DNA疫苗对小鼠生殖道Ct感染的免疫保护作用：
[0126] PBS、pcDNA3. 1 (+)、pcDNA3. I (+) /HBsAg 组、HBsAg-Ct MOMPm 组、Ct MOMPm-HBsAg 组等6组小鼠末次免疫2周后，用E血清型沙眼衣原体标准株（购自美国典型物保藏中心 (ATCC :VR-348B))进行生殖道感染。
[0127] 结果显示：经阴道Ct感染后第1天起，各组小鼠均开始出现不同程度的感染迹象， 如外阴有红肿、分泌物异常等。HBsAg-Ct MOMPm组小鼠开始炎症表现较剧烈但炎症消退快 于其他组，仅持续15天左右；Ct MOMPm-HBsAg组和Ct MOMPm组小鼠炎症表现相似，持续时 间也较短，在25天左右，比PBS等对照组小鼠短5天左右（图11)。
[0128] 小鼠生殖道Ct攻击后生殖系统病理变化结果（图12) :PBS组、pcDNA3. 1 (+)组、 HBsAg组小鼠阴道Ct攻击后造成不同程度的生殖道感染及病变：阴道水肿；输卵管积水、 肿胀、管腔变薄、上皮细胞肿胀、皱襞消失；炎症范围波及至卵巢，引起卵巢炎性细胞浸润 及充血；而HBsAg-Ct MOMPm和Ct MOMPm免疫组阴道、输卵管和卵巢炎症程度均较轻，说明 HBsAg-Ct MOMPm重组质粒和Ct MOMPm重组质粒DNA免疫对沙眼衣原体感染的损伤、迁延和 扩散有一定的抑制作用。
[0129] Ct攻击后小鼠阴道分泌物细胞培养法检测Ct IFU结果表明（图13)，在Ct攻 击10天以后，HBsAg-Ct MOMPm组小鼠比其他组小鼠检出的Ct IFU量要低（F = 81. 77， P < 0. 05);而Ct MOMPm-HBsAg组和Ct MOMPm组小鼠阴道分泌物Ct IFU检出量接近， 在Ct攻击10天后，均高于HBsAg-Ct MOMPm质粒组但低于对照组（pcDNA3. I (+)/HBsAg、 pcDNA3. 1(+)、PBS);其中Ct MOMPm质粒组小鼠阴道分泌物Ct IFU检出量仅次于HBsAg-Ct MOMPm 组。
[0130] 结论：
[0131] 应用制备的HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗进行了一系列动物实验，结果证实：
[0132] 1.实验动物针对HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗在血清和阴道分泌物中均产生了 Ct MOMP特异性的保护性抗体。该疫苗免疫后均能够诱导产生Ct特异性CTL杀伤活性，表 明可产生较强的抗Ct的细胞免疫效应。结果表明具有预防和治疗Ct感染的作用。
[0133] 2.实验动物针对HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗在血清中产生了 HBsAg特异性的 抗体。结果表明具有预防HBV感染的作用。
[0134] 3.实验动物针对HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗（尤其是较Ct MOMP多表位DNA 疫苗）产生了显著增强的血清IgG、分泌物SlgA和特异性CTL杀伤活性。结果表明通过制 备嵌合有HBsAg的疫苗可增强Ct MOMP多表位DNA的免疫效应。
[0135] 4.小鼠经HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗接种对E型Ct感染均具有较强的免疫 预防和治疗作用。表明HBsAg-Ct MOMP多表位DNA疫苗免疫对Ct生殖道攻击具有良好的 保护作用，发挥了疫苗的效果。
[0136] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【权利要求】
1. 一种嵌合核酸序列，所述序列由核酸序列（a)连接于核酸序列（b)形成，其中： (a) 编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白且经人源密码子优化修饰的核酸序列； 和 (b) 编码乙肝病毒表面抗原且经人源密码子优化修饰的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID NO :6 所示。
2. 如权利要求1所述的嵌合核酸序列，其特征在于，所述乙肝病毒表面抗原的氨基酸 序列如SEQ ID NO :5所示。
3. 如权利要求1所述的嵌合核酸序列，其特征在于，所述编码乙肝病毒表面抗原的核 酸序列选自：SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :6。
4. 一种重组载体，所述载体包含权利要求1所述的嵌合核酸序列。
5. -种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体。
6. 如权利要求1所述的嵌合核酸序列、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述 的宿主细胞在制备用于预防或治疗乙肝病毒和沙眼衣原体相关疾病的嵌合DNA疫苗中的 用途。
7. -种组合物，其包含有效量的权利要求4所述的重组载体和药学上或免疫学上可接 受的载体、赋形剂或佐剂，其中所述组合物是嵌合DNA疫苗。
8. -种制备权利要求4所述重组载体的方法，所述方法包括： (i) 提供编码沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位蛋白且经人源密码子优化修饰的核酸序 列，以及提供编码乙肝病毒表面抗原且经人源密码子优化修饰的核酸序列，所述核酸序列 如 SEQ ID NO :6 所示； (ii) 连接所述核酸序列，形成嵌合核酸序列； (iii) 将步骤（ii)所得嵌合核酸序列克隆到载体中。
【文档编号】C12N1/19GK104278046SQ201310287578
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月4日 优先权日:2013年7月4日
【发明者】张丽芳, 朱珊丽, 薛向阳, 李文姝 申请人:温州医科大学