用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA以及相关组合物和方法

用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA以及相关组合物和方法
【专利摘要】公开了用于减少肿瘤生长、癌细胞迁移和与EGFR(表皮生长因子受体)和MET(肝细胞生长因子的受体酪氨酸激酶)的失调相关的各种其它癌症病理学(特别是在非小细胞肺癌中)的组合物，例如核酸、载体、细胞、动物模型等。
【专利说明】用于减少肺癌肿瘤发生和化学疗法抗性的MiRNA W及相关 组合物和方法
[0001] 发明人；Carlo M. Croce, Michela Garofalo
[0002] 相关申请的交叉参考
[0003] 本申请要求2011年12月10日提交的美国临时申请61/569, 237的利益，所述美 国临时申请的公开内容通过引用并入本文，用于所有目的。
[0004] 关于联邦政府资助的研究的声明
[0005] 本发明是在国立卫生研究院授予的基金号NO. CA113001下由政府支持进行的。美 国政府具有本发明的某些权利。
[0006] 发明背景
[0007] 不承认本部分公开的【背景技术】在法律上构成现有技术。
[0008] MiRNA通过抑制mRNA翻译或通过促进mRNA降解来抑制基因表达，并被认为是从增 殖至细胞调亡的各种过程的主调控者。miRNA功能的丧失和获得分别通过不同祀基因的上 调和沉默来促成癌症发展。
[0009] 非小细胞肺癌（NSCLC)占所有肺癌病例的约85%。虽然NSCLC是包括不同形态 学和分子亚型的明显异质性的疾病，但表皮生长因子受体巧GFR)和MET(肝细胞生长因子 的受体酪氨酸激酶（RTK))的活化是共同的并且与大鼠肉瘤（RA巧-丝裂原活化蛋白激酶 UERK)和磯酸肌醇-3-激酶（PI3K)-v-akt鼠胸腺瘤病毒癌基因同源物1 (AKT)轴的刺激相 关，所述刺激导致NSCLC细胞增殖、存活和侵袭。
[0010] 酪氨酸激酶抑制剂（TKI)吉非替尼和埃罗替尼有效地祀向患NSCLC个体的EGFR， 但该些治疗剂最终受到赋予药物抗性的突变和其它分子机制的出现的限制。MET蛋白表达 和磯酸化与NSCLC患者对EGFRTKI疗法的原始抗性和获得抗性相关。需要组合物和方法， 例如控制MET表达（作为有效治疗祀），W克服肺癌对该重要类别的药物的抗性。
[0011] 序列表
[0012] 本申请包括，已通过EFS-网提交并且通过引用整体并入本文的序列表。2012年12 月7日创建的ASCII拷贝被命名为604_53534_SEQ_LIST_2012-111. txt，其大小为10,800 字节。
[001引发明概述
[0014] 本发明提供了，包含至少一种选自下列的核酸的组合物；APAF-I的miR-221/222 结合位点的分离的核巧酸154至160(5' -ATGTAGC-3'）；BIM的miR-30b结合位点的分离的 核巧酸288至294(5' -TGTTTACA-3'）；与PKC- e的miR-103结合位点的27至33互补的 分离的核巧酸（互补序列；3' -ACGACG-5'）；与PKC- e的miR-103结合位点的核巧酸1517 至1523互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -ACGACG);与PKC- e的miR-103结合位点的 核巧酸1564至1570互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -ACGACG-5'）；与SRC的miR-203 结合位点的核巧酸656至662互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -UAAAGU-5'）；与SRC的 miR-203结合位点的核巧酸1116至1122互补的分离的核巧酸（互补序列；3'-UAAAGU-5'）； 与SRC的miR-203结合位点的核巧酸1595至1601互补的分离的核巧酸（互补序列： 3' -UAAAGU-5'）；和，与SRC的miR-203结合位点的核巧酸1706至1712互补的分离的核巧 酸（互补序列；3' -UAAAGU-5'）。
[0015] 还提供了包含至少一种选自 5'-ATGTAGC-3' ；5'-TGTTTACA-3' ；3'-ACGACG-5' 和 3'-UAAAGU-5'的核酸的分离的核酸。
[0016] 在本文中还提供了分离的核酸或组合物，所述核酸或组合物还包含选自启动子、 增强子、重复序列、标志物和报道基因的元件。
[0017] 在本文中还提供了分离的核酸，所述核酸是探针、引物、miRNA、质粒、载体、病毒、 细胞或生物。
[001引在本文中还提供了物质组合物，其包含至少一种选自miR-103、miR-203、 抗-miR-30 和抗-miR-221 的 miRo
[0019] 在本文中还提供了物质组合物，其包含至少2种选自miR-103、miR-203、 抗-miR-30 和抗-miR-221 的 miRo
[0020] 在本文中还提供了物质组合物，其包含至少3种选自miR-103 ;miR-203 ; 抗-miR-30 和抗-miR-221 的 miRo
[0021] 在本文中还提供了物质组合物，其包含miR-103、miR-203、抗-miR-30和 抗-miR-221。
[0022] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含化学疗法治疗。
[0023] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含肺癌化学疗法治疗。
[0024] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含表皮生长因子受体巧GFR)抑制剂。
[00巧]在本文中还提供了物质组合物，其还包含酪氨酸激酶抑制剂（TKI)。
[0026] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含选自西妥昔单抗；帕木单抗；扎芦木单 抗；尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
[0027] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含选自吉非替尼；埃罗替尼；拉帕替尼； AP26113和马铃墓駿肤酶抑制剂的小分子。
[0028] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含吉非替尼。
[0029] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含PKC-e表达激动剂。
[0030] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含MET抑制剂。
[0031] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含SU11274。
[0032] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含Dicm?抑制剂。
[0033] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含E-巧粘蛋白表达激动剂。
[0034] 在本文中还提供了物质组合物，其还包含佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受 的组合物。
[00巧]在本文中还提供了被配制用于注射、输注、摄入或跨膜运输的物质组合物。
[0036] 本发明提供了下调哺乳动物细胞的DICER的方法，包括增加miR-103和/或 miR-203在哺乳动物细胞中的可用度（avail油ility)，和下调哺乳动物细胞的DICER。
[0037] 本发明提供了减少哺乳动物癌细胞的迁移的方法，包括增加miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的迁移。
[0038] 本发明提供了减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的EGFR化 学疗法抗性。
[0039] 本发明提供了减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性的方法，包括增加miR-103和 /或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性。
[0040] 本发明提供了减少间充质标志物在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的间充质标 志物的表达。
[0041] 本发明提供了增加E-巧粘蛋白在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的E-巧粘 蛋白的表达。
[0042] 本发明提供了诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充 质-上皮转化。提供了其中通过PKC-e和/或DIffiR诱导间充质-上皮转化的此类方法。
[0043] 本发明提供了诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡的方法，包括增加miR-103 和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡。
[0044] 本发明提供了下调哺乳动物癌细胞的AKT/E服的方法，包括增加miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
[0045] 本发明提供了增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性的方法，包括增加miR-103 和/或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性。
[0046] 提供了其中癌细胞是肺癌细胞的此类方法。
[0047] 提供了其中癌细胞是非小细胞肺腺癌细胞的此类方法。
[0048] 提供了其中癌细胞是表皮癌细胞的此类方法。
[0049] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用 抑制肿瘤生长量的至少一种核酸，所述核酸选自；APAF-I的miR-221/222结合位点的分离 的核巧酸154至160(5' -ATGTAGC-3'）；BIM的miR-30b结合位点的分离的核巧酸288至 294巧'-TGTTTACA-3'）；与PKC-e的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核巧酸（互 补序列；3'-ACGACG-5'）；与PKC-e的miR-103结合位点的核巧酸1517至1523互补的分离 的核巧酸（互补序列；3' -ACGACG);与PKC- e的miR-103结合位点的核巧酸1564至1570 互补的分离的核巧酸（互补序列；3'-ACGACG-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核巧酸656 至662互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核 巧酸1116至1122互补的分离的核巧酸（互补序列；3'-UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合 位点的核巧酸1595至1601互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -UAAAGU-5'）；和，与SRC的 miR-203结合位点的核巧酸1706至1712互补的分离的核巧酸（互补序列；3' -UAAAGU-5'）。
[0050] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑 制肿瘤生长的量的选自 5' -ATGTAGC-3'、5' -TGTTTACA-3'、3' -ACGACG-5' 和 3' -UAAAGU-5' 的核酸。
[0051] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑 制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miRo
[0052] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑 制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miRo
[0053] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑 制肿瘤生长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miRo
[0054] 本发明提供了抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑 制肿瘤生长的量的miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221。
[00巧]本发明提供了还包括施用化学疗法治疗的此类方法。
[0056] 本发明提供了还包括施用肺癌化学疗法治疗的此类方法。
[0057] 本发明提供了还包括施用表皮生长因子受体巧GFR)抑制剂的此类方法。
[0058] 本发明提供了还包括施用酪氨酸激酶抑制剂（TKI)的此类方法。
[0059] 本发明提供了还包括施用选自西妥昔单抗、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗和 马妥珠单抗的单克隆抗体的此类方法。
[0060] 本发明提供了还包括施用选自吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、AP26113和马铃墓 駿肤酶抑制剂的小分子的此类方法。
[0061] 本发明提供了还包括施用吉非替尼的此类方法。
[0062] 本发明提供了还包括施用PKC-e表达激动剂的此类方法。
[006引本发明提供了还包括施用MET抑制剂的此类方法。
[0064] 本发明提供了还包括施用SU11274的此类方法。
[0065] 本发明提供了还包括施用Dicm?抑制剂的此类方法。
[0066] 本发明提供了还包括施用E-巧粘蛋白表达激动剂的此类方法。
[0067] 本发明提供了还包括施用佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受的组合物的此类 方法。
[0068] 本发明提供了其中施用是通过注射、输注、摄入或跨膜运输进行的此类方法。
[0069] 本发明提供了其中肿瘤是肺肿瘤的此类方法。
[0070] 本发明提供了其中肿瘤是肺癌的此类方法。
[0071] 本发明提供了其中肿瘤是肺腺癌的此类方法。
[0072] 本发明提供了其中肿瘤是非小细胞肺癌的此类方法。
[0073] 本发明提供了其中肿瘤生长相较于对照减少至少10%、至少20%、至少30%、至 少40%、至少50%和至少60%的此类方法。
[0074] 本发明提供了促进需要伤口愈合促进的哺乳动物的伤口愈合的方法，包括施用促 进伤口愈合的量的本文中的组合物。
[00巧]本发明提供了包括本文中的组合物的试剂盒。
[0076] 本发明提供了包含本文中的组合物的细胞。
[0077] 本发明提供了包含本文中的组合物的小鼠。
[0078] 当结合附图阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有 利方面对于本领域技术人员将变得显然。
[0079] 附图概述
[0080] 本专利或申请文件包含一个或多个W彩色绘制的附图和/或一张或多张照片。具 有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝可应要求和支付必要的费用后 由美国专利和商标局提供。
[0081] 图 1A-1J. TKI-调节的 miRNA 祀。
[0082] 图I A. EGFR和MET沉默后EGFR和MET的蛋白和mRNA的下调。
[0083] 图 1B. EGFR (ShEGFR)、MET (ShMET)或 ShCtr (混杂 RNA)敲低后 Calu-I 细胞中的无 监督层次聚类分析。CTR，对照。P<0.05。
[0084] 图1C.受ShEGFR和ShMET调控的miRNA的交叉。
[0085] 图1D.显不在shMET后失调的miRNA的No;rthe;rn印迹。snRNA U6,上样对照。
[0086] 图化蛮光素酶报告测定显示11111?歴与？服〔6任1((：-〇、8贿、4?4。1和 B化2L11 @IM)的3' UTR之间的直接相互作用。仅在SRC中，1，595-1，601nt上的位点参与 与miR-203的结合；1，706-1，712nt上的位点的缺失不能搔救蛮光素酶活性（图8)。WT，野 生型；MUT，突变的；scr，混杂的。
[0087] 图 1F. -组 NS化C 细胞中 miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c与祀蛋白之间的反相关。
[0088] 图 lG.miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 的过表达减少 APAF-I 和 BIM 蛋白的 浓度。
[0089] 图1比miR-103和miR-203的过表达减少PKC- e和SRC蛋白的浓度。
[0090] 图 II. miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 的抑制剂增加 APAF-I 和 BIM 表达。
[0091] 图1J. ShMET诱导APAF-I和BIM的上调W及SRC和PKC- e的下调。结果代表至 少3个独立实验。误差棒，±s. d冲<0. 001，*冲<0. 05,通过双尾学生氏t检验。
[0092] 图 2A-2D. MET-miRNA 共表达分析。
[0093] 图 2A.通过 ISH 分析 110 个肺癌组织的 miR-103、miR-222、miR-203 和 miR-30c 表 达，随后通过I肥分析MET。首行显示miR-103信号（蓝色）、MET信号（红色）和混合信 号，其中英光黄显示HiiRNA和蛋白共表达；在MET表达存在的情况下不存在miR-103。在相 同癌症的连续切片中（在第二行中），显示了 miR-222、MET图像W及miR-222和MET的共 表达。许多对于miR-222是阳性的癌细胞也表达MET (黄色）。左图框中的箭头（在第H行 中）指向表达miR-203 (蓝色）但不表达MET的良性基质细胞。第H行中的其它图像显示 MET信号（红色）和混合信号。第四行中的左边图像中的箭头指向对于miR-30c是阳性的 癌细胞。每一行中的右边图像显示ISH或MC反应的RGB图像。
[0094] 图2B.显示40个肺癌个体的miRNA表达的箱型图。使用截止值为0. 5炒的 轮函数，将实时PCR用于将肿瘤分成两组，低EGFR-MET和高EGFR-MET。冲<0. OOOl，通过学 生氏t检验。
[0095] 图2C.显示MET与miR-103之间和MET与miR-203之间的反相关的XY散布图。
[0096] 图2D.对40个肺肿瘤组织的MET和EGFR 1肥。显示了来自17个表达MET和EGFR 的转移性肿瘤的一个代表性病例。大的绿色箭头指向肿瘤细胞，小的黑色箭头指向基质。比 例尺，100 U m。
[0097] 图 3A-3D.吉非替尼下调 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c。
[0098] 图3A.用递增浓度的吉非替尼处理化lu-1、A549、PC9和肥C827细胞。2化后测 量相对于未处理的对照的细胞活力。每一个数据点代表5个孔的平均值±s. d.。
[0099] 图3B.显示在用5 U M或10 U M吉非替尼处理后miR-30b、miR-30c、miR-221和 miR-222仅在PC9和肥C827吉非替尼-敏感性细胞中下调但不在化Iu-I和A549抗吉非替 尼细胞中下调的qRT-PCR。NT，未处理的细胞。
[0100] 图3C.用5uM或IOyM吉非替尼处理PC9、Calu-l和肥C827细胞2化。仅在肥C827 和PC9吉非替尼-敏感性细胞中但未在化Iu-I抗吉非替尼细胞中观察到BIM和APAF-I表 达的增加和E服磯酸化的减少。目-肌动蛋白用作上样对照。
[0101] 图 3D.显示 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 的表达在暴露于 IOy M 吉非替 尼2化的肥C827GR和PC9GR细胞（具有获得性吉非替尼抗性的细胞）中不减少的qRT-PCR。 所有定量数据从最少3个重复实验产生。误差棒，± S. d。双尾学生氏t检验用于测定P值。 冲<0. 001，*冲<0. 05。
[0102] 图 4A-4F. miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222、miR-103 和 miR-203 调节吉非替 尼敏感性。
[010引图4A.用递增浓度的吉非替尼处理亲代细胞和它们的抗性肥C827GR Q27Q16和 PC9GR W及化Iu-I克隆细胞。每一个数据点代表6个孔的平均值±s. d。
[0104] 图4B.显示A549细胞中BIM和APAF-I过表达后和用吉非替尼（15 uM)处理后吉 非替尼诱导的切割的PARP片段的增加的western印迹。EV，空病毒。
[010引 图4C.肥C827和PC9细胞中BIM(SiBAM)和APAF-I (SiAPAF-I)的沉默减小对吉非 替尼的响应。
[0106] 图40.对1111尺-3013、1111尺-30。、1111尺-221和1111尺-222不敏感的6加和4口4尸-1互补0臟 的过表达诱导A549细胞的吉非替尼敏感性。SiScr, SRC siRNA。
[0107] 图4E-4F. miR-103和miR-203的过表达W及miR-30c和miR-222的沉默增加吉非 替尼体内敏感性。用稳定地感染了对照miRNAktr)、miR-30c或miR-221的抑制剂W及感 染了 miR-103和miR-203或空病毒（作为对照）的A549细胞注射的裸小鼠中植入的肿瘤 的生长曲线（图4D)和植入的肿瘤的比较（图4F)。图像显示来自每一个类别的5个肿瘤 中的平均尺寸的肿瘤。在图4A和图4A-4D中，误差棒±s. d.，冲<0. 001、*冲<0. 05,通过双 尾学生氏t检验。Gef,吉非替尼。
[0108] 图5A-5C. MiR-103和miR-203抑制NS化C的迁移和增殖。
[0109] 图5A.迁移通过过滤器的并且用结晶紫染色的细胞的代表性图像。比例尺， 40 ym。结果为平均值±s. do n = 3个实验。冲<0.001。
[0110] 图地.在用移液器尖头产生创伤后化和2化，用miR-103、miR-203或对照 miRNA(Scr miR)转染的A549细胞的汇合单层的刮伤区域的代表性照片。比例尺，500ym。 冲<0. 00001、*冲<0. 001，相对于混杂miRNA转染的细胞。
[0111] 图5。用对照11111?歴、11111?-103(103)、11111?-203(203)、对照311?歴6^311?歴）^及 PKC- e (SiPKC- O和SRC(SiSRC)的SiRNA转染的Calu-I和A549细胞的流式细胞术分布。 miR-203对细胞周期的影响略强于miR-103的影响，如通过GO-Gl相与S相之间的比率评估 的。所有定量值显示平均值±s.d。n = 5。将双尾学生氏t检验用于测定G0-G1:S比率的 P值。冲<0. OOOOl和*冲<0. 005,相较于混杂miRNA。
[011引图6A-6H. MET诱导上皮-间充质转化。
[011引 图6A. MET敲低后化Iu-I细胞的形态学变化。比例尺，20 ym。
[0114] 图她.Snail、波形蛋白和N-巧粘蛋白在化Iu-IshCtr细胞和化Iu-IshMET细胞中 的免疫英光。Snail表达在化Iu-IshCtr细胞中很强并且存在于细胞核中，在化Iu-IshMET 细胞中较弱并且存在于细胞质中。比例尺寸，20 ym。
[0115] 图6C.显示在MET敲低后，化Iu-I细胞的纤连蛋白、波形蛋白和Snail下调W及 E-巧粘蛋白上调的Western印迹。上样对照，GAPDH。
[0116] 图抓.显示Calu-IshCtr细胞和Calu-IshMET细胞的上皮和间充质标志物的表达 的 qRT-PCR。
[0117] 图犯.显示在miR-103或miR-203过表达后，Calu-I细胞的纤连蛋白、Snail和波 形蛋白表达减少的免疫英光。比例尺，20ym。CtrmiR,对照miRNA。
[0118] 图6F.显示在miR-103或miR-203加强表达后，化Iu-I细胞的增加的E-巧粘蛋 白信号的免疫英光。比例尺，40 ym。
[0119] 图6G.显示在miR-103或miR-203过表达后，间充质标志物的下调的免疫印迹。
[0120] 图細.其中MET下调miR-103和miR-203的模型，所述下调反过来上调PKC- e、 Dicer和SRC,从而诱导吉非替尼抗性和上皮-间充质转化。MET还诱导miR-30b、miR-30c、 miR-221、miR-222和miR-21上调，和从而通过BIM、APAF-1和PTEN下调诱导吉非替尼抗性。 EGFR增加miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c表达。红色显示的是上调的miRNA，绿色 显示的是下调的miRNA。结果代表至少4个独立实验。P值，双尾学生氏t检验。误差棒， ± S. d.。
[012U 图7A-7B. MicroRNA在稳定的EGFR和MET沉默后失调。
[012引 图7A.显示了在EGFR (表1)和MET (表2)沉默后失调的、具有1. 5倍巧GFR)和 1. 7倍（MET)变化的MicroRNA(P<0. 05)。绿色=下调的miR ;红色=上调的miR。
[0123] 图 7B.显示 MET 和 EGFR 沉默后 miR-221/miR-222 和-30b/c 下调 W及 MET 沉默 后miR-103和-203上调的qRT-PCR。数据为3个独立实验的平均值±s.d.。冲<0.001， *冲<0. 0001。
[0124] 图 8A-8D. miR-221/miR-222、miR-30b-c、miR-103 和 miR-203 的预测的祀。
[01 巧]图 8A. APAF-13' UTR 提供了一个 miR-221/miR-222 结合位点（核巧酸 154-160(SEQ ID N0:38)) ;BIM 提供了一个 miR-30b/c 结合位点（nt288-294(SEQ ID N0:42)) ;PKC-e 提供了 3 个 miR-103 结合位点（nt27-33(SEQ ID N0:39)、1517-1523(SEQ ID N0:40)、 1564-1570(SEQ ID N0:41)) ;SRC3'UTR 提供了 4 个 miR-203 结合位点（nt656-662(SEQ ID N0:43)、1116-1122(SEQ ID N0:44)、1595-1601(沈Q ID N0:45)、1706-1712(SEQ ID N0:46))。在图中，显示了种子区域与 3' UTR(miR-221 和 miR-222 与 APAF-1、miR-30b/c 与 BIM、miR-103与PKC- e W及miR-203与SRClI)的比对。祀诱变的位点W绿色显示；=缺 失的核巧酸。分别扩增APAF-I和BIM的3'UTR的370和34化P。产生PKC-e的3个不同 构建体（27-33 化P = 385)、1517-1570 化P = 496)、27-1570 化P = 1720))和 SRC 的 2 个不 同构建体化56-1122 (bp = 705)、1595-1712 化P = 805))。BS =结合位点。
[0126] 图8B. -组7种NS化C细胞的Western印迹。蛋白质丰度报告为针对目-肌动蛋 白表达标准化的western印迹光密度。
[0127] 图 8C.显示一组 NS化C 细胞中 miR-103、miR-203 相较于 miR-221/miR-222、 miR-30b/c相对表达水平的低表达的qRT-PCR。
[012引图8D.通过使用皮尔逊相关系数（r)和各自的P值（全部显著，P<0. 01)在统计上 计算 7 种 NS化C 细胞中 miR-103、miR-203、miR-30b/c、miR-221/miR-222 与 PKC- e、SRC、BIM 和APAF-ImRNA之间的关联性。皮尔逊相关性显示在所有分析的细胞中miR-103、miR-203、 miR-30c、miR-222与PKC-S、SRC、BIM和APAF-ImRNA之间反相关。结果代表至少3个独立 实验。误差棒描述±s. do
[0129] 图 9A-9B. miR-221/miR-222、miR-30b/c、miR-103、miR-203 祀向 APAF-1、BIM、 PKC-H 和 SRC。
[0130] 图 9A.用 miR-221/miR-222 和 miR-30b/c 转染的 Calu-IMET-邸细胞显示 APAF-I 和BIM蛋白水平的降低。
[01引]图9B.相反地，抗-miR-103和miR-203分别增加PKC- e和SRC的表达。Scr =混 杂的。结果代表至少3个独立实验。
[0132] 图 10A-10B. miR-103-PKC- e、miR-222-APAF-l、miR-203-SRC 和 miR-30c-BIM 共表 达分析。
[0133] 图 10A.通过 I甜分析 110 个肺癌组织的 miR-103、miR-222、miR-203、miR-30c 表 达W及通过I肥分析PKC- e、APAF-I、SRC和BIM。首行，从左边开始，miR-103 (蓝色）和 PKC-H(红色）结果显示该肺癌中miRNA的弱信号和蛋白质的强信号。图像的混合（第H个 图框）未显示否则将呈现为黄色的两个祀的共表达；注意PKC- e信号（红色）定位至癌细 胞的巢（箭头）。第二行，左图框是强miR-222信号和癌细胞（大箭头，第二个图框）但非周 围良性基质细胞（小箭头）的假定的祀APAF-I的弱信号。第H个图框未显示可检测的共表 达。第H行，左图框为miR-203 (蓝色），接下来是SRC信号（红色）和混合信号；注意不存 在miR-203与SRC的共表达。在右图框中，添加复染剂苏木精作为英光湖绿（fluorescent turquoise)。该允许人们看见癌细胞（大箭头）而非良性促结缔组织增生细胞（小箭头） 正在表达SRC。最后一行，左图框为miR-30c信号（蓝色），接下来BIM(红色）和合并的图 像，其中不存在黄色表明不存在两个祀的共表达。右图框显示基于常规颜色的图像（RGB = 红色、绿色、蓝色）。标尺表示100化。
[0134] 图10B.显示110个肺肿瘤中的microRNA与蛋白质祀表达之间的反相关的表。
[013引 图1IA-11E. MET在转移性肺肿瘤组织中过表达。
[0136] 图11A.报导了在110个分析的肿瘤样品中观察到的MET和miR-30c、miR-103、 miR-203、miR-222表达的百分比的表。在大部分肿瘤样本中，miR-103和miR-203与MET表 达反相关并且miR30c和miR-222与MET表达正相关。
[0137] 图11B.表达MET的转移性和非转移性肺肿瘤样品的百分比。MET在转移性肿瘤中 相较于肺非转移性组织过表达。P = 0.021，通过Fisher精确检验。
[013引 图11C.通过轮函数，利用0. 5 O^eitaw)的截止值通过qRT-pcR将40个肺肿瘤分 成"高"和"低"EGFR和MET表达。
[0139] 图11D.显示EGFR和MET的1肥分析与qRT-PCR结果之间的关系的2x2列联表。 P<0. 0001，通过Fisher精确检验。
[0140] 图11E.显示40个肺癌中表达MET和EGFR的转移性肿瘤的数目的表。注意转移灶 与MET但非EGFR表达水平之间的正相关。MET、P = 0.026 ;EGFR、P =不显著，通过Fisher 精确检验。
[01川 图124-128.口〔96尺和肥〔8276尺细胞的4口4尸-1和6加表达。用5或10111吉非替 尼处理肥C827GR细胞（图12A)和PC9GR细胞（图12B)，进行2化。由于miR-221/miR-222 和miR-30b/c的表达未改变，APAF-I和BIM表达W及E服磯酸化在吉非替尼处理后未发生 改变。B-肌动蛋白用作上样对照。
[0142] 图 13A-13C. miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222 参与吉非替尼诱导的细胞调亡。
[0143] 图 13A. miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222 的增强的表达增加肥C827 和 PC9 敏 感性细胞对吉非替尼诱导的细胞调亡的抗性，如通过脫天蛋白酶3/7测定评估的。
[0144] 图 13B.miR-30b、miR-30c、miR-221、miR-222 敲低增加具有从头（Calu-I)和获得 的（肥C827GR和PC9GR)对TKI的抗性的NS化C细胞的吉非替尼敏感性。
[014引 图 13C.用 miR-30b/c、miR-221/miR-222 W及 APAF-I 和 BIM cDNA(其后是它们的 包含WT或突变的miRNA结合位点的3' UTR)共转染A549。通过MTS测定，miR-30b/c-和 miR-221/miR-222-不敏感的BIM和APAF-lcDNA的过表达诱导A549细胞的吉非替尼敏感 性。所有实验进行至少3次，结果基本上一致。显示了 3个独立实验的一个代表。双尾学 生氏t检验用于测定P值。误差棒描述±s.d。冲<0.001，*冲<0.05。
[0146] 图 14A-14D. MET 的抑制诱导 miR-30b-c 和 miR-221/miR-222 的下调。
[0147] 图 14A.显示在用 SU11274 处理 Calu-I 细胞后 miR-30b/c 和 miR-221/miR-222 的 下调的qRT-PCR。用MET抑制剂W 1和3 y M的浓度处理细胞24、48和72小时。如本文中 所述，进行RNA提取和qRT-PCR。显示了来自3个不同实验的结果。
[0148] 图14B.显示在MET邸后A549细胞中的miR-30c和miR-222下调的Nodhern印 迹。SnRNA U6用作上样对照。
[0149] 图14C.用MET抑制剂SU11274处理化Iu-I细胞。24小时后，将细胞暴露于吉非 替尼巧-10-10-20) y M)，进行2化。MET的抑制增加Caluu-I对药物的敏感性，如通过MTS 测定评估的。
[0150] 图14D.用吉非替尼巧-10-15-20 iiM)处理2化的Calu-I-MET敲低细胞 (化Iu-MET-KD)对吉非替尼更敏感，如通过脫天蛋白酶3/7测定评估的。W-式H份进行实 验3次。误差棒代表标准差。双尾t检验用于测定所有P值。冲<0.001。
[015。 图15A-15B. EGFR和MET调节的miRNA参与吉非替尼抗性。显示在用5和10 UM吉 非替尼处理后，miR-21、miR-29a、miR-29c和miR-100在肥C827和PC9中但不在肥C827GR 和PC9GR细胞中下调的qRT_PCT。相对值显示为平均值和±s. d。双尾学生氏t检验用于 测定 P 值。冲<0.005，*冲<0.001。
[0152]图 16A-她.11111?-21、11111?-293八、11111?-100参与吉非替尼-诱导的细胞调亡。11111?-21、 miR-29a/c、miR-100的加强表达增强暴露于10 y M吉非替尼24小时的肥C827细胞的（图 16A)和PC9细胞（图16B)的细胞活力并减少脫天蛋白酶3/7活性。显示了 3个独立实验 的一个代表。相对值显示为平均值和±s.d。双尾学生氏t检验用于测定P值。
[015引图17A-17B.miR-21的敲低增加吉非替尼敏感性。
[0154] 图17A.A549、肥C827GR和PC9GR细胞中通过抗-miR寡核巧酸产生的miR-21沉默 减弱细胞活力，如通过MTS测定评估的，和图17B，在吉非替尼处理（10 y M) 24小时后，增加 细胞死亡，如通过脫天蛋白酶3/7测定评估的。误差棒描述s.d。报告了来自至少3个独立 实验的结果。冲<0. 05, *冲<0. 001，通过双尾学生氏t检验。
[015引 图 18A-18B.MET 抑制剂 SU11274 诱导 miR-103 和 miR-203 上调。将 Calu-I 细 胞暴露于不同的SU11274浓度（1和3uM)l，进行24、48和72小时。如本文中所述，通过 qRT-PCR评估miR-103和miR-203表达水平。结果代表至少3个独立实验。误差棒描述 ±s. d。冲<0. 001，*冲<0. 05。
[0156] 图19A-1犯.PKC- e和SRC的敲低诱导吉非替尼敏感性。
[0157] 图19A. A549细胞的miR-103、miR203的加强表达抑制AKT/E服途径。目-肌动蛋 白水平用作上样对照。显示了3个独立实验的一个代表。
[015引图19B.化Iu-I细胞的miR-103、miR-203过表达诱导吉非替尼敏感性，如通过脫天 蛋白酶3/7和MT测定评估的。结果代表至少4个独立的实验。
[015引 图19C.在敲低PKC-H和SRC，随后用吉非替尼处理（10iiM、15yM)24小时后， 化Iu-I细胞的活力和脫天蛋白酶3/7测定。
[0160] 图19D.显示相较于亲代肥C827细胞的具有MET扩增的肥C827GR细胞的减少的 miR-103 和 miR-203 的表达的 qRT-PCT。
[016。 图1犯.显示相较于亲代肥C837吉非替尼敏感性细胞的具有MET扩增的肥C827GR 的增加的PKC-e和SRC的表达的Western印迹。W-式H份进行实验H次。误差棒表示 ±s. do通过学生氏t检验测定P值。冲<0.005。
[016引 图 20A-20B. miR-103、miR-203、miR-221、miR-30c 的体内作用。
[0163] 图20A.利用稳定转染了空病毒、miR-103、miR-203 W及抗-Ctr、抗-221、抗-30c 的A549细胞注射的裸小鼠的肿瘤异种移植物的比较。注射后35天和用媒介物（0. 1 % tweenSO)或吉非替尼（200mg/kg)处理后，处死小鼠。图像显示来自每一个类别的5只小鼠 中的一只小鼠。
[0164] 图20B.显示肿瘤异种移植物的miR-103、miR-203上调和miR-30c、miR-221下调 的qRT-PCR。数据表示为±s. do冲<0. 001。
[016引 图 21A-21C. miR-103 和 miR-203 过表达诱导 MET。
[0166] 图21A.显示在miR-103和miR-203加强表达后Twist和N-巧粘蛋白下调的免疫 英光。
[0167] 图 21B-21C.在 Calu-I 细胞的 miR-103 和 miR-203 加强表达 W及 PKC- e 和 SRC 沉默后的qRT-PCR。miR-103、miR-203的过表达W及PKC- e、SRC的敲低诱导间充质标志物 的减少和E-巧粘蛋白mRNA表达水平的升高。误差棒描述s.d。报告了来自至少3个独立 实验的结果。冲<0.001，*冲<0.05。
[0168] 图22A-22E. DIC邸沉默促进NSCLC的吉非替尼敏感性和MET。
[0169] 图22A.在化Iu-I细胞中在MET稳定地敲低后和miR-103加强表达后DICER下调。
[0170] 图 22B.在用 IOOnM DICER SiRNA 转染 Calu-I 和 A549 细胞后 DICER 的下调。
[0171] 图22C. DICER的敲低减少化Iu-I和A549细胞的细胞迁移。照片显示通过测量 595nm处的吸光度而定量的迁移通过transwell的细胞的绝对数目。
[0172] 图22D.显示Dicm?沉默如何增加对吉非替尼诱导的细胞调亡的敏感性的MTS和 脫天蛋白酶3/7测定。结果代表至少3个独立实验。
[0173] 图22E.显示DICER耗尽通过调节间充质和上皮标志物的表达影响间充质-上皮 转化（MET)的qRT-PCR。误差棒描述C和d中4个独立实验的± S. d.。冲<0. 005, *冲<0. 05。
[0174] 图23.临床表1-110个肺癌样本的PKC- e、SRC、APAF-I和BIM蛋白的体内检测。
[0175] 图24.临床表2-40个具有注释的临床历史的独立肺肿瘤。
[0176] 详述
[0177] 在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明 书。该些出版物、专利和公布的专利说明书的公开内容通过引用并入本公开内容W更全面 地描述本发明所属领域的技术水平。
[0178] 本发明至少部分地基于该样的研究发现；EGF和MET受体，通过调节特定miRNA，控 制吉非替尼诱导的细胞调亡和NSCLC肿瘤发生。本文中鉴定了代表NSCLC的致癌信号转导 网络的受EGF-和MET-受体调节的miRNA。
[0179] 如本文中可互换使用的，"miR基因产物"、"microRNA"、"miR"或"miRNA"是指来 自miR基因的未加工的或加工的RNA转录物。由于miR基因产物不被翻译成蛋白质，因 此，术语"miR基因产物"不包括蛋白质。未加工的miR基因转录物也称为"miR前体"，并 且通常包括长度约70-100个核巧酸的RNA转录物。miR前体通过用RNA酶（例如，DICER、 Argonaut、RNA酶III，例如大肠杆菌巧.coli)RNA酶III)消化而被加工成19-25个核巧酸 的活性RNA分子。该19-25个核巧酸的活性RNA分子也称为"加工的"miR基因转录物或" 成熟"miRNA。
[0180] 有活性的19-25个核巧酸的RNA分子可通过天然加工途径（例如，使用完整细 胞或细胞裂解物）或通过合成加工途径（例如，使用分离的加工酶例如分离的DICER、 Argonaut或RNA酶III)从miR前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活 性的19-25个核巧酸的RNA分子，而不必从miR前体加工获得。当在本文中通过名称提及 microRNA时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。
[0181] 如本文中所述，"受试者"可W是患有或怀疑患有癌症的任何哺乳动物。在优选实 施方案中，受试者是患有或怀疑患有癌症的人。
[0182] 可在获自受试者的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如， 可通过常规活组织检查技术从怀疑患有癌症的受试者取出组织样品。在另一个实施方案 中，可从受试者取出血液样品，可通过标准技术分离白细胞W用于DNA提取。优选在开始放 射疗法、化学疗法或其它治疗性治疗之前，从受试者获得血液或组织样品。对应的对照组织 或血液样品或对照参照样品可获自受试者的未患病组织，获自正常人个体或正常个体的群 体，或获自对应于受试者样品中的大部分细胞的培养细胞。随后将对照组织或血液样品与 来自受试者的样品一起处理，W便可将受试者样品的细胞中从给定的miR基因产生的miR 基因产物的水平与来自对照样品的细胞的对应miR基因产物水平相比较。或者，可获得参 照样品并且将其与测试样品分开地（例如，在不同时间）进行处理，可将测试样品的细胞中 从给定的miR基因产生的miR基因产物的水平与参照样品的对应miR基因产物水平相比 较。
[0183] 样品的miR基因产物的水平可使用适合用于检测生物样品的RNA表达水平的任何 技术来测量。用于测定生物样品（例如，细胞、组织）中的RNA表达水平的适当技术（例如， Ncxrthern印迹分析、RT-PCR、原位杂交）对于本领域技术人员来说是公知的。在特定的实施 方案中，使用Ncxrthern印迹分析检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可通过在核酸 提取缓冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离也来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸， 然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电 泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使 用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.,第 2 片反，Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989, Qiapter7,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0184] 用于给定的miR基因产物的Nodhern印迹杂交的适当探针（例如，DNA探针、RNA 探针）可从本文中提供的核酸序列产生，并且包括但不限于，与目标miR基因产物具有至少 约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的互补性的探针，^及与目标11111?基因产 物完全互补的探针。用于制备标记的DNA和RNA探针的方法W及用于其与祀核巧酸序列的 杂交的条件描述于 Molecular Cloning = A L 油 oratory Manual, J. Sambrook 等人，eds.,第 2 版，Cold Spring Harbor L 油 oratory Press, 1989, QiapterslO 和 11,其公开内容通过引 用合并入本文。
[018引例如，可用例如放射性核素例如巧、3申、3申、"C或35S ;重金属；能够用作已标记的 配体的特异性结合对成员的配体（例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体）；英光分子；化学 发光分子；酶等来标记核酸探针。
[018引 可通过化gby 等人（1977)，J. Mol. Biol. 113:237-251 的切口平移法或 Fienberg 等人（1983) ,Anal. Biochem. 132:6-13的随机引物法（其全部公开内容通过引用合并入本 文）将探针标记至高比放射性（specific activity)。后者是选择用于从单链DNA或从RNA 模板合成高比放射性的32P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移法通过用高放射性的 核巧酸置换预先存在的核巧酸，可能制备具有大大超过IO 8Cpm/微克的比放射性的32P-标 记的核酸探针。
[0187] 然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂 交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了 miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方 法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences, Piscataway, NJ获得的 Molecular Dynamics400-B2D Phosphorimager 定量 miR 基因转录物水平。
[018引当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例 如dTTP类似物5- (N- (N-生物素基-e -氨基己醜基）-3-氨基帰丙基）脱氧尿巧H磯酸惨 入探针分子。可通过与结合生物素的蛋白质例如偶联至英光染料或产生颜色反应的酶的抗 生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体（例如抗生物素抗体）反应来检测生物素化的探针 寡核巧酸。
[0189] 除了 Nodhern和其他RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的 水平。该技术需要比Nodhern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片 上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸（例如，CDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的 核酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活组织检查样品。原位杂交技术的 实施在美国专利5, 427, 916 (其全部公开内容通过引用合并入本文）中进行了更详细的描 述。用于给定的miR基因产物的原位杂交的适当探针可从本文中提供的核酸序列产生，并 且包括但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98% 或99%的互补性的探针，W及与目标miR基因产物完全互补的探针，如上文中描述的。
[0190] 细胞中miR基因转录物的相对数目还可通过对miR基因转录物进行逆转录，然后 通过聚合酶链式反应（RT-PCR)扩增经逆转录的转录物来进行测定。可通过与内部标准例 如来自存在于相同样品中的"持家"基因的mRNA的水平相比较来定量miR基因转录物的 水平。用作内部标准的合适的"持家"基因包括例如，肌球蛋白或甘油酵-3-磯酸脱氨酶 (G3PDH)。用于进行定量和半定量RT-PCR的方法W及其变型对于本领域技术人员来说是公 知的。
[0191] 在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同miR基因产物的表达水平。在 其他情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知miR基因的转录物的表达水平。评估数 百种miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平非常费时并且需要大量的总RNA (例如，对 于每一个Nodhern印迹需要至少20 y g)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
[0192] 为了克服该些限制，可构建W微芯片形式（即，微阵列）存在的寡核巧酸文库，该 文库包含特异于一组miR基因的一组寡核巧酸（例如，寡脱氧核巧酸）探针。使用该微阵 列，可通过逆转录RNA W产生一组祀寡脱氧核巧酸，将它们与微阵列上的探针（寡核巧酸） 杂交W产生杂交或表达特征谱来测定生物样品中多个microRNA的表达水平。然后将受试 样品的杂交谱与对照样品的杂交谱比较，从而确定在肺癌转移和/或复发细胞中具有改变 的表达水平的microRNA。如本文中所使用的，"探针寡核巧酸"或"探针寡脱氧核巧酸"是指 能够与祀寡核巧酸杂交的寡核巧酸。"祀寡核巧酸"或"祀寡脱氧核巧酸"是指待检测（例 女口，通过杂交）的分子。"miR-特异性探针寡核巧酸"或"特异于miR的探针寡核巧酸"是 指具有选择用于与特定miR基因产物或特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡 核巧酸。
[0193] 特定样品的"表达特征谱"或"杂交特征谱"本质上是样品的状态指纹；虽然两种 状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是 独特的基因表达特征谱。目P，正常组织可与癌细胞相区别，并且在癌细胞类型内，可确定不 同的预后状态（例如，良好的或不良的长期存活希望）。通过比较不同状态的细胞的表达特 征谱，获得关于在该些状态的每一个状态中为重要的（包括基因的上调或下调）基因的信 息。在癌细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴定W及导致不同预后结果的差异表达允许 W许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案（例如，确定化疗药物是否改善特定 患者的长期预后）。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确认诊 断。此外，该些基因表达特征谱（或个体基因）允许筛选抑制miR或疾病表达特征谱或将 不良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。
[0194] 可从基因特异性寡核巧酸探针（所述探针从已知的miRNA序列产生）制备微阵 列。对于各miRNA，阵列可包含两种不同的寡核巧酸探针，一种探针包含活性成熟序列，而另 一种探针特异于HiiRNA的前体。阵列还可包含可用作杂交严格条件的对照的对照，例如与 人直系同源物只相异于少数几个碱基的一个或多个小鼠序列。还可将来自两个物种的tRNA 或其它RNA(例如，rRNA、mRNA)印制在微芯片上，从而为特异性杂交提供内部的、相对稳定 的阳性对照。还可将用于非特异性杂交的一个或多个合适的对照包含在微芯片上。为了该 目的，基于与任何已知的HiiRNA不存在任何同源性选择序列。
[0195] 可使用本领域内已知的技术制备微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如 40个核巧酸的探针寡核巧酸进行5' -胺修饰，并且使用可商购获得的微阵列系统例如 GeneMachine 0mniGrid?100Mic;roarraye;r 和 Amersham CodeLink? 活化的载玻片进行印 巧Ij。通过用标记的引物逆转录祀RNA来制备相应于祀RNA的标记的CDNA寡聚物。在第一 链合成后，使RNA/DNA杂交物变性W降解RNA模板。然后将所制备的标记的祀CDNA在杂交 条件（例如在25°C下于6X SSPE/30%甲醜胺中进行18小时，然后在37°C下于0. 75X TNT 中清洗40分钟）下与微阵列芯片杂交。在阵列上的其中固定的探针DM识别样品中的互 补祀CDNA的位置上，发生杂交。标记的祀CDNA标记阵列上的其中发生结合的确切位置，从 而允许自动检测和定量。输出信号由一列杂交事件组成，其标示了特定CDNA序列的相对丰 度，从而标示了患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的CDNA 寡聚物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素 蛋白-Alexa647缀合物直接检测包含生物素的转录物来处理微阵列，和使用常规扫描方法 扫描微阵列。阵列上的各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
[0196] 使用阵列对于miRNA表达的检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点上鉴 定相同样品中的数百个基因的整体表达。第二，通过寡核巧酸探针的仔细设计，可鉴定成 熟分子和前体分子的表达。第H，与Nodhern印迹分析相比，芯片需要少量RNA，并且使用 2.5yg总RNA可提供可重现的结果。数目相对有限的miRNA(每物种数百个）允许对数个 物种构建共同的微阵列，其中对每一物种使用不同的寡核巧酸探针。该样的工具允许分析 各已知的miR在不同条件下的跨物种表达。
[0197] 除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于miRNome的大部分（优选 整个miRNome)的miRNA-特异性探针寡核巧酸的微芯片可用于进行miR基因表达特征谱分 析，W分析miR的表达模式。可使不同的miR特征与已建立的疾病标记关联或直接与疾病 状态关联。
[019引按照本文中描述的表达特征谱分析法，对来自怀疑患有癌症特征（例如转移或复 发）的受试者的样品的总RNA进行定量逆转录W提供一组与样品中的RNA互补的标记的祀 寡脱氧核巧酸。然后将祀寡脱氧核巧酸与包含miRNA-特异性探针寡核巧酸的微阵列杂交， 从而提供样品的杂交特征谱。结果是显示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交特征谱。 杂交特征谱包括来自祀寡脱氧核巧酸（其来自样品）与微阵列中的miRNA-特异性探针寡 核巧酸结合的信号。所述谱可记录为结合的存在或不存在（信号对0信号）。更优选地，记 录的谱包括来自各杂交的信号的强度。将所述谱与从正常的（例如，非癌性）对照样品产 生的杂交特征谱相比较。信号表示受试者中存在癌症特征或易于发生癌症特征。
[0199] 用于测量miR基因表达的其它技术也在本领域技术人员的能力范围内，包括用于 测量RNA转录和降解速率的各种技术。
[0200] 本发明还提供了测定预后的方法。不良预后的实例包括但不限于低存活率和快速 疾病进展。
[0201] 在某些实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平；逆转录获自受试者 的受试样品的RNA W提供一组祀寡脱氧核巧酸，将该祀寡脱氧核巧酸与包含miRNA-特异性 探针寡核巧酸的微阵列杂交，从而提供受试样品的杂交特征谱，然后将受试样品的杂交特 征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。
[0202] 因此，本发明包括治疗受试者的癌症的方法。该方法包括施用有效量的至少一种 分离的反义miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段，W便受试者中癌细胞的转移、 复发或增殖被抑制。给受试者施用的分离的反义miR基因产物可W与内源野生型miR基因 产物互补或相同，或可W是其互补的变体或生物活性片段。
[0203] 如本文中所定义的，miR基因产物的"变体"是指，与对应野生型miR基因产物具 有少于100%的同一性并且具有对应野生型miR基因产物的一个或多个生物活性的miRNA。 此类生物活性的实例包括但不限于，与肺癌转移或复发相关的细胞过程（例如，细胞分化、 细胞生长、细胞死亡）的抑制。该些变体包括物种变体和由于miR基因的一个或多个突变 (例如，置换、缺失、插入）而产生的变体。在某些实施方案中，变体与对应野生型miR基因 产物具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的同一性。
[0204] 如本文中所定义的，miR基因产物的"生物活性片段"是指，具有对应野生型miR 基因产物的一个或多个生物活性的miR基因产物的RNA片段。如上文中所述，此类生物活 性的实例包括但不限于，与肺癌转移或复发相关的细胞过程的抑制。在某些实施方案中，生 物活性片段在长度上为至少约5、7、10、12、15或17个核巧酸。在具体的实施方案中，可将 分离的miR基因产物与一种或多种另外的抗癌治疗组合来给受试者施用。适当的抗癌治疗 包括但不限于，化学疗法、放射疗法W及组合（例如，放化疗）。
[0205] 如本文中所使用的，术语"治疗"、"医治"和"疗法"是指改善与疾病或病况例如肺 癌转移和/或复发相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的 症状的严重度或频率。术语"受试者"和"个体"在本文中定义为包括动物例如哺乳动物， 包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他牛科、羊 科、马科、犬科、猫科、晒齿目或鼠科物种。在优选实施该群中，动物是人。
[0206] 如本文中所使用的，分离的miR基因产物的"有效量"是足W在遭受肺癌转移和/ 或复发的受试者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重、疾病侵 入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径W及施用是局部的还是全身性的，本领 域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的miR基因产物的有效量。
[0207] 例如，分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的大致重量。肿瘤块 的大致重量可通过计算肿瘤块的大致体积来测定，其中1立方厘米的体积大致等于1克。基 于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可在约10-500微克/克的肿瘤块的范围 内。在某些实施方案中，有效量可W为至少约10微克/克的肿瘤块，至少约60微克/克的 肿瘤块或至少约100微克/克的肿瘤块。
[020引分离的miR基因产物的有效量可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优 选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用该样的有效量。例如，对受试者施用的分离的miR 基因产物的有效量可在大约5-3000微克Ag体重、大约700-1000微克Ag体重的范围内 或大于大约1000微克Ag体重。
[0209] 本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的miR基因 产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次（例如，作为单次注射或沉积 (exposition))miR基因产物。可选择地，可W每天1次或2次对受试者施用miR基因产物， 进行大约3至大约28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1 次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的miR 基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。
[0210] 如本文中使用的，"分离的"miR基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改 变或取出的miR基因产物。例如，合成的miR基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存 材料分离的miR基因产物被认为是"分离的"。分离的miR基因产物可W W大体上纯化的形 式存在，或可W存在于已将所述miR基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至 细胞或在细胞中表达的miR基因产物被认为是"分离的"miR基因产物。在细胞内从miR前 体分子产生的miR基因产物也被认为是"分离的"分子。根据本发明，本文中描述的分离的 miR基因产物可用于制造用于治疗受试者（例如，人）的肺癌转移和/或复发的药物。
[0211] 分离的miR基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方 法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核巧亚 磯醜胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成miR基因产物。合成RNA分子或合成试剂的 提供商包括例如 Proligo 化amburg, Germany)、Dharmacon Research (Lafayette, CO, U. S. A. ) > Pierce Chemical (part of Perbio Science, Rockford, IL, U. S. A.)、 Glen Research(Sterling, VA, U. S. A. )、ChemGenes (Ashland, MA, U. S. A.)和 Cruachem(Glasgow, UK)。
[0212] 可选择地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达miR基因产 物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或HlRNA POl III启动子序列或巨 细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质 粒还可包括用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
[0213] 可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。还 可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论 述重组质粒将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
[0214] miR基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个 实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统（包 括但不限于癌细胞中现有的加工系统）将该前体分子加工成功能性miR基因产物。其他合 适的加工系统包括例如体外果禍细胞裂解物系统（例如，如属于化SChl等人的美国公开专 利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文）和大肠杆菌RNA 酶III系统（例如，如属于化ng等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全 部公开内容通过引用合并入本文）。
[0215] 适合用于表达miR基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒W表达 基因产物的方法W及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之 内。参见，例如，Zeng 等人（2002)，Molecular Cell9:1327-1333 ;Tuschl (2002)，化t. Biotechnol, 20:446-448 ;E5rumme化amp 等人（2002), Science296:550-553 ;Miyagishi 等 人（2002),化1:. Biotechnol. 20:497-500 ;化ddison 等人（2002), Genes Dev. 16:948-958 ; Lee 等人（2002)，Nat.Biotechnol. 20:500-505 ;和化ul 等人（2002)，化t. Biotechnol. 20:505-508,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[0216] 在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子 (intermediate-early promoter)控制下编码miR前体RNA的序列。如本文中所使用的， "在启动子的控制下"是指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3'端，W便启动子可 起始miR基因产物编码序列的转录。
[0217] miR基因产物还可从重组病毒载体表达。预期miR基因产物可从两个分开的重组 病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病 毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将 miR基因产物递送至癌细胞的用途。
[021引本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何 合适的启动子。合适的启动子包括但不限于U6或HlRNA pol III启动子序列，或巨细胞病 毒启动子。其他合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载 体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或可调控的启动子。
[0219] 可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒 (AV)、腺伴随病毒（AAV)、逆转录病毒（例如，慢病毒（LV)、弹状病毒（化油doviruses)、鼠 白血病病毒）、疮疹病毒等的载体。可通过用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型 化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白（如果合适）来改变病毒载体的趋向性。
[0220] 例如，可用来自水泡性口膜炎病毒（VSV)、狂犬病病毒（rabies)、埃博拉病毒 巧bola)、莫科拉病毒（Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体 进行工程改造W表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之祀向不同的细 胞。例如，表达血清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV2/2。AAV2/2载 体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV2/5载体。用于 构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例 女口，R油inowitz，J. E.,等人（2002)，J. Virol. 76:791-801，其全部公开内容通过引用合并 入本文。
[0221] 适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插 入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领 域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg (1995),Gene Hierap. 2:301-310 ;Egl itis (1988), Biotechniques6:608-614 ;Miller (1990), Hum. Gene "Therap. 1: 5-14 ;和 Anderson (1998)，化Uire392:25-30,其全部公开内容通过引用合并入本文。
[022引特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达miR基因产物的合适的 AV载体、用于构建重组AV载体的方法W及用于将载体递送至祀细胞的方法描述于Xia等 人（2002),化t. Biotech. 20:1006-1010,其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达 miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法W及用于将载体递送至祀 细胞的方法描述于 Samulski 等人（1987)，J. Virol. 61:3096-3101 ;Fisher 等人（1996)，J. Virol, 70:520-532 ;Samulski 等人（1989)，J. Virol. 63:3822-3826 ;美国专利 5,252,479 ; 美国专利5, 139,941 ;国际专利申请W094/13788 ;和国际专利申请W093/24641，其全部公开 内容通过引用合并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV 载体表达miR基因产物。
[0223] 在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA启动子控制下的 与POlyT终止序列有效连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，"与POlyT 终止序列有效连接"是指编码有义或反义链的核酸序列W 5'方向与POlyT终止信号紧密邻 接。在从载体转录miR序列的过程中，POl^终止信号用于终止转录。
[0224] 受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大 小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设 计用于检测癌细胞的特征表面标记的其他技术来测量。
[0225] 还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用miR基因产物。用于本 方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括 例如血管内给药（例如，静脉内团注化Olus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内 输注和至脉管系统内的导管滴注）；组织外周（peri-tissue)和组织内注射（例如，肿瘤外 周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射）；皮下注射或沉积，包括皮下输注（例如 通过渗透粟）；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其他安置装置（例如，视网膜丸剂 (retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物）；W及吸入。特别 适合的施用途径是注射、输注和至肿瘤内的直接注射。
[0226] 在本方法中，miR基因产物可W W裸露的RNA形式、与递送试剂一起或W包含 表达miR基因产物或miR基因表达抑制化合物的序列的核酸（例如，重组质粒或病毒载 体）的形式对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、 lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子（例如，多聚赖氨酸）和脂质体。
[0227] 包含表达miR基因产物的序列的重组质粒和病毒载体、W及用于将此类质粒和载 体递送至癌细胞的技术在本文中进行了论述和/或在领域是公知的。
[022引在特定的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物（或包含编码它们的序列的 核酸）递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成 小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带负电荷的 磯脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期望的脂质体大小和脂质 体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人 (1980)，Ann. Rev. Bio地ys. Bioeng. 9:467 ;和美国专利 4, 235, 871、4, 501，728、4, 837, 028 和5, 019, 369 (其全部公开内容通过引用合并入本文）中所描述的方法。
[0229] 用于本方法的脂质体可包含将脂质体祀向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍 的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
[0230] 用于本方法的脂质体还可进行修饰W避免被单核巨瞻细胞系统（"MMS")和网状 内皮系统（"RES")清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部 分被整合入脂质体结构。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制 部分和配体。
[0231] 用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大 的亲水聚合物。如本文中所使用的，抑制调理作用的部分，当其通过化学或物理方式（例如 通过将脂溶性销嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团的直接结合）附着至膜时，与脂质 体膜"结合"。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的 保护性表面层；例如，如美国专利4, 920, 016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入 本文。
[0232] 适合于修饰脂质体的抑制调理作用的部分优选是具有大约500至大约40, 000道 尔顿，更优选大约2, 000至大约20, 000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚 合物包括聚己二醇（PEG)或聚丙二醇（PPG)或其衍生物；例如甲氧基PEG或PPG W及PEG 或PPG硬脂酸醋；合成的聚合物，例如聚丙帰醜胺或聚N-己帰基化咯焼丽；线性的、分支的 或树枝状聚醜胺；聚丙帰酸；多元醇，例如与駿基或氨基化学连接的聚己帰醇和聚木糖醇， W及神经节巧脂，例如神经节巧脂GMl。阳G、甲氧基阳G或甲氧基PPG或其衍生物的共聚 物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可W是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚己二胺、聚 己帰胺或多聚核巧酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可W是包含氨基酸或駿酸的 天然多糖，例如半乳糖酵酸、葡糖酵酸、甘露糖酵酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、 角叉菜胶（carrageenan);胺化的多糖或低聚糖（线性或分支的）；或駿基化的多糖或低聚 糖，例如与具有所得的駿基的连接的碳酸的衍生物反应的多糖或低聚糖。优选，抑制调理作 用的部分是PEG、PPG或其衍生物。用阳G或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为"PEG化脂 质体"。
[0233] 可通过许多熟知的技术中的任一种将抑制调理作用的部分结合至脂质体膜。例 女口，可将阳G的N-轻基玻巧醜亚胺醋与磯脂醜己醇胺脂质可溶性销结合，然后再与膜结合。 类似地，可使用化(CN) BHs和溶剂混合物（例如W 30:12比例的四氨巧喃和水）在6(TC下 通过还原胺化作用，用硬脂醜胺脂质可溶性销衍生葡聚糖（dextran)聚合物。
[0234] 用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。 因此，此类脂质体有时称为"隐形（stealth)"脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或"渗漏" 微脉管系统饲喂的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤（例 女口，肺癌转移或复发）将有效地积累该些脂质体；参见G油izon,等人（1988) ,Proc.化tl. Acad. Sci.，U. S. A.，18:6949-53。此外，减少的通过RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中 的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适 合用于将miR基因产物（或包含编码它们的序列的核酸）递送至肿瘤细胞。
[0235] 可在将它们给受试者施用之前，按照本领域已知的技术将miR基因产物配制为药 物组合物，有时称为"药物"。因此，本发明包括用于治疗肺癌转移或复发的药物组合物。在 一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物 活性片段，W及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，至少一种miR基因产物对应于 与适当的对照细胞相比，在癌细胞中具有降低的表达水平的miR基因产物。 实施例
[0236] 本发明的某些实施方案定义于本文的实施例中。应当理解，该些实施例，虽然显示 了本发明的优选实施方案，但是仅W举例说明的方式给出。根据上述论述和该些实施例，本 领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发 明进行各种改变和变动，W使其适合各种用途和条件。
[0237] 受 EGFR 和 MET 调节的 MiRNA
[023引为了鉴定受EGFR-和MET-调节的miRNA，我们使用ShRNA慢病毒颗粒（图1A)稳 定地沉默来自美国典型培养物保藏中也（ATCCC)的化Iu-I细胞的EGFR和MET,并检查全 局miRNA表达特征谱。在EGFR-和MET敲低巧GFR-邸和MET-邸）的Calu-I细胞中，我们 分别鉴定了 35和44个显著（P<0. 05)失调的miRNA (图IB和图7A)。
[0239] 显示了具有大于1. 5倍（对于EGFR)或大于1. 7倍（对于MET)的变化的miRNA。 在比较该两列miRNA后，发现仅8个受EGFR和MET二者调节的miRNA(图1C) ;miR-21、 miR-221 和 miR-222、miR-30b 和 miR-30c、miR-29a W及 miR-29c 和 miR-100。
[0240] miR-30b、miR-30c、miR-221 和 miR-222 在 MET 和 EGFR 沉默后下调，并且显示最高 的表达倍数变化。基于显示在对TKI的从头和获得的抗性中MET过表达的证据，还调查了 2 个在MET沉默后最差异地诱导的miRNA, miR-103和miR-203。使用定量RT-PCR(qRT-PCR) (图7B)和nodhern印迹（图ID)分析评估该6个miRNA在EGFR-邸和MET-邸Calu-I细 胞中的表达。
[0241] 酪氨酸-激酶-调节的miRNA革己
[0242] MET和EGFR RTK在肺癌肿瘤发生和进展中具有至关重要的作用。研究分析显示， miR-103和miR-203 (其在MET敲低后增加）是肿瘤抑制因子，miR-221、miR-222、miR-30b 和miR-30c (其在MET和EGFR沉默后减少）是致癌的。
[024引 人APAF1、B化2L11 (也称为BIM)、P服CE (也称为PKC- e )和SRC的3'非翻译区 (3' UTR)包含分别特异于 miR-221 和 miR-222、miR-30b 和 miR-30c、miR-103 和 miR-203 的 进化上保守的结合位点（图8A)。部分地基于它们在TKI敏感性中炬化化11 @IM)和AP3或 TKI抗性（SRC)或在EGFR信号转导的负变构调节中（P服CE (PKC-O)的作用，调查该些基 因。为了确定miRNA是否与该4个假定的祀基因直接相互作用，我们共转染PGL33' UTR蛮 光素酶报道分子载体与合成的 miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c。
[0244] 蛮光素酶活性的减弱表明miRNA与P服CE (PKC- O、SRC、APAFl和 BCL2L11 @IM)3'UTR之间的直接相互作用（图1E)，并且祀基因抑制被互补种子位点中的突 变或缺失所搔救（图IE和图8A)。
[0245] Western 印迹分析显示 miR-221、miR222、miR-103、miR-203、miR-30b 和 miR-30c 表达与NSCLC细胞小组中祀蛋白质的量之间的反相关（P<0. 05)(图8B，SC)，该通过测定皮 尔逊相关系数来确认（图IF和图8D)。
[0246] 来自免疫印迹分析的结果与使用报告基因测定获得的数据完全一致。H460细胞中 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 的异位表达显著减少 BIM 和 APAF-I 表达，miR-103 和miR-203的加强表达明确地减少PKC- e和SRC蛋白的浓度（图1G，图1H)。相反地， miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 的敲低增加 APAF-I 和 BIM 蛋白的浓度（图 1-1)。 由于MET敲低的化Iu-I细胞显示APAF-I和BIM浓度的增加W及PKC- e和SRC浓度的减 少（图 1J)，因此 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 在 MET 敲低的 Calu-I 细胞中的加 强表达强烈地减少APAF-I和BIM表达（图9A)，而miR-103和miR-203的敲低增加SRC和 PKC- e 表达（图 9B)。
[0247] 总体上，该些数据显示，在NS化C细胞的MET沉默后，PKC- e、SRC、APAF-I和BIM 蛋白的表达的变化与该些特定miRNA之间的正相关（图1G-1J和图9A，9B)。使用miRNA原 位杂交（ISH)，随后通过免疫组织化学（MC)在110个肺癌样本中检测体内PKC- e、SRC、 APAF-I和BIM蛋白（图23-临床表1)，结果显示人肿瘤中该些蛋白质与miR-103、miR-203、 miR-221、miR-222、miR-30b和miR-30c之间的更加显著的负相关（图10B)。
[024引 在大多数肺癌组织中在miR-203与SRC表达、miR-30c与BIM表达、miR-103与 PKC- e表达W及miR-222与APAF-I表达之间存在负相关（图10A，10B)。
[0249] 此外，在52%巧7/110)的相同的110个肺肿瘤样品（使用miRNA I甜和MET 1肥 显示的；图11A)中存在MET过表达，在过表达MET的肿瘤中存在低的miR-103和miR-203 表达W及高的miR-222和miR-30c表达（图2A和图11A)中；相反地，在无MET表达的肿瘤 中存在高miR-103和miR-203 W及低miR-222和miR-30c表达。值得注意地，大部分过表 达MET的肿瘤伴随转移（图11B)，该显示了，MET-调节的miRNA在肺癌细胞的转移扩散中 具有作用。
[0250] 将分析扩展至40个具有注释的临床史的独立肺肿瘤（图24-临床表2)，基于 qRT-PCR分析，将所述肺肿瘤分成'低'和'高'MET及EGFR表达的两个组（图2和图11C)。
[0巧1] 方差分析确认，miRNA(miR-30b和miR-30c W及miR-221和miR-222)在低和高的 组之间差异表达，且使用皮尔逊系数，鉴定了 MET与miR-103之间W及MET与miR-203之间 的反相关（图2B, 2C)。
[0巧引使用针对MET和EGFR的I肥分析确认了 qRT-PCR结果（图11D)。此外，相较于非 转移性肿瘤，在具有远距离转移的肿瘤中观察到MET过表达，但在该40个肺癌中，在转移与 EGFR表达之间不存在相关性（图2D和图11巧。
[0253] 酪氨酸-激酶-调节的miRNA控制吉非替尼敏感性
[0巧4]现已发现，EGFR 调节 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c，测定该些 miRNA 在 具有野生型EGFR的NS化CKalu-I和A549细胞）（与具有外显子19缺失的EGFR的那些 NS化C(PC9和肥C827细胞）相比较）的吉非替尼诱导的细胞调亡中的作用。化Iu-I和A549 细胞对所有测试的吉非替尼浓度（达到20 y M)具有完全抗性；相反地，PC9和肥C827EGFR 突变型细胞的生长即使在低剂量（0. 1 y M)的吉非替尼下亦被显著抑制（图3A)。值得注 意地，在吉非替尼处理后，仅在PC9和肥C827吉非替尼敏感性细胞中存在显著的miR-30b、 miR-30c、miR-221和miR-222的下调和增加的量的BIM和APAF-I蛋白（图3B，3C)。磯酸化 E服的浓度在肥C827和PC9细胞中但非化Iu-I细胞中相较于未处理的细胞显著更低（图 3C)。
[0巧日]为了直接评估miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼诱导的细胞调亡 中的关联性，就长期暴露于递增的药物浓度后获得的获得性吉非替尼抗性分析该些miRNA 在NS化C细胞中的表达：具有EGFR化的90改变的抗吉非替尼PC9 (PC9GR)细胞和具有MET 扩增的抗吉非替尼HCC827(HCC827GR)细胞。与吉非替尼响应性亲代细胞相反，我们在用吉 非替尼处理后未观察到更低的miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的表达或它们的相关 祀的调节（图3D和图12A)。
[0巧6] 值得注意的是，miR-30c、miR-221和miR-222在吉非替尼敏感性肥C827和PC9细 胞中的过表达使得该些细胞相较于亲代PC9和HCC827细胞对利用吉非替尼的处理更不具 有反应性（图 4A 和图 13A)，miR-30b、miR-30c、miR-221 和 miR-222 的敲低导致 Calu-U 肥C827GR和PC9GR细胞的增加的吉非替尼敏感性（图4A和图14B)，该显示，该些miRNA是 TKI抗性的关键调节剂。
[0巧7]为了研究由 miR-30b、miR-30c、miR-221 和 miR-222 介导的 APAF-I 和 BIM 下调 对细胞TKI响应的贡献，在抗吉非替尼A549细胞中过表达APAF-I和BIM。在过表达BIM 和APAF-I的细胞中而非用空载体质粒转染的细胞中观察到吉非替尼诱导的聚-(ADP-核 糖）聚合酶（PARP)的切割（图4B)。相反地，在吉非替尼敏感性HCC827和PC9细胞中对 吉非替尼的响应被BIM和APAF-I沉默减少（图4C)。克隆在BIM和APAF-I编码序列下游 的BIM和APAF-I的野生型和突变的3'UTR(其用于蛮光素酶测定；图1E);和进行脫天蛋 白酶-3/7和活力测定。在用吉非替尼处理A549细胞后细胞死亡未增加，共转染的突变或 缺失恢复对吉非替尼的细胞调亡响应，该显示，APAF-I和BIM对吉非替尼敏感性的作用与 该些受miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222调节的蛋白质的敲低直接相关（图4D和图 11C)。
[0巧8] 因为MET过表达与吉非替尼抗性相关W及因为miR-30b、miR-30c、miR-221和 miR-222也受MET调节，因此分析结果表明，MET可通过该些miRNA的调节介导对吉非替尼 处理的抗性。因此，MET和EGFR的同时抑制可克服NS化C的吉非替尼抗性。在MET敲低或 用MET抑制剂SU11274处理后，观察到miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222在过表达MET 的Calu-I和A549细胞中的下调（图14A，14B)。
[0巧9] 此外，在暴露于不同浓度的吉非替尼的、SU11274处理的化Iu-I和MET-邸化Iu-I 细胞中存在增加的脫天蛋白酶-3/7活性和减弱的细胞活力（图14C，14D)。综合起来，该些 结果显示，MET过表达通过miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的上调诱导抗TKI Calu-I 细胞对吉非替尼处理的抗性，W及需要EGFR和MET的抑制来关闭该些miRNA及其存活作 用。
[0260]被 EGFR 和 MET 共同失调的其它 miRNA，包括 miR-21、miR-29a、miR-29c 和 miR-100 (图1C)，在用吉非替尼处理的肥C827和PC9细胞中下调（图15A)。值得注意的 是，在吉非替尼处理后在肥C827GR和PC9GR细胞中未观察到miR-21、miR-29a、miR-29c和 miR-100 的下调（图 15B);然而，miR-21、miR-29a、miR-29c 和 miR-100 的加强表达增加 肥C827和PC9细胞的吉非替尼抗性（图16A)。
[026。 因此，EGFR和MET通过共同的miRNA控制致癌信号转导网络。分析通过miRNA的 寡核巧酸抑制剂产生的miR-21敲低是否可恢复具有从头或获得性抗性的NSCLC细胞的吉 非替尼敏感性。miR-21的敲低增加A549、肥C827GR和PC9GR细胞对吉非替尼诱导的细胞 调亡的敏感性，该显示该miRNA在EGFR-MET信号转导途径中具有主要作用（图17A，17B)。
[0262] 还研究在表达MET的化Iu-I细胞中被强下调的miR-103和miR-203 (图1D)。利 用SU11274对Calu-I细胞的处理增加（P<0. 05)miR-103和miR-203的表达（图18A)。
[0263] 它们的祀，SRC和PKC- e，通过激活AKT和E服信号转导途径发挥促存活作用和 促成吉非替尼抗性。因此，miR-103和miR-203在A549细胞中的过表达与AKT及其底物糖 原合酶激酶3P佑SK化）的减少的磯酸化和E服的减少的磯酸化相关（图19A)。MET通过 持久PI3K-AKT和邸K信号转导活化而诱导吉非替尼抗性。该些结果显示，MET过表达通过 AKT-E服途径的活化控制吉非替尼抗性，且至少部分地由miR-103和miR-203介导。
[0264] miR-103或miR-203的加强表达或PKC-E和SRC的沉默增加化Iu-I细胞对吉非替 尼的敏感性（如通过脫天蛋白酶-3/7和活力测定评估的；（图19B，19C)。值得注意地，相 较于肥C827亲代细胞，在具有获得性MET扩增和吉非替尼抗性的抗吉非替尼肥C827细胞 中，miR-103和miR-203表达减少，因而SRC和PKC- e表达增加；因此显示了，MET至少部 分通过miR-103、miR-203及其各自的祀控制对TKI的响应（图19D，1犯）。
[0265] 为了分析对吉非替尼的体内敏感性，本发明人用包含全长miR-103或miR-203或 miR-221 (抗-miR-221)和miR-30c (抗-miR-30c)的全长抑制剂的GFP慢病毒构建体稳定 地转染A549细胞。miR-103和miR-203的过表达或miR-221和miR-30c的敲低在2周的 处理后导致裸小鼠的肿瘤生长的显著抑制和增加的对吉非替尼诱导的细胞调亡的敏感性 (图4E、4F和20A)。通过qRT-PCR显示了，异种移植肿瘤中miR-221和miR222的下调W及 miR-103 和 miR-203 的上调（图 20B)。
[0266] MiR-103和miR-203减少NS化C细胞的迁移和增殖
[0267] 为了进一步研究miR-103和miR-203在NS化C肿瘤发生中的功能作用，评估 miR-103和miR-203的功能获得W及PKC- e和SRC的功能丧失对细胞迁移和细胞周期动 力学的影响。在具有增加的miR-103和miR-203表达或减少的P服CE (PKC-O和SRC表达 的细胞中，相较于对照，迁移减少约60% (图5A)。使用伤口愈合测定进一步确认该些结果 (图58)。此外，用11111?-103、11111?-203或口服〔6任1((：-〇和5贿311?歴转染的4549和化111-1 细胞显示增加的Gl细胞分数和相应减少的S和G2-M期的细胞数目，miR-203和SRC SiRNA 相较于miR-103和P服CE牌C- O SiRNA具有略微更强的作用（图5C)。
[026引 MiR-103和miR-203促进间充质-至-上皮的转化
[0269] 在上皮-间充质转化（EMT)与导致疾病和转移的复发的化学抗性（包括对EGFR祀 向疗法的抗性）的产生之间存在关联性。虽然鉴定作为EMT的基础的分子事件是被广泛研 究的领域，但触发EMT在肿瘤细胞中的发作的事件未得到证明。本文中现已显示，在MET敲 除后存在化Iu-I细胞从成纤维样细胞形态至上皮极化表型的细胞形状的变化（图6A)。本 文中现已显示，该形态学变化可W是间充质至上皮的转化的结果。测定至关重要的EMT相 关标志物的表达；并且，在化Iu-IMET敲低细胞中，相较于化Iu-I化对照，减少的间充质标 志物表达和增加的E-巧粘蛋白表达（图6B、6C、抓），强烈地显示化Iu-I细胞在MET敲低后 至上皮表型的回复。值得注意地，在MET-邸细胞中，Snail蛋白表达比不具有MET敲低的细 胞中的更低，定位于细胞质（图6B)，并且蛋白质本身假定为无功能的。未观察到EGFR-KD 化Iu-I细胞的形态学变化，其中miR-200c、miR-103和miR-203未被上调，如在MET敲低的 细胞中那样（图7A)。
[0270] 为了确定miR-103和miR-203是否参与间充质-上皮转化，将该些miRNA在化Iu-I 细胞中过表达，并且观察到几种间充质标志物的下调和增加的E-巧粘蛋白表达，该表明该 些11111?歴在间充质-上皮转化中起作用（图66、6。、66和图214、218)。此外，？服〔6任腺-〇 和SRC在化Iu-I细胞中的沉默，相较于用SiRNA对照转染的细胞，增加E-巧粘蛋白的量和 降低SNAIL、Z邸1 (编码锋指E框结合1)、Z邸2 (编码锋指E框结合2)、波形蛋白和纤连蛋 白的mRNA的水平（图21C)。
[0271] miR-103碑!向Dicer ;因此，分析研究Dicer敲低对NS化C的肿瘤发生和吉非替尼 诱导的细胞调亡的作用。值得注意地，几乎完全的Dicer敲低不仅减小吉非替尼抗性而且 还减少NSCLC细胞的迁移和间充质标志物的表达，该显示，miR-103也可通过Dicer下调参 与间充质-上皮转化过程（实施例3和图21)。
[0272] 通过调节特定miRNA的表达，MET协调几个EMT相关途径包括Dicer、SRC、PKC- e 和AKT途径的会聚，从而支持了 MET祀向可W是控制EMT和NSCLC进展的策略的可能性。
[0273] 实施例1的讨论
[0274] EGFR和MET受体酪氨酸激酶，通过调节特定miRNA的表达，控制NSCLC的转移行为 和吉非替尼抗性。
[027引 MET是miR-221和miR-222表达的调节剂。为了测定参与NS化C肿瘤发生和药物 抗性的途径，我们研究了受EGFR和MET酪氨酸激酶调节的miRNA。具体地，在本文中检查 了 miR-30b, miR-30c, miR-221 和 miR-222 (它们受 EGFR 和 MET 二者调节）W及 miR-103 和 miR-203 (它们仅受MET调节）。
[0276] 本文中现已显示，吉非替尼处理通过吉非替尼敏感性肥C827和PC9细胞中 miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的下调和从而APAF-I和BIM的上调而触发程序化细 胞死亡。同样地，作为MET过表达的结果，吉非替尼处理不减少抗吉非替尼的化lu-l、A549 和肥C827GR细胞的miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222表达。因此，过表达MET的细胞 中单独的EGFR抑制不足W诱导该些miRNA的下调，和从而诱导细胞死亡。
[0277] 还显示了吉非替尼抗性可被MET抑制剂（其下调miR-30b、miR-30c、miR-221和 miR-222并且使NS化C对吉非替尼敏感）或被抗-miR-221、抗-miR-222和抗-miR-30c (其 在体外和在异种移植小鼠模型中在体内强烈地增强吉非替尼敏感性）克服。综上所述，该 些结果显示，特定miRNA例如miR-30b、miR-30c、miR-221和miR-222的调节具有使肺肿瘤 对TKI疗法敏感的治疗性应用。
[0278] PTEN丢失（通过使突变的EGFR与下游信号转导部分地解偶联和通过激活EGFR) 促成埃罗替尼抗性。PTEN为miR-221和miR-222的祀。该两种miRNA不仅通过APAF-I而 且还通过PTEN调节在NSCLC细胞的吉非替尼抗性中起作用。值得注意地，另一种祀向PTEN 的miRNA(miR-21)的过表达诱导肥C827和PC9吉非替尼敏感性细胞的吉非替尼抗性。
[0279] 本文中还显示了，miR-103和miR-203(其在MET沉默或用MET抑制剂SU11274处 理后被上调），通过下调PKC- e、SRC和Dicer的表达诱导抗吉非替尼NS化C的细胞调亡， 减少间充质标志物并增加上皮细胞连接蛋白（相较于野生型化Iu-I细胞）。
[0280] 在A549细胞的对吉非替尼的获得性抗性中起作用的EMT，显示间充质状态与 NS化C对吉非替尼或埃罗替尼的"固有抗性"相关。如图細中的模型所示，MET表达下调 miR-103 和 miR-203 并且上调 miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c，诱导 NS化C 的吉非替 尼抗性，和上皮-间充质转化。与对抗EGFR试剂的敏感性或抗性相关的预后和预测因子的 鉴定是非常重要的，且异常的关键信号转导蛋白，包括RAS-MEK、雷帕霉素的AKT-哺乳动物 祀（mTOR)和MET激酶，是至关重要的祀。
[0281] 由于MET信号转导的活化或扩增通过多个独立机制促成TKI抗性和导致药物抗性 的快速进化，因此，基于MET表达或MET调节的miRNA对NS化C进行的分层现允许治疗的个 体化。该样的分层可通过消除未从特定治疗方案受益的NSCLC患者的该特定方案的不必要 的副作用来增强治疗功效。
[0282] 此外，对肺肿瘤样本的临床验证研究显示，MET过表达和随后miR-103和miR-203 的不存在可用于鉴定具有转移能力的原发性肺肿瘤。
[0283] 此外，miR-103和miR-203的减少的表达预示着更具侵袭性的早期转移性肿瘤。
[0284] 此外，与TKI组合的miRNA提供了治疗NSCLC的新策略。
[0285] 实施例2
[028引"TaqMan 阵列 MicroRNA 卡
[0287] "TaqMan 阵列人 MicroRNA 卡（Applied Biosystem) Set v3. 0 是包含总共 384 个 化qMan MicroRNA测定/卡的两个卡的组，其使得能够准确地定量754个人miRNA。每一个 阵列上包含3个化qMan MicroRNA测定（作为内源对照，W帮助数据标准化）和一个与人无 关的"TaqMan MicroRNA测定（作为阴性对照）。通过使用 Megaplex PreAmp Primers, Human 化Ol Set v3. 0(对于其中敏感性是最重要的或其中样品是有限的情况），能够进行另外的 扩增前步骤。
[028引 体内实验
[0289]用对照 miRNA、miR-103 和 miR-203 或用 miRNA 的对照抑制剂或 miR-221 和 miR-30c 的慢病毒抑制剂（SBI)稳定地感染A549细胞。我们将5 X 1〇6个活细胞皮下注射入6周 龄雄性裸小鼠（化arles River Breeding L油oratories)的右胁腹。在肿瘤细胞接种后 7天开始处理。通过口服强饲法，W 200mg/kg体重的浓度（在无菌Milli-Q水中的I % TweenSO(Sigma)中）（媒介物对照为无菌Milli-Q水中的0. 5% TweenSO)从周一至周五施 用吉非替尼，进行2周。使用数字测径器每周评估肿瘤尺寸2次。通过测量肿瘤的长度（1) 和宽度（W)和计算体积（V = 1*2/2)来测定肿瘤体积。我们在注射后35天杀死小鼠。使 用学生氏t检验来评价对照与处理的小鼠之间的统计显著性。在俄亥俄州大学的动物维护 管理及使用委员会批准后，进行小鼠实验。
[0290] 迁移测定
[0291] 具有8-y m多孔膜的Transwell插入室（Greiner Bio One)用于测定。用PBS洗 涂细胞3次，将其添加至顶部小室的无血清培养基中。底部小室充满包含10% FBS的培养 基。将细胞在37C于5% C〇2潮湿培养箱中温育24小时。为了定量迁移细胞，通过使用棉 签去除顶部小室中的细胞，将迁移的细胞于PBS，25%戊二酵中固定，并用结晶紫进行染色， 在相差显微镜下可视化并照像。随后将结晶紫染色的细胞溶解在醋酸和甲醇（1:1)中，测 量在595nm处的吸光度。
[029引免疫英光
[0293] 将细胞生长在Ub-Tek II CC2腔室载玻片（Nunc)上，用4%多聚甲酵固定， 用 0.2% Triton X-100/PBS 进行透化，随后用 10 % 绵羊血清（Caltag L油oratories) 进行封闭。所有一抗来自Abeam。二抗为偶联于Alexa488的针对小鼠或兔的山羊抗 体（Invitrogen)D使用鬼笔环肤试剂（Invitrogen)对F-肌动蛋白进行染色。利用 DAPI(Sigma)显现细胞核。用SlowFade Gold抗衰退剂（Invitrogen)固定载玻片。
[0294] 细胞死亡和细胞增殖定量。
[0295] 为了检测脫天蛋白酶3/7活性，W-式H份将细胞培养在96孔板中，用5uM、 10 U M或15 y M吉非替尼进行处理，随后按照制造商的说明书使用脫天蛋白酶-Glo3/7测定 试剂盒（Promega)进行分析。连续变量表达为平均值±s.d。按照制造商的方案，用漠化 3-(4,5-二甲基喔哇-2-基）-2,5-二苯基四哇（MT巧-Cell Titer96AQueous One Solution Cell Proliferation测定（Promega)检查细胞活力。通过添加20 y I MTS至每一个孔 中来检测代谢上具有活性的细胞。在1小时的温育后，在Multil油el计数器炬io-Rad L油oratories)中分析板。
[029引统计分析
[0297] 将学生氏t检验、单因素方差分析和Fisher' S精确检验用于测定统计显著性。计 算皮尔逊相关系数 W测试 miR-103、miR-203、miR-221、miR-222、miR-30b 和 miR-30c 与它 们假定的祀之间W及MET与miR-103和miR-203之间的反相关。对于所有检验，通过计算 P值评估的统计显著性定义为P<〇. 05。
[029引 实施例3
[0299] 通过miR-103耗尽Dicer减少了细胞迁移并促进吉非替尼敏感性。
[0300] miR-103对Dicer的部分减弱促进细胞迁移，然而更完全的Dicer敲低减弱细胞活 力和减少细胞迁移。在MET沉默或miR-103加强表达后存在Dicer的显著下调（图22A)， 该显示该系统中miR-103对Dicer的几乎完全沉默可促进癌细胞运动的减少和诱导程序化 细胞死亡。为了在实验上阐明该现象，我们用Dicer SiRNA转染A549和化Iu-I细胞，诱导 Dicer显著敲低至与通过miR-103表达实现的水平相似的水平（图22B)。相较于对照细胞， A549和化Iu-I细胞的Dicer的全局性减弱对细胞迁移和吉非替尼抗性具有显著作用（图 22C，22D)。此外，Dicer沉默减少化Iu-I细胞的间充质标志物的表达和升高E-巧粘蛋白 的表达水平，该显示miR-103不仅通过PKC- e而且还通过Dicer下调诱导间充质上皮转化 (图22巧。
[0301] 蛮光素酶测定
[030引使用下列引物（分别地，按出现的顺序，SEQ ID N01-12)PCR扩增人APAF-1、 BIM 炬化2L11、PKC- e 和 SRC 基因的 3' -UTR :
[030引 APAF-lFw5'TCT AGA CTA ATG AAA CCC TGA TAT CAA C3，
[0304] APAF-IRwS， TCT AGA ACTGCTACCCTGAGGCACAGCCT3'
[0305] BIM FW ;5' TCTAGACTGGATGGGACTACCTTTCTGTTC3'
[0306] BIM RW ;5' TCTAGACATAATCCTCTGAGAATAGGCCG3'
[0307] PKC-e FW D5, TCTAGAGTGACATGCAATGGCAACTCATGTGGAC3'
[0308] PKC-e RW D5, TCTAGAACAAAGAATCCCCAACACACCCCCCCAT3'
[0309] PKC-e FW S5, TCTAGATGATGCCCTGAGAGCCCACTGCAGTT3，
[0310] PKC-e RW S5' TCTAGATTGCTTCACTGCCAGGAGCCCCTGA3'
[031。 SRC-1-21FW5, -GCT CTA GAG CGC AGC ACA AGG CCT TGC CTG GCC TGA TGA T-3'
[0312] SRC-1-2RW5' -GCT CTA GAG CCA TGG CAG TGG GTA ACA CGT CCT CTT TCA C-3'
[0313] SRC-3-4FW5，-GCTCTAGATCCCTGTGTGTGTGTATGTGTGTGCATGTGTGCGT3'
[0314] SRC-3-4RW5' -GCT CTA GAG CGG AGA GGG ATT TGA GAG CTC GCT GGG GTG A-3'
[0315] 并将其克隆在pGL3对照载体（Promega)中海肾蛮光素酶终止密码子的下游。使 用下列引物（分别地，按出现的顺序，SEQ ID N013-24)通过反向PCR将该些构建体用于产 生p3' -UTR-突变体-质粒：
[0316] APAF-IMut FW5> GTGGTTGGATGAATAATATTMTCTCCTTTTTCCC3'
[0317] APAF-I Mut Rw5, GGGAAAAAGGAGATTAATATTATTCATCCAACCAC3'
[0318] BIM MUT FW ;5' GTGTAAGAATGGTGCAGTGTGTTTTCCCCCTG3'
[0319] BIM MUT RW5' GAGGGGGAAAACACACTGCACCATTCTTACAC3'
[0320] PKC-e FW MUT15, GAGA TTTTTGTATA TAGTGTTAGGCCT GTGGAATTAA TTCG3，
[032。 PKC-e RW MUTl 5, CGAATTAATTCCACAGGCCTAACACTATATACAAAAATCTC3，
[0322] PKC-e FW MUT2 5, CGTTGCATATAGAGGTATCAATGTTCAGGCATATTATAAAAC3'
[0323] PKC-e RW MUT25, GTTTTATAATATGCCTGAACATTGATACCTCTATATGCAACG3，
[0324] SRC-3° Mut Fw5, CCAAACATGTTGTACCATGGCCCCCTCATCATAG3，
[03巧]SRC-3D Mut Rw5, CTATGATGAGGGGGCCATGGTACAACATGTTTGG3，
[0326] SRC-4° mut Fw5, GGCCAAGCAGTGCCTGCCTATGAACTTTTCCTTTCATACG3，
[0327] SRC-4D mut RW5, CGTATGAAAGGAAAAGTTCATAGGCAGGCACTGCTTGGCC3，
[032引 使用 Lipof ectamine2000 (Invitrogen)，用 I y g 的 p3' UTR-APAF-l、p3' UTR-BIM、 p3' UTR-PKC e、p3' UTR-SRC 和用 p3' UTRmut-APAF-I、p3' UTRmut-BIM、p3' UTRmut-PKC e、 p3' UTRmut-SRC质粒和I y g的海肾蛮光素酶表达构建体P化-TK (Promega)共转染MeGOl细 胞。转染后24小时收获细胞，按照制剂商的说明书，利用Dual Luciferase Assay (Promega) 对其进行测定。W-式H份进行3个独立的实验。
[0329] Western 印迹分析
[0330] 用放射免疫沉淀测定（PIRA)缓冲液 0). 15mM 化Cl, 0, 05mM Tris-肥1，pH7. 5, 1% Triton, 0. 1% SDS，0. 1 %脱氧胆酸轴和1% Nonidet P40)从NSCLC提取总蛋白质。使用微 型胶装置炬io-Rad L油oratories)将样品提取物（50 y g)在7. 5-12% SDS-聚丙帰醜胺凝 胶（PAG巧上进行分离，随后转移至Hybond-C extra硝酸纤维素。膜用5 %的在包含0. 05 % Tween20的Tris缓冲盐溶液中的脱脂乳封闭1小时，随后用一抗温育过夜，洗涂，用二抗温 育，并通过化学发光来进行显现。
[033^ 使用下列一抗：Apaf-1、Snail、Slug(油cam)、Src、Met、Dicer、波型蛋白、E-巧 粘蛋白、Zebl、Zeb-2(Santa Cruz)、Bim、祀rks、总 Rrks、pAkt、总 Akt、GAP畑、Pa巧（cell si即aling)、Pkc-e炬D transduction I油）、目-肌动蛋白抗体、纤连蛋白（Sigma)。使用 第二抗-兔或抗-小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体过氧化酶缀合物（化emicon)。
[033引 实时PCR
[0333] 使用标准^qMan PCR试剂盒方案在Applied Biosystems7900HT序列检测系统 (Applied Biosystems)上进行实时 PCR。IOpl PCR 反应包括 0.67pl RT 产物、Ipl ^qMan 通用 PCR预混合物（Applied Biosystems)、0.2mM "TaqMan 探针、1.5mM 正向引物和 0.7mM 反 向引物。将反应物在96孔板中于95C温育lOmin，随后进行40个循环的（在95C进行15s 和在6(TC进行Imin)。W-式H份进行所有反应。阔值循环（CT)被定义为英光超过固定 阔值时的循环数目。将用于基因表达的相对定量的比较CT法（Applied Biosystems)用于 测定miRNA和基因表达水平。y轴代表，或不同miR和基因的相对表达。相对于U44 和U4化RNA (对于microRNA) W及相对于GAPDH(对于基因）计算MiR表达。对于每一个数 据点W-式H份进行实验，且使用软件炬io-Rad)进行数据分析。
[0334] ShRNA慢病毒颗粒转导
[0335] 在病毒感染之前24小时将细胞涂板在12孔板中，并用1 ml的完全最优化培养基 (具有血清和抗生素）温育过夜。次日，除去培养基，添加Iml的含有凝聚胺巧yg/ml)的 完全培养基。次日，通过添加50y 1的对照shRNA、shEGFR、shMET慢病毒颗粒（Santa化UZ) 至培养物来感染细胞。通过Ipg/ml的二盐酸嘿岭霉素来选择稳定的克隆。
[0336] RNA 提取和 Nodhern 印迹
[0337] 按照制造商的说明书，用TRIzol化溶液（Invitrogen)提取总的RNA，利用 Agilent BioAnalizer2100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA)评估 RNA 的完整性。进行 Nodhern印迹。用作探针的寡核巧酸（分别地，按照出现的顺序，SEQ ID N025-30)是成熟 HiiRNAOniRNA登记）的互补序列：
[0338] miR-103 ;5, TCATAGCCCTGTACAATGCTGCT3,；
[0339] miR-203 ;5, CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC3,；
[0340] miR-30b ;5, AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA
[0341] miR-30c ;5, GCTGAGAGTGTAGGATGTTTACA3,；
[0342] miR-221 ;5' GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT3';
[0343] miR-221 ;5, ACCCAGTAGCCAGATGTAGTAGCT3，
[0344] PKC e、SRC、BIM、APAF-IsiRNA 转染
[0345] 将细胞培养至50%汇合，使用^口〇'6別311111162000，用100碰抗斗1((：-山抗-5贿、 抗-BIM、抗-APAF-I或对照siRNA (Santa化uz)、被设计用于敲低基因表达的3个祀特异性 20-25nt SiRNA的混合物进行瞬时转染。
[0346] 福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片的MiRNA锁核酸原位杂交
[0347] 使用包括在胃蛋白酶（1. 3mg/ml)中消化30分钟的方案对脱蜡的人肺组织进行原 位杂交（ISH)D具有缀合于5'末端的地高辛的、包含分散的锁核酸（LNA)修饰的碱基的探 针的序列为：
[0348] miR-222(5,）ACCCAGTAGCCAGATGTAGCT(SEQ ID NO ;31);
[0349] miR103-6，）AGCAGCATTGTACAGGGCTATGA(3，）（SEQIDN0;32);
[0350] miR-203-巧，）CTAGTGGTCCTAAACATTTCAC(沈Q ID NO ;33)
[0巧1] 在6(TC对探针混合物和组织miRNA进行共变性5分钟，随后在37C杂交过夜，在 4C于0. 2X SSC和2%牛血清白蛋白中进行严格洗涂10分钟。因碱性磯酸酶对色原体氮 蓝四哇和漠氯剛巧磯酸（NBT/BCIP)的作用而观察到探针-祀复合物。阴性对照包括应当 在此类组织中产生阴性结果的探针（混杂miRNA)的使用。不使用复染，W有利于PKC-e、 APAF-I、SRC、BIM和MET蛋白的共标记。
[0巧引在miRNA的原位杂交后，使用SRCd : 100,细胞条件化30分钟）、PKC- e (1:10,蛋 白酶消化4分钟）、BIMd : 100,细胞条件化30分钟）、APAF-I (1:25,细胞条件化30分钟） 和MET (1:50,细胞条件化30分钟）的最佳条件来分析载片的免疫组织化学（MC)。使用 MET (1:50,细胞条件化30分钟）和EGFRd : 100,细胞条件化30分钟）的最佳条件通过1肥 分析30个独立的肿瘤样本。 防353] 为了进行免疫组织化学，使用来自Ventana Medical Systems的Ultrasensitive 化iversal Fast Red or DAB系统。随后分析表达PKC-e、5贿、8碰、4?4。-1、]\^1'和11111?-103、 miR-203、miR-30c、miR-221/miR-222的肿瘤细胞的百分比，强调各自祀的定位。按照制造 商的推荐，利用Nuance系统（Cambridge Research Institute)进行共表达分析。
[0巧4] 肺癌样品和细胞系
[0巧引 110个肺癌组织购自US Biomax, Inc。40个肺肿瘤组织样品由俄亥俄州立大学的 病理系提供。按照Ohio State InstiUitional Review Board批准的方案获得所有人组织。 将人化Iu-I细胞系生长在含有10%热灭活胎牛血清（FB巧W及2mM k谷氨醜胺和IOOU ml-1青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基中。将A549、H460、H1299、H1573、ffi92、 肥C827、PC9、肥C827GR、PC9GR细胞系生长在含有10%热灭活的FBSW及2mMレ谷氨醜胺 和IOOU ml-1青霉素-链霉素的RPMI中。
[0巧6] 生物信息学分析 防357] 通过使用该些特定程序；Targetscan、Pictar、RNhybrid进行生物信息学分析。
[0巧引 具有miR-103和miR-203过表达和miR-221、miR-30c下调的稳定克隆的产生
[0巧9] 用包含在两个不同启动子的控制下的全长miR-103、miR-203或抗-miR-221、 miR-30c和GFP基因的人pre-microRNA表达构建体Lenti-miR表达质粒（System Biosciences)稳定地转染A549细胞。空载体用作对照。在293TN包装细胞系中用 pPACKHlLentivector包装质粒混合物（System Biosciences)包装Pre-miR表达和对照构 建体。使用PEGit病毒沉淀溶液浓缩病毒，随后使用UltraRapid Lentiviral Titer试剂 盒（System Biosciences)分析滴度。通过 FACS 分析（FACScalibur ;BD Bioscience)选择 感染的细胞。通过英光显微镜验证高于90%的感染效率，通过实时PCR确认miR表达。 [0360] miR-30b/c-和 221/222-不敏感的 BIM 和 APAF-lcDNA 的产生
[036。 通过使用下列引物（分别地，按照出现序列，SEQ ID N034-37)，扩增Bim W及 APAF-IWT和突变的3' UTR，将其克隆在APAF-I和BIM编码序列的rigene)的下游：
[0362] APAF-I FW 5, GGCCGGCC CTA ATG AAA CCC TGA TAT CAA C3，
[0363] APAF-1RW5' GGCCGGCC ACTGCTACCCTGAGGCACAGCCT3
[0364] BIM FW ;5' GGCCGGCCCTGGATGGGACTACCTTTCTGTTC3'
[03巧]BIM RW ;5, GGCCGGCCCATAATCCTCTGAGAATAGGCCG3'
[0366] 随后将构建体用于进行活力和脫天蛋白酶3/7测定。W-式H份进行实验至少3 次。
[0367] 划痕实验
[0368] 用对照miR, miR-103或miR-203转染A549细胞，进行72小时。转染后24小时， 用培养基5% FBS温育转染的细胞。在划痕后立即（0小时）获取图像和在24小时后获取 图像。使用Image J软件定量迁移距离。通过将像素转化成毫米计算覆盖的距离。
[0369] 细胞周期分析
[0370] 为了进行细胞周期分析，将细胞涂板在6cm培养皿中，如图中所示进行转染，进行 膜蛋白酶处理，于PBS中洗涂，在润旋的条件下用冰冻的70%己醇进行固定。将细胞于PBS 中再水化，在进行流式细胞术分析之前在RT下用楓化丙巧巧Omg/ml PI，0. 5mg/ml RNA酶， 于PBS中）染色30min。每一个实验独立地重复5次，对于每一个样品进行两次重复。
[0371] 本说明书中引用的所有出版物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本 文。本文中对任何文献的引用不意味着承认，任何此类文献是相关现有技术水平。关于日 期的所有记载或关于该些文献内容的陈述基于 申请人:可获得的信息，并且不构成对该些文 献的日期或内容的正确性的任何承认。
[0372] 虽然已参考各种优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员理解，可进行各 种变化，并且可用等同物替代其组件而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改动来 使特定情况或材料适合于本发明的教导而不背离其基本范围。
[0373] 因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案；相反地， 本发明意欲包括落在权利要求书范围内的所有实施方案。
【权利要求】
1. 一种组合物，其包含选自下列的核酸:APAF-1的miR-221/222结合位点的分离 的核苷酸154至160(5' -ATGTAGC-3'）；BM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至 294(5'-TGTTTACA-3'）；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸（互 补序列：3' -ACGACG-5'）；与PKC- ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离 的核苷酸（互补序列：3' -ACGACG);与PKC- ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570 互补的分离的核苷酸（互补序列：3'-ACGACG-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656 至662互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核 苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸（互补序列：3'-UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合 位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）；和与SRC的 miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）。
2. -种分离的核酸，其包含选自下列的核酸：5' -ATGTAGC-3' ；5' -TGTTTACA-3' ； 3,-ACGACG-5,和 3,-UAAAGU-5,。
3. 本文权利要求的任一项的分离的核酸或组合物，其还包含选自启动子、增强子、重复 序列、标志物和报道基因的元件。
4. 本文权利要求的任一项的分离的核酸，其为探针、引物、miRNA、质粒、载体、病毒、细 胞或修饰的生物。
5. -种物质组合物，其包含至少一种选自下列的miR :miR-103、miR-203、抗-miR-30和 抗-miR-221。
6. 本文权利要求的任一项的组合物，其包含至少2种选自miR-103、miR-203、 抗-miR-30 和抗-miR-221 的 miR。
7. 本文权利要求的任一项的组合物，其包含至少3种选自miR-103 ;miR-203 ; 抗-miR-30 和抗-miR-221 的 miR。
8. 本文权利要求的任一项的组合物，其包含miR-103、miR-203、抗-miR-30和 抗-miR-221。
9. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含化学疗法治疗。
10. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含肺癌化学疗法治疗。
11. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含表皮生长因子受体（EGFR)抑制剂。
12. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含酪氨酸激酶抑制剂（TKI)。
13. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含选自西妥昔单抗；帕木单抗；扎芦木单 抗；尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
14. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含选自吉非替尼；埃罗替尼；拉帕替尼； AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子。
15. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含吉非替尼。
16. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含PKC-ε表达激动剂。
17. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含MET抑制剂。
18. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含SU11274。
19. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含DICER抑制剂。
20. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含E-钙粘蛋白表达激动剂。
21. 本文权利要求的任一项的组合物，其还包含佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受 的组合物。
22. 本文权利要求的任一项的组合物，其被配制用于注射、输注、摄入或跨膜运输。
23. -种下调哺乳动物细胞的DICER的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳 动物细胞中的可用度，和下调哺乳动物细胞的DICER。
24. -种减少哺乳动物癌细胞的迁移的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在哺乳 动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的迁移。
25. -种减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性的方法，包括增加 miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的EGFR化学疗法抗性。
26. -种减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性的方法，包括增加 miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减小哺乳动物癌细胞的吉非替尼抗性。
27. -种减少间充质标志物在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加 miR-103和 /或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和减少哺乳动物癌细胞的间充质标志物的表 达。
28. -种增加 E-钙粘蛋白在哺乳动物癌细胞中的表达的方法，包括增加 miR-103和/ 或miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的E-钙粘蛋白的表达。
29. -种诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化的方法，包括增加 miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
30. 权利要求26的方法，其中通过PKC-ε和/或DICER诱导间充质-上皮转化。
31. -种诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡的方法，包括增加 miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的程序化细胞死亡。
32. -种下调哺乳动物癌细胞的AKT/ERK的方法，包括增加 miR-103和/或miR-203在 哺乳动物癌细胞中的可用度，和诱导哺乳动物癌细胞的间充质-上皮转化。
33. -种增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性的方法，包括增加 miR-103和/或 miR-203在哺乳动物癌细胞中的可用度，和增加哺乳动物癌细胞的吉非替尼敏感性。
34. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞。
35. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是非小细胞肺腺癌细胞。
36. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述癌细胞是表皮癌细胞。
37. -种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤 生长的量的至少一种核酸，所述核酸选自：APAF-1的miR-221/222结合位点的分离的 核苷酸154至160 (5' -ATGTAGC-3'）；BM的miR-30b结合位点的分离的核苷酸288至 294(5'-TGTTTACA-3'）；与PKC-ε的miR-103结合位点的27至33互补的分离的核苷酸（互 补序列：3' -ACGACG-5'）；与PKC- ε的miR-103结合位点的核苷酸1517至1523互补的分离 的核苷酸（互补序列：3' -ACGACG);与PKC- ε的miR-103结合位点的核苷酸1564至1570 互补的分离的核苷酸（互补序列：3'-ACGACG-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核苷酸656 至662互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合位点的核 苷酸1116至1122互补的分离的核苷酸（互补序列：3'-UAAAGU-5'）；与SRC的miR-203结合 位点的核苷酸1595至1601互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）；和与SRC的 miR-203结合位点的核苷酸1706至1712互补的分离的核苷酸（互补序列：3' -UAAAGU-5'）。
38. -种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生 长的量的选自 5' -ATGTAGC-3'、5' -TGTTTACA-3'、3' -ACGACG-5' 和 3' -UAAAGU-5' 的核酸。
39. -种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生 长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
40. -种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生 长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
41. 一种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生 长的量的至少一种选自miR-103、miR-203、抗-miR-30和抗-miR-221的miR。
42. -种抑制需要肿瘤生长抑制的哺乳动物的肿瘤生长的方法，包括施用抑制肿瘤生 长的量的 miR-103、miR-203、抗-miR-30 和抗-miR-221。
43. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用化学疗法治疗。
44. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用肺癌化学疗法治疗。
45. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用表皮生长因子受体（EGFR)抑制剂。
46. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用酪氨酸激酶抑制剂（TKI)。
47. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用选自西妥昔单抗、帕木单抗、扎芦木 单抗、尼妥珠单抗和马妥珠单抗的单克隆抗体。
48. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用选自吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、 AP26113和马铃薯羧肽酶抑制剂的小分子。
49. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用吉非替尼。
50. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用PKC-ε表达激动剂。
51. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用MET抑制剂。
52. 本文权利要求的任一项的方法，其还包括施用SU11274。
53. 本文权利要求的任一项的方法，其还包施用DICER抑制剂。
54. 本文权利要求的任一项的方法，其还包施用E-钙粘蛋白表达激动剂。
55. 本文权利要求的任一项的方法，其还包施用佐剂、赋形剂和/或其它药学上可接受 的组合物。
56. 本文权利要求的任一项的方法，其中施用是通过注射、输注、摄入或跨膜运输进行 的。
57. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
58. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺癌。
59. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是肺腺癌。
60. 本文权利要求的任一项的方法，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌。
61. 本文权利要求的任一项的方法，其中肿瘤生长相较于对照减少至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%和至少60%。
62. -种促进需要伤口愈合促进的哺乳动物的伤口愈合的方法，包括施用促进伤口愈 合的量的本文权利要求的任一项的组合物。
63. -种包括本文权利要求的任一项的组合物的试剂盒。
64. -种包含本文权利要求的任一项的组合物的细胞。
65. -种包含本文权利要求的任一项的组合物的小鼠。
【文档编号】C12N15/11GK104302767SQ201280067179
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2012年12月10日 优先权日:2011年12月10日
【发明者】C·M·克劳斯, M·加罗法洛 申请人:俄亥俄州国家创新基金会