本发明涉及一种检测水中铜绿假单胞菌和toxa的引物，本发明还涉及一种检测水中铜绿假单胞菌及其重要毒力因子外毒素蛋白a，toxa的双重微滴式数字pcr检测试剂盒，本发明还涉及一种采用上述试剂盒检测食水中铜绿假单胞菌及toxa的方法。
背景技术：
铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿的环境。该菌是一种常见的环境微生物，因对营养要求不高，善于利用各种碳源和氨化化合物作为氮源，所以在水、土壤、食品以及医院等环境中广泛存在。美国、加拿大、欧洲、日本、巴西及世界卫生组织对饮用水中铜绿假单胞菌含量的限定mpn<3/l或每250ml不得检出。我国《食品安全国家标准包装饮用水》(gb19298-2014)，则规定5个水样中，每个样中250ml都不得检出铜绿假单胞菌。
2009年10月开始，《饮用天然矿泉水》等水相关的食品安全国家标准先后都将菌落总数这一指标删除。这一改革虽然具有实际意义，但客观来说，使得水生产企业简化了消毒程序，大大提高了铜绿假单胞菌超标概率。2015年9月23日，北京市食品药品监督管理局下架4款“铜绿假单胞菌”超标严重的纯净水、矿泉水。近年来，各地更是频现饮用水中铜绿假单胞超标的情况。
铜绿假单胞菌的急性感染过程中，细菌表面蛋白如鞭毛、脂多糖、粘多糖等促进细菌对宿主上皮细胞的黏附和定植，而细菌的扩散和组织损伤则主要由ⅱ型和ⅲ型分泌系统分泌的主要毒力因子、蛋白酶等所致。其中，外毒素a，即toxa由ⅱ型分泌系统产生，是铜绿假单胞菌最主要的致病因子，通过使靶细胞的延长因子-2核糖基化失活，从而抑制靶细胞的蛋白质合成，导致靶细胞的坏死。
饮用水生产质量的严格把控需要对铜绿假单胞菌准确、快速检测，同时对铜绿假单胞菌传播风险进行评估。本发明通过设计针铜绿假单胞菌和toxa基因的特异引物、探针组合，可了解水中铜绿假单胞菌的分布和菌株中toxa基因的流行情况。
目前，各类食品安全标准都要求对铜绿假单胞菌的进行定量检测，但对于铜绿假单胞菌的定量检测主要还是通过传统方法进行培养后计数，但传统方法存在过程繁琐，周期长等缺点。而常规pcr方法需要pcr扩增后进行电泳，不仅操作繁琐，而且不能实现定量检测。目前，southernblot和实时荧光定量pcr是常用的两种外源基因拷贝数分析技术，已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，southernblot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，结果容易偏小。荧光定量pcr在分析外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到dna纯度、引物和探针的浓度、反应抑制因子等诸多因素影响；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。
微滴数字pcr是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，它基于单分子pcr方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过pcr循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的基因拷贝数。
但基于微滴数字pcr平台的拷贝数的分析工作报道较少，针对铜绿假单胞菌及toxa基因的检测就更未见报道了。本发明基于微滴式ddpcr平台，建立了铜绿假单胞菌及其toxa基因拷贝数分析方法，研究结果为分析食品安全生物源性风险因子的定量检测提供了新的方法和借鉴，也为食品安全质量控制提供了一个技术支撑手段。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种引物且组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于双重ddpcr检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因的试剂盒；
本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因的方法，该方法操作简便、快速，检测结果准确。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种水中铜绿假单胞菌及toxa基因引物，其特征在于该引物的序列和探针序列分别为：
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
一种ddpcr检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒中反应体系包括以下组分：其中2×ddpcrsupermix10.0μl，铜绿假单胞菌和toxa正反向引物各0.1-1.0μl、探针各0.1-1.0μl，dna模板4.0μl。
一种ddpcr检测铜绿假单胞菌及toxa基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、提取样品dna；
b、将各反应组分加入上述20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；
c、将产生的微滴细全部转移到96孔反应板pcr反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通pcr仪进行pcr反应。
d、打开微滴荧光检测器应用软件，将pcr反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每pcr反应管中微滴的pcr反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。
如上所述检测铜绿假单胞菌及toxa基因的方法，其特征在于步骤b中pcr扩增的反应程序按以下步骤进行：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，60℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
如上所述检测铜绿假单胞菌及toxa基因的方法，其特征在于步骤a中所述提取样品dna的具体步骤如下：
50ml水样直接10000rpm立心10分钟，或者取50ml水样通过滤膜过滤，用镊子夹取滤膜在50ml的离心管用2ml超纯水冲洗后再10000rpm离心10分钟，去上清；加入5mlctab提取液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；后8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μl氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μl到新的2ml离心管中；加入2倍体积的ctab沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μlnacl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μl氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μlte溶液中。
本发明中敏感性和特异性试验：
采用测序等方法对阳性扩增产物进行测序验证，结果阳性扩增产物序列进行blast比较时，序列均与genbank目的序列高度同源。将10倍稀释的参考菌株基因组dna加入前述反应体系，重复试验显示检测样品过程中具有很好重复性。稀释模板浓度对数值和拷贝数值之间也呈良好的线性关系r2≥0.95。说明该方法具有较好的精确度和良好的稳定性。
本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1)本发明试剂盒组分和配比合理，使用方便，检测快捷，准确，适用于ddpcr定量检测铜绿假单胞菌及toxa基因；
2)本发明检测方法简化了检测流程，而且无需制作标准曲线，大大缩短了检测周期，检测时间比传统培养计数方法缩短两天左右；
3)本发明检测方法整个过程无需使用标准曲线，且与新一代测序无缝对接直接，对基因拷贝数可执行绝对定量分析。
4)数字pcr检测系统通过微滴化处理，可以大大减少背景和基质的干扰，灵敏度可以低至1个拷贝,因此,对低浓度基因浓度的细微变化进行准确及重复性佳的检测。
5)采用本发明检测方法在同一反应体系即可实现同时铜绿假单胞菌和toxa基因进行精准检测，操作简便、快速。具有较好产业化前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
本发明检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因的引物，序列分别为：
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
实施例2
本发明一种检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因的试剂盒，其中20μl反应体系包括以下组分：
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，铜绿假单胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。
其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
实施例3
本发明检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因方法，包括以下步骤：
a、提取样品dna；
b、将各反应组分加入上述20.0μl反应体系，然后加入70.0μl矿物油，混匀后转移到微滴发生器上自动产生微滴；
c、将产生的微滴仔细全部转移到96孔反应板pcr反应管中；再将96孔反应板在封膜仪上封膜，并置于普通pcr仪进行pcr反应。
d、打开微滴荧光检测器应用软件，将pcr反应结束后的96孔反应板直接插入设备，检测每pcr反应管中微滴的pcr反应情况,最后根据珀松分布定律算出待测基因的拷贝数。
其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
所述的荧光pcr扩增按以下步骤进行：
(1)(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，60℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
实施例4
本发明检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因方法，包括以下步骤：
50ml水样直接10000rpm立心10分钟，或者取50ml水样通过滤膜过滤，用镊子夹取滤膜在50ml的离心管用2ml超纯水冲洗后再10000rpm离心10分钟，去上清；加入5mlctab提取液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；后8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μl氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μl到新的2ml离心管中；加入2倍体积的ctab沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μlnacl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μl氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，铜绿假单胞菌和toxa正反向引物各1.0μl、探针各1.0μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
进行pcr扩增，按以下步骤进行：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，60℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
实施例5
本发明检测水中铜绿假单胞菌及toxa基因方法，包括以下步骤：
50ml水样直接10000rpm立心10分钟，或者取50ml水样通过滤膜过滤，用镊子夹取滤膜在50ml的离心管用2ml超纯水冲洗后再10000rpm离心10分钟，去上清；加入5mlctab提取液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；后8000r/min室温离心10min，取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μl氯仿后用力振荡，13000g离心10min，转移上清液600μl到新的2ml离心管中；加入2倍体积的ctab沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μlnacl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μl氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清，加入500μl70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μlte溶液中。
其中2×ddpcrsupermix10.0μl，铜绿假单胞菌和toxa正反向引物各0.1μl、探针各0.1μl，dna模板4.0μl。其中引物序列如下:
上游引物p.af:tggtagtccacgccgtaaa
下游引物p.ar:cagactgcgatccggactacg
探针p.ap:tcgaccgcctggggagtacg
上游引物toxaf：ggctatgtgttcgtcggcta
下游引物toxar：ttactttaggtcctcgcgcg
探针toxap：ggctacgcccaggaccagga
进行pcr扩增，按以下步骤进行：
(1)94℃预变性3min；
(2)94℃变性10s，60℃退火1min，共进行40个循环；
(3)98℃酶热失活10min；
(4)4℃停止反应。
结果分析
本发明研制过程中，同时采用培养基的传统培养方法，进行铜绿假单胞菌数量测定的对照。实验重复三次，铜绿假单胞菌结果取平均值。结果显示，本发明采用数字pcr方法对水中铜绿假单胞菌的拷贝数，与传统培养方法检测出的菌落总数结果相关系数r2≥99％。另外，本发明数字pcr尽欢方法的单样本全程检测时间为4小时，远短于现有传统的平板培养计数方法，且检测铜绿假单胞菌同时，还能对其toxa进行定量检测，能够准确评价致病菌传播风险，因此具有良好的技术优势和产业化发展前景。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
sequencelisting
<110>中山检验检疫局检验检疫技术中心
<120>检测水中铜绿假单胞菌和toxa的引物、试剂盒和方法
<130>检测水中铜绿假单胞菌和toxa的引物、试剂盒和方法
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>1
tggtagtccacgccgtaaa19
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>2
cagactgcgatccggactacg21
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>3
tcgaccgcctggggagtacg20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>4
ggctatgtgttcgtcggcta20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>5
ttactttaggtcctcgcgcg20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>pseudomonasaeruginosa
<400>6
ggctacgcccaggaccagga20