本发明涉及一组环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的引物和试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)原称绿脓杆菌，是一种高致死率、溶血性、抗药性强的革兰氏阴性杆菌，在分类上属假单胞菌科中的假单胞菌属，此菌属种类多达200种以上，在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。本菌最主要的生长条件是潮湿环境，其它条件要求不高。纺织品极易吸潮，具备铜绿假单胞菌生长的所有因素，能够提供其繁殖的理想环境，包括合适的ph，温度及水营养，也能提供其繁殖所需的大表面积。因此纺织品中一旦污染铜绿假单胞菌，该菌会顽强地吸附在纤维上，一般的清洗、曝晒是消灭不了的。
铜绿假单胞菌可暂时寄生于皮肤，因此接触性体表感染率相当高，能引起人中耳炎、角膜炎、尿道炎和下呼吸道感染，亦可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸，甚至通过血流导致败血症，可引起病人死亡。
铜绿假单胞菌检测有多种方法，常见的主要有传统标准方法、全自动微生物分析系统分析法、分子生物学方法(常规pcr法、多重pcr法、pcr-dhplc法、real-timepcr法、基因芯片技术)、免疫学方法(免疫磁性分离法、荧光激活细胞分离法、酶联免疫吸附法)、蛋白多肽检测方法等。传统检测方法程序繁琐、周期长、灵敏度低。免疫学方法制备抗体较困难、不能同时检测多种成分，对实验人员技巧性要求高，易出现交叉污染。分子生物学方法具有高灵敏度、准确、快速等优点，但需要专门仪器设备，易污染，对检验人员要求较高。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的引物和试剂盒。
环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的引物，引物序列如下：
外侧引物对f3和b3：
上游引物f3：gctcgtacggagatacagcc；
下游引物b3：tgttcaccgtttgtattggcg；
内侧引物对fib和bip：
上游引物fip：
gtcgaatccctttaggacggagaccctttcgaacgcggggaatggcc；
下游引物bip:
aagttcacactgtggaggagcaacccaatagacccgagccatgtttcc
利用上述引物，本发明还提供一种铜绿假单胞菌基因快速诊断试剂盒，包括bstdna聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成。
反应液：每1l反应液中含有1.6～2mmoldntp、20～25mmoltris-hcl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25mltritonx-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物fip/bip各1.6～2mol和外引物f3/b3各0.2～0.25mol。
每1l样品预处理液中含有10～20mmolph8.0的tris-hcl、1～2mmoledta和10～12mltritonx-100。
显色剂：为10％的荧光染料sybrgreeni。
阳性对照液：铜绿假单胞菌基因组dna。
本发明的有益效果：
现有技术中国专利cn102134601a公开了一种种铜绿假单胞菌的环介导等温扩增检测引物、检测方法和检测试剂盒，该发明针对铜绿假单胞菌的ecfx基因，设计和筛选了一套特异性检测引物组以及含有该检测引物组的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过lamp的检测。
与现有技术相比，本发明在其基础上，也是利用ecfx基因设计了一组新的引物。通过两组引物的对比实验，本发明的引物具有更好的灵敏度高。
具体实施方式
实施例1
环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的引物，引物序列如下：
外侧引物对f3和b3：
上游引物f3：gctcgtacggagatacagcc；
下游引物b3：tgttcaccgtttgtattggcg；
内侧引物对fib和bip：
上游引物fip：
gtcgaatccctttaggacggagaccctttcgaacgcggggaatggcc；
下游引物bip:
aagttcacactgtggaggagcaacccaatagacccgagccatgtttcc
利用上述引物，本发明还提供一种铜绿假单胞菌基因快速诊断试剂盒，包括bstdna聚合酶、反应液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成。
反应液：每1l反应液中含有1.6～2mmoldntp、20～25mmoltris-hcl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25mltritonx-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物fip/bip各1.6～2mol和外引物f3/b3各0.2～0.25mol。
每1l样品预处理液中含有10～20mmolph8.0的tris-hcl、1～2mmoledta和10～12mltritonx-100。
显色剂：为10％的荧光染料sybrgreeni。
阳性对照液：铜绿假单胞菌基因组dna。
实施例2特异性验证
收集铜绿假单胞菌20株及非铜绿假单胞菌30株，将这些菌株分别在营养肉汤(副溶血性弧菌在3.5％氯化钠营养肉汤)37℃培养24h后，取1ml菌液，按照实施例1的提供的引物和现有技术中的环介导等温扩增技术提取各个细菌的dna，并分别进行lamp扩增和加入显色剂观察。
结果如下：本发明的检测引物具有较好的特异性，只有铜绿假单胞菌菌株扩增阳性，其他非铜绿假单胞菌菌株为阴性。
实施例3灵敏度对比验证
按照现有技术中国专利cn102134601a公开的检测方法和检测引物进行实验，并与本发明提供的引物进行灵敏度对比实验。
以铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosaatcc27853为参考菌株，将其在lb培养基中37℃培养24h后，取1ml菌液，用灭菌生理盐水进行10倍梯度稀释，选取5个稀释度进行平板计数。
取经平板计数细菌数分别为：
0.01cfu/ml、0.05cfu/ml、0.25cfu/ml、1.25cfu/ml、6.25cfu/ml。
按照现有技术中国专利cn102134601a公开的检测方法提取细菌dna，进行lamp扩增，加入显色剂显色观察，验证灵敏度。
经过5次重复实验，其中现有技术中国专利cn102134601a公开的检测方法和检测引物，5次实验结果灵敏度为1.25cfu/ml。
本发明提供的引物，3次实验结果灵敏度为0.25cfu/ml，2次实验结果灵敏度为1.25cfu/ml。
与现有技术的引物相比，灵敏度更高。
sequencelisting
<110>赵吉光
<120>环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌的引物和试剂盒
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primerf3
<400>1
gctcgtacggagatacagcc20
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primerb3
<400>2
tgttcaccgtttgtattggcg21
<210>3
<211>47
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>primerfip
<400>3
gtcgaatccctttaggacggagaccctttcgaacgcggggaatggcc47
<210>4
<211>48
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<223>bip
<400>4
aagttcacactgtggaggagcaacccaatagacccgagccatgtttcc48