专利名称：脱氮假单胞菌发酵生产维生素b12的培养基及发酵方法
技术领域：
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基及发酵方法。
背景技术：
维生素B12为钴胺素类化合物，主要用于治疗恶性贫血，亦与叶酸合用用于治疗各种巨幼红细胞性贫血、抗叶酸药引起的贫血及脂肪泻。还用于神经系统疾病(如神经炎、神经萎缩)的治疗等。目前国内外商品化的维生素B12几乎都是通过微生物发酵进行生产的。其中以脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的生产原辅料主要利用甜菜糖蜜、蔗糖等碳、氮源及少量无机盐组成的培养基进行液体深层发酵，中间采用流加补料方式，再经多步提炼、精制而成。 甜菜糖蜜作为维生素B12生产的主要原料，对维生素B12的正常发酵生产起着重要作用。但是，一直以来，甜菜糖蜜由于受人工种植及采收季节的影响，产品质量波动大。甜菜糖蜜生产的季节性也特别强，每年的十月至次年的三月为甜菜糖蜜的产出季节，供应量较充足，糖蜜新鲜，质量较好，剩余的6个月时间甜菜糖蜜的产出量明显不足，这严重制约着维生素^2 的工业化生产；而且甜菜糖蜜因甜菜产地不同而质量差异较大，对维生素B12的发酵单位影响较大；另外，糖蜜的贮存、运输成本也较高。因此，提供一种可替代甜菜糖蜜的原料对于稳定维生素B12工业化生产具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可替代甜菜糖蜜，质量稳定，来源不受季节限制，供应充足，实现维生素B12稳定、有效生产的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基；
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产维生素B12的发酵方法。为实现上述目的所采取的技术方案为
一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成；
上述一级种子培养基的组成为麦芽糖2. 0 2. ^g/m3，硫胺素0. 007 0. 008kg/m3, 核黄素0. 007 0. 008 kg/m3，生物素0. 007 0. 008kg/m3，5，6-二甲基苯并咪唑0. 018 0. 022 kg/m3,硫酸锌 0. 04 0. 05 kg/m3,氧化镁 0. 018 0. 022kg/m3，玉米浆 14. 0 16. OL/m3,磷酸氢二铵 0. 040 0. 045 kg/m3,碳酸钙 0. 02 0. 03 kg/m3 和甜菜碱 0. 10 0. 11 kg/m3 ；
上述二级种子培养基的组成为麦芽糖2. 6 2. Ag/m3，硫胺素0. 008 0. 009kg/m3, 核黄素0. 008 0. 009 kg/m3,生物素0. 008 0. 009kg/m3，5，6- 二甲基苯并咪唑0. 07
30. 08kg/m3，硫酸锌 0. 005 0. 006kg/m3，氧化镁 0. 02 0. 03kg/m3，玉米浆 20. 0 22. OL/ m3,甜菜碱 0. 30 0. 32kg/m3,磷酸氢二铵 0. 04 0. 05kg/m3,碳酸钙 0. 08 0. 09kg/m3 和尿素 0. 004 0. 005 kg/m3 ；
上述发酵培养基的组成为麦芽糖4. 2 4. 3kg/m3，硫胺素0. 013 0. 015kg/m3,核黄素0. 013 0. 015 kg/m3，生物素0. 013 0. 015 kg/m3, 5, 6-二甲基苯并咪唑0. 09 0. 10kg/m3，甘油磷酸 0. 50 0. 55kg/m3，硫酸锌 0. 005 0. 006 kg/m3,氯化钴 0. 0001 0. 0002kg/m3,玉米浆 30. 0 32. OL/m3,碳酸钙 0. 07 0. 08kg/m3,尿素 0. 01 0. 02kg/m3, 磷酸氢二铵0. 04 0. 06 kg/m3,甜菜碱2. 4 2. 6kg/m3和氧化镁0. 04 0. 06kg/m3 ； 一种利用上述培养基的发酵方法，其工艺步骤包括
1)一级种子培养首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子接入其中进行培养，接种量控制在培养基体积的5 - 10% ；培养条件为罐压0. 04 0. 05MPa ；罐温四 33°C ；空气流量3 8m3/ h ；培养时间20 30小时；
2)二级种子培养先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养；培养条件为罐压0. 04 0. 05MPa ；罐温四 33°C ； 空气流量3 8m3/h ；培养时间60 80小时；
3)发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养；培养条件为罐压0. 05 0. 06MPa ；罐温30 33°C;空气流量10 15m3/h ；培养时间约为160 200小时，在发酵过程中，当总糖含量低于7%时进行补料，补料时加入人工糖蜜，维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。本发明是基于下面阐述的甜菜糖蜜影响维生素B12发酵效价的因素而设计的
1)甜菜糖蜜中的粗蛋白主要是由氨、酰胺及硝酸盐等组成。当粗蛋白含量过高超过4% 以上时，会促使菌体细胞加速生长，减少了代谢产物的合成。2)甜菜糖蜜中的氨基酸是维生素B12发酵过程中非必需的氨基酸，因此其蛋白质对合成维生素B12生物学价值较低。3)甜菜糖蜜中的胶体主要为木糖胶、阿拉伯糖胶和果胶等，不是维生素B12发酵过程中所需的有用物质。4)甜菜糖蜜所含糖类主要是蔗糖，是维生素B12发酵中的基础碳源，是构成菌体细胞和代谢产物的主要营养元素。甜菜糖蜜中合理的总糖含量是决定维生素B12效价的关键因素之一。目前，国内市场购买的甜菜糖蜜中总糖的含量偏低。5)甜菜糖蜜的生产厂家为了保证其微生物含量控制在一定的范围内，通常加入防腐剂。该防腐剂能够抑制脱氮假单胞菌的菌体生长。故而，本发明通过采用由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，优化其培养基配方，从而解决了因甜菜糖蜜质量不稳定导致发酵效价波动范围大的问题，并获得了一种稳定、有效地生产维生素B12的方法。其发酵单位达到180mg/L，而采用甜菜糖蜜，其它原辅料配伍比例不变，维生素B12的发酵单位为仅为140 160mg/L。本发明节约了原辅料用量，降低综合成本，减少废水排放。
具体实施例方式
4
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。下述实施例为脱氮假单胞杆菌母瓶种子采用目前常规的培养方法。实施例1
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. 0kg、硫胺素7g、核黄素7g、生物素7g)、玉米浆14L、氧化镁18g、5，6- 二甲基苯并咪唑18g、磷酸氢二铵40g、硫酸锌4g、碳酸钙20g，甜菜碱100g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力 0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 2Wcg、硫胺素80g、核黄素80g、生物素80g)、玉米浆200L、甜菜碱3kg、氧化镁200g、磷酸氢二铵400g、硫酸锌50g、碳酸钙800g、5，6-二甲基苯并咪唑700g、尿素40g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖420kg、硫胺素1. 3kg、核黄素1. 3kg、生物素1. 3kg)、玉米浆3000L、5，6- 二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙Ag、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg， 甜菜碱MOkg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度122 1230C ；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 198，摇瓶效价23%ig/ L)的脱氮假单胞菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的5. 4%,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33°C ；空气流量6m3/h ；培养时间约为24. 7小时。种子培养基OD 0. 210 ；pH :7. 3。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 210)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7m3/h ；培养时间 71. 4h。种子培养基 OD :0. 394 ；pH :7. 2。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 394)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量14. 3 m3/h ；培养时间为185. 4h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黄素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。 发酵过程中每隔6 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。发酵结束，维生素B12发酵单位为18;3mg/L。实施例2
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黄素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米浆15L、氧化镁20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氢二铵42g、硫酸锌4. 5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g)、玉米浆210L、甜菜碱3. 1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间32分钟， 冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖42^g、硫胺素1. 4kg、核黄素1. 4kg、生物素1. 4kg)、玉米浆3100L、5，6- 二甲基苯并咪唑9. 5kg、磷酸氢二铵41kg、硫酸锌550g、碳酸钙7. ^g、甘油磷酸52kg、氧化镁^g、氯化钴150kg、尿素 1. 5kg,甜菜碱250kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度 122 123°C ；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 214，摇瓶效价236mg/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的5. 8%,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33 °C ；空气流量6m3/h ；培养时间约为24. 2小时。种子培养基OD 0. 283 ；pH :7. 2。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 283)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7m3/h ；培养时间 71. 7h。种子培养基 OD :0. 421 ；pH :7. 3。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 421)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量14. 5m3/h ；培养时间为178. 6h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黄素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009kg/m3)。 发酵过程中每隔6 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。发酵结束，维生素B12发酵单位为196mg/L。实施例3
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. ^g、硫胺素Sg、核黄素Sg、生物素Sg)、玉米浆16L、氧化镁22g、5，6- 二甲基苯并咪唑22g、磷酸氢二铵45g、硫酸锌5g、碳酸钙30g，甜菜碱110g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力 0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 2Ag、硫胺素90g、核黄素90g、生物素90g)、玉米浆220L、甜菜碱3. ^g、氧化镁300g、磷酸氢二铵500g、硫酸锌60g、碳酸钙900g、5，6-二甲基苯并咪唑800g、尿素50g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖430kg、硫胺
6素1. 5kg、核黄素1. 5kg、生物素1. 5kg)、玉米浆3200L、5，6- 二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵42kg、硫酸锌600g、碳酸钙^ig、甘油磷酸55kg、氧化镁meg、氯化钴200kg、尿素^ig, 甜菜碱^Okg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度122 1230C ；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 205，摇瓶效价231mg/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6. 1%,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33 °C ；空气流量6m3/h ；培养时间约为25小时。种子培养基OD 0. 225 ；pH :7. 3。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 433)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32 °C;空气流量 7m3/h ；培养时间 71. 4h。种子培养基 OD :0. 278 ；pH :7. 4。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 433)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量14. 8 m3/h ；培养时间为181h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009，核黄素0. 008 0. 009，生物素0. 008 0. 009)。发酵过程中每隔6 7h 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。发酵结束，维生素B12发酵单位为185mg/L。实施例4
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黄素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米浆15L、氧化镁20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氢二铵42g、硫酸锌4. 5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压， 压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g)、玉米浆210L、甜菜碱3. 1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间32分钟， 冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖42^g、硫胺素1.4kg、核黄素1.4kg、生物素1.4kg)、玉米浆3100L、5，6-二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵41kg、硫酸锌550g、碳酸钙7. 4kg、甘油磷酸53kg、氧化镁5. ^g、氯化钴140kg、尿素1. ^g，甜菜碱^Okg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度 122 1230C ；时间37分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 216，摇瓶效价23%ig/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6. 2 %,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33°C;空气流量6. 2m3/h ；培养时间约为24. 6小时。种子培养基OD 0. 290 ；pH :7. 3。
二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 290)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7. 2m3/h ；培养时间 70. 8h。种子培养基 OD :0. 417 ；pH :7. 4。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 417)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量14. lm3/h ；培养时间为177h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7 kg/m3， 硫胺素 0. 008 0. 009 kg/m3，核黄素 0. 008 0. 009 kg/m3，生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。 发酵过程中每隔6 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。发酵结束，维生素B12发酵单位为198mg/L。实例 5
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. 1kg、硫胺素7. 5g、核黄素7. 5g、生物素7. 5g)、玉米浆15L、氧化镁20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、 磷酸氢二铵42g、硫酸锌4. 5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压， 压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 26. ^g、硫胺素85g、核黄素85g、生物素85g)、玉米浆210L、甜菜碱3. 1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5，6-二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间31分钟， 冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖420kg、硫胺素1. 3kg、核黄素1. 3kg、生物素1. 3kg)、玉米浆3000L、5，6- 二甲基苯并咪唑9kg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙Ag、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg， 甜菜碱MOkg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度122 1230C ；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 212，摇瓶效价23;3mg/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6. 1%,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33 °C ；空气流量6. 2m3/h ；培养时间约为24. 8小时。种子培养基OD 0. 292 ；pH :7. 3。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 292)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7. lm3/h ；培养时间 71. 2h。种子培养基 OD :0. 418 ；pH :7. 4。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 418)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量:14m3/h ；培养时间为178. Ih0补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黄素 0. 008 0. 009 kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。发酵
8过程中每隔6 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在 7 7. 5%ο发酵结束，维生素B12发酵单位为18;3mg/L。实例6
一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖2. 1kg、硫胺素7. 6g、核黄素7. 5g、生物素7. 6g)、玉米浆15. 8L、氧化镁21g、5，6- 二甲基苯并咪唑 22g、磷酸氢二铵42. 3g、硫酸锌4. 4g、碳酸钙^g，甜菜碱106g。完成配料后进行灭菌处理， 灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖 26. meg、硫胺素86g、核黄素85g、生物素85g)、玉米浆211. 4L、甜菜碱3. 1kg、氧化镁251g、 磷酸氢二铵452g、硫酸锌55g、碳酸钙851g、5，6-二甲基苯并咪唑759g、尿素46g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 灭菌时间31分钟， 冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入人工糖蜜(其中麦芽糖430kg、硫胺素1. 5kg、核黄素1. 5kg、生物素1. 5kg)、玉米浆3200L、5，6- 二甲基苯并咪唑10kg、磷酸氢二铵42kg、硫酸锌600g、碳酸钙^ig、甘油磷酸5^g、氧化镁meg、氯化钴200kg、尿素^ig, 甜菜碱^Okg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度122 1230C ；时间37分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 214，摇瓶效价23;3mg/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6. 3 %,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33°C ；空气流量6. 4m3/h ；培养时间约为24. 7小时。种子培养基OD 0. 296 ；pH :7. 2。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 296)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7. 4m3/h ；培养时间 70. 7h。种子培养基 OD :0. 409 ；pH :7. 3。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 409)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量14. 2m3/h ；培养时间为178. 6h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入人工糖蜜(麦芽糖2. 6 2. 7，硫胺素 0. 008 0. 009kg/m3,核黄素 0. 008 0. 009kg/m3,生物素 0. 008 0. 009 kg/m3)。发酵过程中每隔6 检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在 7 7. 5%ο发酵结束，维生素B12发酵单位为189mg/L。对比实例以甜菜糖蜜工艺为培养基配方，用脱氮假单胞杆菌发酵生产维生素B12 一级种子培养基配制过程在Im3 —级种子罐中加入甜菜糖蜜3. 4kg，玉米浆15L、氧化
镁20g、5，6- 二甲基苯并咪唑20g、磷酸氢二铵42g、硫酸锌4. 5g、碳酸钙25g，甜菜碱105g。 完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 122°C ；灭菌时间 32分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0. 01-0. 02MPa，等待接种。
二级种子培养基制备过程在IOm3 二级种子罐中加入甜菜糖蜜4^ig、玉米浆 210L、甜菜碱3. 1kg、氧化镁250g、磷酸氢二铵450g、硫酸锌55g、碳酸钙850g、5，6- 二甲基苯并咪唑750g、尿素45g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力0. 10 0. 14MPa ；温度120 ；灭菌时间31分钟，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01-0. 02MPa，等待移种。发酵培养基制备过程在IOOm3发酵罐中加入甜菜糖蜜680kg、玉米浆3000L、5， 6- 二甲基苯并咪唑^cg、磷酸氢二铵40kg、硫酸锌500g、碳酸钙Ag、甘油磷酸50kg、氧化镁4kg、氯化钴100kg、尿素1kg，甜菜碱MOkg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件压力 0. 10 0. 14MPa ；温度122 123°C ；时间38分钟。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在 0. 01-0. 02MPa，等待移种。一级种子培养过程控制将符合接种条件(无杂菌，OD为0. 211，摇瓶效价23%ig/ L)的脱氮假单胞杆菌母瓶种子在火焰保护下，由接种口接入母瓶种子，接种量控制在种子培养基体积的6. 2%,罐压控制在0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 33 °C ；空气流量6. 3m3/h ；培养时间约为27. 2小时。种子培养基OD 0. 186 ；pH :7. 1。二级种子培养过程控制符合移种条件(无杂菌，OD为0. 186)的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。培养条件罐压0. 04 - 0. 05MPa ；罐温四 32°C;空气流量 7. 3m3/h ；培养时间74.讣。种子培养基OD :0. 313 ；pH :7. 2。发酵培养基过程控制将符合移种条件(无杂菌，OD为0. 313)的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。培养条件罐压控制在0. 05 - 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量:14m3A ；培养时间为189. 3h。补料控制发酵过程中进行补料，补料时加入甜菜糖蜜。发酵过程中每隔6 几检测总糖。当总糖含量低于7%进行补料。维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。发酵结束，维生素B12发酵单位为16;3mg/L。
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权利要求
1.一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成。
2.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述一级种子培养基的组成为麦芽糖2. 0 2. ^g/m3，硫胺素0. 007 0. 0(^kg/m3，核黄素 0.007 0.008 kg/m3，生物素 0. 007 0. 008kg/m3，5，6-二甲基苯并咪唑 0. 018 0. 022 kg/m3，硫酸锌 0. 04 0. 05 kg/m3,氧化镁 0. 018 0. 022kg/m3，玉米浆 14. 0 16. OL/m3， 磷酸氢二铵0. 040 0. 045 kg/m3,碳酸钙0. 02 0. 03 kg/m3和甜菜碱0. 10 0. 11 kg/3m 。
3.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述二级种子培养基的组成为麦芽糖2. 6 2. Ag/m3，硫胺素0. 008 0. 0(Wkg/m3，核黄素 0. 008 0. 009 kg/m3,生物素 0. 008 0. 009kg/m3，5，6- 二甲基苯并咪唑 0. 07 0. 08kg/ m3,硫酸锌 0. 005 0. 006kg/m3,氧化镁 0. 02 0. 03kg/m3,玉米浆 20. 0 22. OL/m3,甜菜碱0. 30 0. 32kg/m3，磷酸氢二铵0. 04 0. 05kg/m3，碳酸钙0. 08 0. 09kg/m3和尿素 0. 004 0. 005 kg/m3。
4.按照权利要求1所述的脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基，其特征在于上述发酵培养基的组成为麦芽糖4. 2 4. 3kg/m3,硫胺素0. 013 0. 015kg/m3,核黄素0. 013 0.015 kg/m3，生物素 0.013 0.015 kg/m3, 5, 6-二甲基苯并咪唑 0. 09 0. 10kg/m3，甘油磷酸 0. 50 0. 55kg/m3，硫酸锌 0. 005 0. 006 kg/m3,氯化钴 0. 0001 0. 0002kg/m3,玉米菜 30. 0 32. OL/m3,碳酸钙 0. 07 0. 08kg/m3,尿素 0. 01 0. 02kg/m3,磷酸氢二铵 0. 04 0. 06 kg/m3,甜菜碱 2. 4 2. 6kg/m3 和氧化镁 0. 04 0. 06kg/m3。
5.一种利用权利要求1至4任意一项培养基的发酵方法，其工艺步骤包括1)一级种子培养首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的脱氮假单胞菌母瓶种子接入其中进行培养，接种量控制在培养基体积的5 — 10% ；2)二级种子培养先将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。3)发酵培养先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。
6.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述一级种子培养条件为罐压 0. 04 0. 05MPa ；罐温四 33°C ；空气流量3 &ii7h ；培养时间20 30小时。
7.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述二级种子培养条件为罐压 0. 04 0. 05MPa ；罐温四 33°C ；空气流量3 &ii7h ；培养时间60 80小时。
8.按照权利要求5所述的发酵方法，其特征在于所述发酵培养条件为罐压0.05 0. 06MPa ；罐温30 33°C ；空气流量10 15m7h ；培养时间约为160 200小时。
9.按照权利要求8所述的发酵方法，其特征是在发酵过程中，当总糖含量低于7%时进行补料，补料时加入人工糖蜜，维持发酵液总糖含量控制在7 7. 5%。
全文摘要
本发明涉及一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的培养基及发酵方法及利用其生产维生素B12的方法，该培养基包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于上述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基中均含有人工糖蜜，该人工糖蜜是由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成。本发明通过采用由麦芽糖、硫胺素、核黄素和生物素组成的人工糖蜜替代甜菜糖蜜，优化其培养基配方，从而解决了因甜菜糖蜜质量不稳定导致发酵效价波动范围大的问题，并获得了一种稳定、有效地生产维生素B12的方法。本发明节约了原辅料用量，降低综合成本，减少废水排放。
文档编号C12P19/42GK102453740SQ201110419838
公开日2012年5月16日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者任勇, 冷晓红, 奇乃, 王友善, 董媛 申请人:宁夏多维药业有限公司