施氏假单胞菌及其培养、固定化和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株施氏假单胞菌及其培养、固定化和应用。该菌株为施氏假单胞菌（Pseudomonasstutzeri）WZUF25，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC?NO.7685。该菌株进行好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，不仅对NO3--N和NO2--N的去除率高，而且具有很高的同化NH4+-N能力，可为同步硝化和反硝化提供种源。本发明同时提供采用活性炭-海藻酸钙包埋法制备的固定化施氏假单胞菌，其同样具有良好的去除NO3--N的能力和稳定性。
【专利说明】施氏假单胞菌及其培养、固定化和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境微生物领域，具体涉及一株施氏假单胞菌及其培养、固定化和应 用。
【背景技术】
[0002]氮素给环境造成的污染问题近年来日益突出，其危害性也日益被人们认识和重 视。如氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮有可能转化为致癌、致突变和致畸的亚硝胺；又如氮素 流入水体造成水体富营养化，引起水质恶化乃至湖泊退化。生物脱氮具有处理效果好、处理 过程稳定可靠、操作管理方便等的优点而得到广泛应用。
[0003]传统脱氮理论认为废水生物脱氮必须是铵态氮经历典型的硝化与反硝化过程，即 废水中的铵态氮首先被氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌在好氧条件下依次氧化为亚硝酸 盐氮、硝酸盐氮，然后由反硝化细菌在厌氧或兼氧条件下将硝酸盐氮依次还原为亚硝酸盐 氮、氮气或氮氧化物。传统认识上的反硝化菌在有氧条件下优先利用氧气作为电子受体，只 有在缺氧条件下硝酸盐才会代替氧气作为最终电子受体进行反硝化作用。
[0004]20世纪80年代,Robertson和Kuene在除硫和反硝化处理系统中首次分离到好氧 Thiosphaera pan to tropha (% Paracoccus pan to trophus )、
Pseudomonas spp. JkAlcaligenes /aecaJis,至今已有许多好氧反硝化菌被分离 获得，现已报道的好氧反硝化细菌大多分布于假单胞菌属（Pseudomonas)、芽孢杆菌属 (Bacillus)和产碱菌属（Alcaligenes)等土壤、废水常见种属中，而且发现好氧反硝化菌 大多表现异氧硝化的特性。但分离自不同环境的菌株，其生理特性和除氮能力各具特色，它 们可为实际应用或进一步的菌株改造提供丰富的种源。如李小龙等从鱼塘水样中分离到1 株不动杆菌i Acinetobacter sp.)，以KN03、（ NH4)2 S04、NaN02为唯一氮源的培养液中，可 在24 h内将培养液中NCV-N从161. 61 mg ? I71降至55. 69 mg ? L'去除速率为4. 41 mg ? L 1 h 1 N03 -N ；15 h 内将 NH 4+ _N 由 220. 24 mg ? L 1 降至 14. 78 mg ? L S 去除速率 为 13. 70 mg *L :h 1 NH: - N ；12 h 内 N02 _N 浓度由 101. 27 mg *L 1 降至 21. 85 mg *L 1, 去除速率为e.eZmg.L—V1 N02--N;但其脱氮的适宜pH为偏碱性的；20°C时不生长，40°C时 在NH4+-N测定液中生长缓慢，在N02_-N测定液中不生长，最佳生长温度为30°C (微生物学 报，2011，51 (8) : 1062-1070)。
[0005]好氧反硝化和异养硝化的发现打破了传统的生物脱氮理论，使得同步硝化和反硝 化成为可能。迄今为止，对于异养硝化、好氧反硝化的机理尚有待继续深入研究，对异养硝 化菌和好氧反硝化菌的应用还很少，但因其在脱氮方面的独特优势，从长远看必将得到广 泛的应用，因此选育优良性能的菌株为实际应用提供种源具有重要的实际意义。
[0006]固定化细胞技术用于废水生物处理与传统的悬浮生物处理法相比，能纯化和保持 高效菌种，微生物浓度高，污泥产量少，固液分离效果好。因此，该项技术在废水生物处理， 尤其是在特种水处理领域中，获得了广泛的研究。固定
化细胞技术已用于B0D物质的去除、硝化一反硝化、脱磷、去酚、氰的降解、LAS降解、重金属离子的去除与回收以及印染废水的脱色处理等。近年来，固定化硝化菌脱氮技术已经从实验室和小规模试验阶段进入大规模的生产性试验阶段。目前，固定化好氧反硝化菌脱氮技术还处于实验室和小规模试验阶段。
【发明内容】
[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供一株好氧反硝化菌，其特点为该菌株为采用常规分离方法从采自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥中分离获得，经过16SrDNA序列测定并将测序结果通过GeenBank Blast进行比对分析,与stutzeri的同源性为 99.9%，编为 A stutzeri WZUF25。
[0008]本发明提供的一株施氏假单胞菌，该菌株为施氏假单胞菌iPseudomonass tutzeri ) WZUF25 ,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7685。
[0009]本发明提供上述施氏假单胞菌的培养方法，包括如下步骤:
.1)保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，培养12h以上，离心，得菌体，用无菌水洗涤后制成OD680为0.900~1.000的菌悬液；
.2)步骤I)所得菌悬液接种于反硝化培养基中进行培养；
其中，所述反硝化培养基的构成为:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠、甘油或葡萄糖，所述氮源为含硝酸根离子的化合物。
[0010]优选地，步骤2)中所述反硝化培养基的配方为:碳源，氮源中硝酸根的质量
.1.228g, K2HPO4 lg, FeSO4.7H20 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000 mL, pH 为 5~9，所述碳源与氮源的NO3-的质量比为5:1.228~15:1.228。
[0011]作为优选技术方案，步骤I)保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，于20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg* L-1的条件下培养；步骤2)中所得菌悬液接种于反硝化培养基中，于.25~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.I71下培养。
[0012]作为优选技术方案，步骤2)中所述反硝化培养基的pH 5~9。
[0013]优选地，所述菌悬液以5%的体积比接种于反硝化培养基中。
[0014]本发明提供上述的施氏假单胞菌的应用，其特征在于，将所述施氏假单胞菌WZUF25接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
[0015]作为优选技术方案，所述含氮水溶液为含有NH4+、N03_和N02_的一种或其组合的水溶液，所述施氏假单胞菌WZUF25脱NCV-N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。含氮水溶液中的氮源只为NH/-N时，碳源与含氮废水中NH4+的质量比优选为5:0.0.3-15:0.34 ;含氮水溶液中的氮源只为Ν03_时，碳源与含氮废水中Ν03_的质量比为5:1.228~15:1.228 ;含氮水溶液中的氮源只为Ν02__Ν时，碳源与含氮废水中Ν02_的质量比为5:0.67~15:0.67。
[0016]作为优选技术方案，所述含氮水溶液pH为4~10，所述施氏假单胞菌WZUF25于温度20°C~45°C，溶氧为1.3~7.3mg.L—1的条件下对含氮水溶液进行脱氮。
[0017]本发明提供上述施氏假单胞菌固定化制备微胶囊的方法，步骤如下:
I)菌株WZUF25接种于LB培养基中培养后离心得菌体，菌体以蒸馏水洗涤，菌体与分散有活性炭粉末的海藻酸钠溶液混合；2)配制CaCl2水溶液中，于37°C水浴l(T30min后，将步骤I)所得混合液滴加入温度37 0C的CaCl2水溶液中，得微胶囊。
[0018]上述微胶囊的应用:所述微胶囊接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
[0019]优选地,所述含氮水溶液为含有NOf和NOf的一种或其组合的水溶液，所述固定化施氏假单胞菌WZUF25的微胶囊脱N03--N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。含氮水溶液中的氮源只为NO3-时，碳源与含氮废水中N03_的质量比为5:1.228^15:1.228 ;含氮水溶液中的氮源只为N02_时，碳源与含氮废水中NO2-的质量比为5:0.67~15:0.67。
[0020]作为优选技术方案，所述含氮水溶液pH为4~10，所述固定化施氏假单胞菌WZUF25的微胶囊于温度20°C~45°C，溶氧为1.3~7.3mg.L—1的条件下对含氮水溶液进行脱氮。[0021]本发明能够达到以下技术效果:
1、施氏假单胞菌iPseudomanos stutzeri )WZUF25进行好氧反硝化的适宜pH和温度范围广，不仅对no3_-n和Ν02_-Ν的去除率高，而且具有较高的同化NH/-N能力，可为同步硝化和反硝化提供种源。同时提供采用活性炭-海藻酸钙包埋法制备的固定化施氏假单胞菌去除NO3--N的能力和稳定性。
[0022]2、本发明经研究提供了适合菌株WZUF25培养的反硝化培养基和培养方法，可培养获得大量菌体。
[0023]3、在菌株WZUF25的最佳脱氮条件下，Ν03__Ν和Ν02__Ν的去除率能够达到99%以上；NH4+_N去除率可达60%左右。
[0024]4、利用本发明的菌株能够有效对废水进行处理，降低废水C0D，并且脱氮效果良好。
[0025]5、本发明的菌株经固定化制得的微胶囊同样具有Ν03_-Ν和Ν02_-Ν的去除率高的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF25与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,上标的“T”表示模式菌株(P., Pseudomonas')。
[0027]图2是菌株WZUF25去除人工配制的NH4+_N污水进程。
[0028]图3是菌株WZUF25去除人工配制的Ν03__Ν污水进程。
[0029]图4是菌株WZUF25去除人工配制的Ν02__Ν污水进程。
[0030]图5是活性炭-海藻酸钙包埋菌株WZUF25去除人工配制的Ν03__Ν污水进程。
[0031]菌株保藏
本发明的施氏假单胞菌iPseudomanos stutzeri )WZUF25,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7685，保藏起始日期为2013年6月8日。
【具体实施方式】[0032]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0033]实施例一:好氧反硝化菌株的分离
样品为取自浙江温州西片污水处理厂的活性污泥，采用常规分离法，将一定量活性污泥接种于富集培养基(KNO3 lg，丁二酸钠 5g，KH2PO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H200.1Og, H2O 1000mL, pH 7.2-7.6)于 30°C 160 ~180 rpm 下进行富集培养 3 ~4 天，待长出细菌后转接新的富集培养基继续富集培养，如此重复4~5次。然后将经适当稀释的菌液涂布于分离培养基(琼脂18g.L—1，其他成分同富集培养基)于30°C下培养48 h，挑取单菌落转接新的分离培养基进行划线纯化，直至经镜检为纯培养物，然后转接保藏培养基(酵母膏5g，蛋白胨lOg，NaCl 10g,琼脂18g，H2O 1000 mL, pH 7.0)于30°C下培养后保藏。
[0034]分别将保藏菌株接种于反硝化培养基(丁二酸钠IOg.L—1，其他成分同富集培养基)于30°C 160~180 rpm下培养(250mL锥形瓶装培养基lOOmL)，定时取样分别用格利斯试剂I和II以及二苯胺检测Ν02_-Ν和Ν03_-Ν，根据Ν02_-Ν的生成和降解情况以及Ν03_-Ν的降解情况，对保藏菌株的好氧反硝化性能进行初步筛选，对初步筛选获得的好氧反硝化菌株进行反硝化性能测定，测定方法按文献进行(东秀珠，常见细菌系统鉴定手册，北京:科学出版社，2001)，以进一步确定好氧反硝化性能。
[0035]将初筛获得的具有好氧反硝化性能的菌株进行复筛，方法为将菌株接种于反硝化培养基(丁二酸钠IOg.I/1，其他成分同富集培养基)于30°C 160~180 rpm下培养24 h(250mL锥形瓶装培养基IOOmL),然后于8000rpm下离心IOmin后测定上清液的Ν02__Ν浓度和no3_-n浓度，计算no3_-n的去除率和no2_-n的积累情况，筛选no3_-n去除能力强、no2_-n积累低甚至没有积累的优良菌株。
[0036]经上述方法获得I株优良的好氧反硝化菌株，编为WZUF25。
[0037]Ν03_-Ν测定采用酚二磺酸法分光光度法，NO2^-N测定采用N- (1-萘基)-乙二胺光度法(国家环境保护局.水和废水监测分析方法(第三版).北京:中国环境科学出版社，1989)。
[0038]NO3--N去除率(%)=(培养前上清液NO3--N浓度-培养后上清液Ν03__Ν浓度)/培养前上清液NO3--N浓度X 100%
实施例二:好氧反硝化菌株的鉴定
菌株WZUF25在分离培养基培养48h后菌落呈圆形、半透明、表面不光滑、边缘不整齐、菌落呈淡黄色，菌细胞短杆状，大小0.7~0.8X 1.5~3.2 μ m，无芽孢，革兰氏阴性，单极鞭毛。
[0039]以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA，扩增采用一对通用引物:上游引物(Pl):5’ -AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’，下游引物(P6):5’ -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，PCR产物的纯化和测序由上海生物工程有限公司完成，测序结果通过GeenBankBlast进行比对分析。与GeenBank中的假单胞菌属iPseudmonas sp.)的16SrDNA序列具有很高同源性，与A stutzeri的同源性为99.9%。采用MEGA4.1软件，邻位连接法显示菌株WZUF25与相关种的16S rDNA序列系统发育树见图1。
[0040]施氏假单胞菌(Fseudmorms stutzeri) WZUF25,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏中心登记入册编号为CGMCC N0.7685，保藏起始日期为2013年6月8日。
[0041 ] 实施例三:菌株WZUF25好氧反硝化去除Ν03__Ν的特性
采用单因子试验法，研究菌株WZUF25进行好氧反硝化去除Ν03_-Ν的特性。实验过程为:将保藏菌株(2.0mL冷冻管融化的菌液)接种于装有200mL LB培养基(酵母膏5g，蛋白胨10g, NaCl 10g, H2O 1000 mL，pH 7.0)的 500mL 锥形瓶中，在 30°C、160rpm 下培养 24h，在8000 rpm下离心IOmin得菌体，并用无菌蒸馏水洗涤菌体2次，用无菌水制成菌悬液(fl9_0.900 ~1.000)。
[0042]然后菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有IOOmL反硝化培养基(碳源，KNO3,K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000mL, pH 4~10)的 250mL 锥形瓶中，于一定温度(20~45°C)—定转速(O~250rpm)下培养24 h, 8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和Ν02__Ν的积累情况。
[0043]NO2--N和NO3--N的测定同实施例一，溶氧的测定为装有IOOmL培养基的250mL锥形瓶在一定温度、一定转速下振荡24h后测定培养基的DO值。
[0044]NO3--N去除率计算同实施例一。
[0045]主要探讨碳源、碳源与KNO3的重量比、温度、pH和溶氧对菌株WZUF25去除Ν03__Ν的影响，结果如表1~表5所不。
[0046]1、碳源对菌株WZUF25去除NOf-N的影响
菌悬液按5%体积比的接种量转接于装有IOOmL反硝化培养基(碳源10g，KNO3 2.0g，K2HPO4 lg, FeSO4.7H2 O 0.20g, MgSO4.7H20 0.10 g, H2O 1000mL, pH 7.0)的 250mL 锥形瓶中，于温度30°C,转速150rpm (溶氧4.9mg.171)下培养24 h, 8000rpm下离心IOmin后测定上清液的NO2--N浓度和NO3--N浓度，计算NO3--N的去除率和Ν02__Ν的积累情况。
[0047]表1碳源对菌株WZUF25去除Ν03__Ν的影响
【权利要求】
1.一株施氏假单胞菌，其特征在于，该菌株为施氏假单胞菌stutzeri)WZUF25，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为 CGMCC N0.7685。
2.权利要求1所述施氏假单胞菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤: .1)保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，培养12h以上，离心，得菌体，用无菌水洗涤后制成OD680为0.900~1.000的菌悬液； .2)步骤I)所得菌悬液接种于反硝化培养基中进行培养； 其中，所述反硝化培养基的构成为:碳源，氮源，K2HPO4, FeSO4, MgSO4, H2O,所述碳源为丁二酸钠、乙酸钠、甘油或葡萄糖，所述氮源为含硝酸根离子的化合物。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤I)保藏菌株WZUF25接种于LB培养基中，于20~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.L-1的条件下培养；步骤2)中所得菌悬液接种于反硝化培养基中，于25~40°C，溶氧3.5~6.1 mg.L-1下培养。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中所述反硝化培养基的配方为:碳源，氮源中硝酸根的质量 1.228g，K2HPO4 lg, FeSO4.7H20 0.20g, MgSO4.7H20 0.10g, H2O 1000 mL，pH为5~9，所述碳源与氮源的NOf的质量比为5:1.228~15:1.228。
5.权利要求1所述的施氏假单胞菌的应用，其特征在于，将所述施氏假单胞菌WZUF25接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
6.权利要求5所述的施氏假单胞菌的应用，其特征在于，所述含氮水溶液为含有NH4+、NO3-和NO2-的一种或其组合的水溶液，所述施氏假单胞菌WZUF25脱Ν03_-Ν、ΝΗ4+-Ν和Ν02__Ν的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含氮水溶液pH为4~10，所述施氏假单胞菌WZUF25于温度20°C~45°C，溶氧为1.3~7.3mg.L—1的条件下对含氮水溶液进行脱氮。
8.权利要求1所述的施氏假单胞菌固定化制备微胶囊，其特征在于，步骤如下: .1)菌株WZUF25接种于LB培养基中培养后离心得菌体，菌体以蒸馏水洗涤，洗涤后的菌体与分散有活性炭粉末的海藻酸钠溶液混合； .2)配制CaCl2水溶液中，于37°C水浴l(T30min后，将步骤I)所得混合液滴加入温度37 0C的CaCl2水溶液中，得微胶囊。
9.权利要求8所述微胶囊的应用，其特征在于，所述微胶囊接种于含氮水溶液中，进行脱氮。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含氮水溶液为含有NO3-或NO2-的一种或其组合的水溶液，所述固定化施氏假单胞菌WZUF25的微胶囊脱N03_-N、NH4+-N和Ν02__Ν的碳源含有乙酸钠、丁二酸钠、甘油或葡萄糖的其中之一或其组合。
【文档编号】C12N11/04GK103497908SQ201310375037
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年8月26日 优先权日:2013年8月26日
【发明者】蒋张亮, 陈文雅, 练石金, 周茂洪, 李军 申请人:温州大学