专利名称：一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌及其获取与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，特别涉及一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌及其获取与应用。
背景技术：
雌激素作为环境中典型内分泌干扰物质，会以直接或间接的方式在生物体内蓄积与富集；在体内与激素受体结合后，环境雌激素会引起生物的神经系统失调、内分泌紊乱、免疫能力下降和生殖失常等，具有很强的致癌性与致病性，直接威胁着人类社会与生物圈的生存与繁衍，已引起了学术界与社会的广泛关注。雌酮(Ε1)、17-β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)是由人和动物的卵巢分泌的天然雌激素，可随着动物与人体的排泄物排放进入污水处理厂、土壤、农田等环境中。人工合成雌激素17-α-乙炔基雌二醇(ΕΕ2)是低剂量口服避孕药、月经不调治疗药和更年期治疗药的主要成分，亦会被排泄到污水处理厂中。牲 畜养殖业排放的雌激素亦会通过堆肥发酵等处理处置后通过施肥进入农田土壤中。常规活性污水处理系统不能有效去除原水中的雌激素，雌激素随着污水处理厂出水排放进入河流中，在环境中累积。研究表明，河流中可检出ng/L级的雌酮与17β-雌二醇，造成环境的二次污染。研究还发现，ng/L水平的雌酮与17 β-雌二醇可导致雄鱼的雌性化，是引起鱼类雌性化的主要物质。因此，环境雌激素的污染对于水源水质、城镇供水、公共卫生及生态质量等方面构成的潜在威胁不容忽视。多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons PAHs)是煤,石油，木材，烟草,有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的碳氢化合物，是分子中含有两个以上苯环的碳氢化合物，包括萘、蒽、菲、芘等150余种化合物。主要来源于人类活动和能源利用过程，是重要的环境和食品污染物。迄今已发现有200多种PAHs，其中有相当部分具有致癌性，如苯并[α ]芘，苯并[α ]蒽等。PAHs广泛分布于环境中，可以在我们生活的每一个角落发现，任何有有机物加工，废弃，燃烧或使用的地方都有可能产生多环芳烃。由于多环芳烃的潜在毒性、致癌性及致畸与诱变作用，通过生物累积及食物链传递，给生物体、生态环境和人体健康带来极大危害，已引起各国环境科学家的极大重视。国际癌症研究中心(IARC) 1976年列出的94种对实验动物致癌的化合物，其中15种属于多环芳烃，由于苯并[α]芘是第一个被发现的环境化学致癌物，而且致癌性很强，故常以苯并[α]芘作为多环芳的代表，它占全部致癌性多环芳烃的1% _20%。近些年来，随着人类生产活动的加剧，破坏了其在环境中的动态平衡，使环境中的PAHs大量的增加。因此，如何加快PAHs在环境中的消除速度，减少PAHs对环境的污染等问题，日益引起人们的重视。研究表明，微生物降解是去除雌激素与多环芳烃的主要途径。利用环境分离的微生物菌株或菌群，以雌激素类物质或多环芳烃等为碳源或营养物质，经过复杂的代谢过程，最终将其完全分解为无害的终产物。因而，寻找可有效降解雌激素与多环芳烃的微生物菌株或菌群已成为环境雌激素分解的研究热点之一。常见的微生物如红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽抱杆菌属(Bacillus)、气单胞菌(Aeromonas)、棒状杆菌(Corynebacterium)、微球菌(Micrococcus)和诺卡氏菌(Nocardia)等都具有雌激素分解或多环芳烃降解的活性,这些菌株在雌激素与多环芳烃的环境污染的质粒与修复上具有重要意义。
发明内容
本发明的目的，是提供一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌及其获取方法与应用，该荧光假单胞菌可稳定高效地分解多种雌激素与多环芳烃类物质，可有效地用于环境雌激素生物降解与环境修复。本发明所提供的荧光假单胞菌SJTE-2来源于污水处理厂活性污泥中，经过人工富集、筛分及纯化所得。SJTE-2菌落呈圆形，隆起，菌落呈淡黄色，透明，边缘光滑平整湿 润，阳光下观察可见荧光，革兰氏染色呈阴性，直或弯的杆菌，单个和成对，无芽孢，30°C下生长良好。经对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，表明该菌株为荧光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)。该突光假单胞菌SJTE-2菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)保藏，登记入册编号为CGMCC No. 6587。为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌，命名为SJTE-2，其保藏编号为CGMCCNo.6587。上述的荧光假单胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。上述荧光假单胞菌的获取方法，包括以下步骤A、采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源；B、以雌激素或多环芳烃为碳源，制备含有50mg/L雌激素或500mg/L多环芳烃的无机培养基，按照3%的活性污泥接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中，用盐酸调pH值至7. 0-7. 2，121。。灭菌20min ；C、待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种；D、接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养；E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的荧光假单胞菌菌株，命名为SJTE-2。上述荧光假单胞菌的获取方法，其中，所述无机培养基的无机成分及浓度如下K2HPO4,0. lg/L ； (NH4)2HPO4,0. lg/L ；MgS04 · 7Η20，0· 02g/L ;FeCl3，0. Olg/L ；NaCl,0. lg/L。上述荧光假单胞菌的获取方法，其中，所述雌激素为雌酮、17-β-雌二醇或雌三醇；所述多环芳烃为萘、菲或双酚Α。上述荧光假单胞菌的应用，用于环境中雌激素类物质与多环芳烃类物质的分解与去除。上述荧光假单胞菌的应用，其中，所述雌激素类物质包括雌酮、17- β -雌二醇和雌三醇；所述多环芳烃类物质包括萘、菲和双酚Α。本发明的SJTE-2菌株在24小时内能将初始浓度为lmg/L的雌酮、17-β -雌二醇和雌三醇全部降解，对50mg/L的萘、菲和双酚A的降解率超过90% ;七天可将初始浓度为50mg/L的雌酮、17- β -雌二醇和雌三醇降解90%以上，对500mg/L的萘、菲和双酚A的降解率大于80%。降解反应符合一级动力学反应定律。依据本发明，由于突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株具有高效降解环境中的雌激素物质雌酮、17 β-雌二醇、雌三醇与多环芳烃类物质萘、菲和双酚A的特性，因此SJTE-2菌株可应用于含有雌激素与多环芳烃类的废污水治理或土壤修复。本发明与现已发现的雌激素降解微生物和多环芳烃降解菌株相比，其降解天然雌激素与多环芳烃类的效率显著提高，降解周期明显缩短。
图I为本发明的突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株的平板划 线图；图2为本发明的突光假单胞菌Pseudomonasf luorescens SJTE-2菌株以lmg/L雌酮(El)、17 β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)为单一碳源时菌株的生长曲线；图3为本发明的突光假单胞菌Pseudomonasfluorescens SJTE-2菌株以50mg/L萘、菲和双酚A为单一碳源时菌株的生长曲线；图4为本发明的突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株对lmg/L雌酮(Ε1)、17β-雌二醇(Ε2)和雌三醇(Ε3)的降解曲线；图5为本发明的突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株降解500mg/L萘、菲和双酚A(BPA)的曲线图。具体实施方法下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施不局限于此。一、突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株的获取与保藏采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源，冷藏运回实验室。制备含有50mg/L雌激素或500mg/L多环芳烃为唯一碳源的无机培养基,按照3%的活性污泥接种量接种于含有IOOmL上述无机培养基的500mL三角瓶中。(培养基中所含无机成分及浓度为=K2HPO4,0. lg/L ； (NH4)2HPO4,0. lg/L ；MgS04 · 7Η20，0· 02g/L ；FeC13,0. Olg/L ；NaCl，0· lg/L。)盐酸调pH值至7· 0-7. 2，高压灭菌锅121°C灭菌20min。待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下接种。污泥接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养。重复培养七次后，在固体培养基平板(琼脂20.0g/L)上反复划线培养，直至分离出单菌株。之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的可降解雌酮、17 β-雌二醇、雌三醇、萘、菲和双酚A的SJTE-2菌株，平板划线图如图I所示。该菌落呈圆形，隆起，菌落呈淡黄色，透明，边缘光滑平整湿润，阳光下观察可见荧光，30°C下生长良好。纯化后菌株加甘油后于_80°C冷冻保藏。本发明的SJTE-2菌株已于2012年9月19日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号为CGMCCNo.6587。二、突光假单胞菌 Pseudomonasf luorescens SJTE-2 菌株的鉴定将分离出的SJTE-2菌株进行16S rDNA序列的扩增、序列测定与数据库比对。利用基因组提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取SJTE-2菌株的基因组DNA，之后，利用16S rDNA片段扩增与检测试剂盒(Takara，大连)扩增该菌株的16S rDNA片段并测定序列。SJTE-2菌株的 16S rDNA 序列如 SEQ ID NO. I 所不。与 NCBI 数据库(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/)比对,表明该SJTE-2菌株为突光假单胞菌Pseudomonas fluorescens,菌株为无芽孢杆菌，单个和成对，属革兰氏阴性菌，严格好氧，化能异养。三、突光假单胞菌Pseudomonasfluorescens SJTE-2菌株对雌丽、17 β -雌二醇、雌三醇、萘、菲和双酚A的降解能力将Pseudomonas fluorescens SJTE-2菌株划固体培养基平板,30°C过夜培养。挑取单克隆，分别接种于以lmg/L雌酮、17 β -雌二醇或雌三醇，或50mg/L萘、菲或双酚A为唯一碳源的液体培养基中，30°C，120rpm恒温振荡培养箱中培养7天。采集不同时间点的2个平行样品，一个样品利用紫外分光光度仪(UV_2100spectrophotometer, Unic)测定600nm吸光度值用以表示微生物生长情况，结果如图2和图3所示。另一个样品中加入等体积乙腈混匀，以O. 22μπι有机系尼龙滤膜(13mm，Mi I lipore)过滤后，采用高效液相色谱(HPLC，Watersl525)测定雌激素或多环芳经浓度。检测器为UV(Dual λ Absorbance Detector,Water2487)，色谱柱为 Nova-Pak C18 柱(4 μ m 粒径、3. 9mmX 150mm I. D.，Waters)，流动相 体积比为乙腈水=I : 1，检测波长为280nm,流速为lmL/min。不同雌激素的浓度测定结果如图4和图5所示。在雌激素或多环芳烃为唯一碳源的培养条件下，SJTE-2菌株在24小时内能将初始浓度为lmg/L的雌酮、17- β -雌二醇和雌三醇全部降解，对50mg/L的萘、菲和双酚A的降解率超过90%;七天可将初始浓度为50mg/L的雌酮、17- β -雌二醇和雌三醇降解90%以上，对500mg/L的萘、菲和双酚A的降解率大于80%。降解反应符合一级动力学反应定律。序列表〈110〉上海交通大学〈120〉一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌及其获取与应用〈160〉I<170> PatentIn version〈210〉I〈211〉 1465〈212〉DNA<213> 突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) SJTE-216S rDNA 序列〈400〉 Igaccagcatt gtcaagtccg agcggtagag agaagcttgc ttctcttgag agcggcggac60gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcctggt agtgggggat aacgttcgga aacggacgctl20aataccgcat acgtcctacg ggagaaagca ggggaccttc gggccttgcg ctatcagatgl80agcctaggtc ggattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac gatccgtaac240tggtctgaga ggatgatcag tcacactgga actgagacac ggtccagact cctacgggag300gcagcagtgg ggaatattgg acaatgggcg aaagcctgat ccagccatgc cgcgtgtgtg360aagaaggtct tcggattgta aagcacttta agttgggagg aagggttgta aattaatact420ctgctgtttt gacgttaccg acagaataag caccggctaa ctctgtgcca gcagccgcgg480taatacagag ggtgcaagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgcgc gtaggtggtt540tgttaagttg gatgtgaaat ccccgggctc aacctgggaa ctgcattcaa aactgactga600
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权利要求
1.一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌，命名为SJTE-2，其保藏编号为CGMCCNo.6587
2.根据权利要求I所述的荧光假单胞菌，其特征在于，所述荧光假单胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO. I所示。
3.根据权利要求I所述的荧光假单胞菌的获取方法，其特征在于，包括以下步骤A、采集污水处理厂脱氮除磷工艺系统中的活性污泥作为微生物源；B、以雌激素或多环芳烃为碳源,制备IOOmL含有50mg/L雌激素或500mg/L多环芳烃的无机培养基，，用盐酸调pH值至7. 0-7. 2，121。。灭菌20min ；C、待培养基温度降低到30°C左右时，在超净台下按照3%的活性污泥接种量接种于含有上述无机培养基的500mL三角瓶中；D、接种后在30°C、180rpm的恒温摇床培养箱中进行富集培养；E、重复培养七次后，在固体培养基平板上反复划线培养，直至分离出单菌株，之后再将菌株接种入上述无机培养基内驯化，上述操作重复多次，得到纯化的荧光假单胞菌菌株，命名为 SJTE-2。
4.根据权利要求3所述的荧光假单胞菌的获取方法，其特征在于所述无机培养基的无机成分及浓度如下=K2HPO4,0. lg/L ； (NH4)2HPO4,0. lg/L ；MgS04 · 7H_20，0. 02g/L ；FeCl3,.0.Olg/L ；NaCl,0. lg/L。
5.根据权利要求3所述的荧光假单胞菌的获取方法，其特征在于所述雌激素为雌酮、17-β-雌二醇或雌三醇；所述多环芳烃为萘、菲或双酚Α。
6.根据权利要求I所述的荧光假单胞菌的应用，用于环境中雌激素类物质与多环芳烃类物质的分解与去除。
7.根据权利要求6所述的荧光假单胞菌的应用，其特征在于所述雌激素类物质包括雌酮、17-β -雌二醇和雌三醇；所述多环芳烃类物质包括萘、菲和双酚Α。
全文摘要
一株可降解雌激素类物质的荧光假单胞菌，命名为SJTE-2，其保藏编号为CGMCC No.6587.本发明中的荧光假单胞菌能利用天然雌激素或环境雌激素作为唯一碳源生长，能够高效降解雌激素类物质雌酮、17-β-雌二醇、雌三醇和多环芳烃类物质萘、菲、双酚A，可用于环境中雌激素类物质与多环芳烃类物质的分解与去除。在以雌激素或多环芳烃为唯一碳源的培养条件下，菌株SJTE-2在24小时内能将初始浓度为1mg/L的雌酮、17-β-雌二醇和雌三醇全部降解，对50mg/L的萘、菲和双酚A的降解率超过90％；七天可将初始浓度为50mg/L的雌酮、17-β-雌二醇和雌三醇降解90％以上，对500mg/L的萘、菲和双酚A的降解率大于80％。
文档编号C02F101/34GK102925392SQ201210437048
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者梁如冰, 刘建华 申请人:上海交通大学