一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌jr4及其应用
【专利摘要】本发明提供了一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR14，该菌株的分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11928，保藏时间为2015年12月24日。本发明还提供了该菌株在抗氧化方面和制备青贮饲料方面的应用。本发明菌株具有优秀的抗氧化能力、耐胆盐能力和耐酸能力。CGMCC No.1192820151224
【专利说明】
一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR4及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及一株高抗氧化耐热耐酸植物乳杆菌JR4及其应 用。
【背景技术】
[0002] 植物乳杆菌是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，可以定植于肠道并发挥益生作用，被 广泛应用于乳制品和医疗保健领域。
[0003] 然而，在实际利用植物乳杆菌的过程中，由于现有很多植物乳杆菌的耐酸、耐胆盐 能力不佳，限制了其有益作用的发挥。而一些具有较强耐酸、耐胆盐能力的植物乳杆菌，却 不具备较好的抗氧化性能，难以发挥较好的有益作用。如中国专利CN 105018379A公布的植 物乳杆菌对超氧自由基的清除率最高仅为53.99%，而最低甚至低至14.85%。
[0004] 因此，寻求一种既具有优秀的耐酸、耐胆盐能力，又同时具备高抗氧化性，特别具 有优秀的超氧自由基清除能力的植物乳杆菌，成为本领域亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR4,其具有优 秀的抗氧化能力、耐胆盐能力和耐酸能力。该菌株的分类命名为为植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 11928,保藏时间为2015年12月24日。
[0006] 如本发明的实施例所示，本发明所得菌株具有很好的耐酸能力，在pH=2.5的环境 下24小时之后的活率仍高达80.39%;本发明所得菌株还具有很好的耐胆盐能力，在胆盐浓 度为0.15 %时，活率高达1182.98 %，也即是说细菌在该浓度胆盐下，还具备很好的生长能 力;本发明所得菌株同时还具有很好的抗氧化能力，其菌体本身、无细胞破碎液和发酵液对 羟自由基的抑制率分别为29.47 %、27.56%和42.74%，其发酵液对于超氧自由基的抑制率 尚达89 · 38%。
[0007] 本领域技术人员应该理解，同时具备上述多种性能的植物乳杆菌十分难得。本发 明的发明人经过大量实验摸索，意外的分离出了该菌株。
[0008] 本发明的目的之二在于提供该菌株在抗氧化方面的应用。所述应用包括在清除羟 基自由基和在清除超氧自由基方面上的应用。
[0009] 具体的，在清除羟基自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4菌体、植物乳杆菌JR4无细 胞破碎液、植物乳杆菌JR4发酵液中的至少一种。
[0010] 具体的，在清除超氧自由基时，利用的是植物乳杆菌JR4发酵液。
[0011] 优选的，所述植物乳杆菌JR4无细胞破碎液的制备方法为:将细菌培养后，取菌体 利用生理盐水冲洗，加入溶菌酶处理，然后进行超声破碎处理，即得。
[0012] 本发明的另一个目的在于提供上述菌株在制备青贮饲料、食品防腐剂、发酵乳制 品食品添加剂方面的应用。
[0013] 本发明的有益效果：
[0014] 1、本发明菌株同时具有很好的耐酸、耐胆盐和抗氧化性能；
[0015] 2、本发明菌株具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明菌株植物乳杆菌JR4的菌落形态图；
[0017]图2为本发明菌株植物乳杆菌JR4的革兰氏染色图；
[0018]图3为本发明菌株植物乳杆菌JR14的PCR扩增电泳图，其中"14"为JR14菌株，"M"为 蛋白标记物；
[0019] 图4为本发明菌株对羟自由基的抑制率和抑制能力的测试结果图，
[0020] 其中，"Γ为菌体、"2"为无细胞破碎液、"3"为发酵液；
[0021] 图5为本发明菌株对超氧自由基清除能力的测试结果图，其中"Γ为发酵液，"2"为 菌体，"3"为无细胞破碎液。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。 [0023] 实施例1
[0024] 1、实验原料及方法
[0025] 1.1菌株来源
[0026]自制的传统自然发酵泡菜。
[0027] 1.2培养基
[0028] MRS培养基：牛肉膏(粉）10g，蛋白胨10g，酵母膏(粉)5g，葡萄糖20g，吐温-80 lmL， 柠檬酸铵2g，K2HP〇4 2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1000mL(配制固体培 养基需加琼脂粉18g)，加热溶解，调节pH至6.0~6.4，121°C灭菌15min。
[0029] 1.3主要试剂
[0030]冰乙酸AR，成都市科龙化工试剂厂；
[0031]细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型），天根生化科技(北京)有限公司；
[0032] 2000DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司；
[0033] 羟自由基测试盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
[0034]抗超氧阴离子试剂盒50T/48T，南京建成生物工程研究所；
[0035] 总蛋白定量测定试剂盒(BCA法），南京建成生物工程研究所。
[0036] 1.4 16S rDNA的PCR扩增引物 [0037]细菌通用引物由华大科技提供：
[0038] 上游引物PI: 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '
[0039] 下游引物P2:5，-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3 '
[0040] 1.5仪器与设备
[0041] 电子天平，sartorius;
[0042] 高压灭菌锅，GI54DW;
[0043] 高速冷冻离心机，SorvallST 16R;
[0044] PCR 扩增仪；
[0045] 紫外可见分光光度计；
[0046] 超声波破碎仪。
[0047] 1.6乳酸菌的分离纯化
[0048] 采用10倍梯度稀释法将泡菜水样品稀释到10-5、10-6、10- 7的稀释度。每个稀释度吸 取lmL菌液，并用含1.5 % Ca⑶3的MRS固体培养基倾注平板，37 °C培养48h，挑选有明显溶钙 圈的不同形态的菌落进行革兰氏染色观察，挑取革兰氏阳性的菌落到另一个含有1.5% CaC03的MRS固体平板上划线培养，并将固体培养基平板上得到的单个菌落接种在一个装有 5mL MRS液体培养基的试管中，于37°C下培养24h，然后用接种环挑取菌液继续划线，重复2-3次，直至菌落镜检结果表现为菌体形态一致，即可保存菌株。
[0049] 1.7菌株的保存
[0050] 将得到的单一菌株在液体培养基中活化2-3次，划线接种于MRS固体斜面中培养 48h后置于4°C冰箱内短期保存，或将液体培养物与40%的灭菌甘油按1:1的比例混合，在_ 20°C条件下进行长期保存。
[00511 1.8乳酸菌的鉴定
[0052] (1)乳酸菌的形态特征
[0053]将菌液划线接种于固体培养基上，37 °C培养48h观察并记录菌落形态，同时进行革 兰氏染色镜检，观察并记录其菌体形态特征。
[0054] (2)生理生化特征
[0055] 对初步分离筛选得到的耐受消化道环境的菌株进行产H2S试验、硝酸盐还原试验、 明胶液化试验、吲哚产生试验、乳糖试验、甘露糖试验、棉籽糖试验、海藻糖试验、七叶苷试 验、麦芽糖试验、纤维二糖试验、果糖试验、鼠李糖试验、木糖试验、半乳糖试验、阿拉伯糖试 验、苦杏仁苷试验，参照伯杰细菌鉴定手册(第八版)对比生化反应结果，并对菌株进行初步 种群归类。
[0056] (3)16S rDNA鉴定
[0057] ①细菌总DNA的提取：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目的菌体DNA，并用 1.0%ΤΒΕ琼脂糖凝胶电泳检测提取结果。
[0058] ②16S rDNA基因的PCR扩增:将提取得到的DNA模板进行PCR扩增，26yLPCR反应体 系：上下游引物各 lyL(10ymol/L)，模板 DNA2yL，2xlong Taq PCR MasterMix 9.5yL， ddH2012.5yL〇
[0059] PCR扩增程序：94°C预变性4min; 94°C、lmin，60°C、lmin，72°C、2min，循环30次；72 °C延伸lOmin，用1.0 % TBE琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。PCR扩增产物4 °C保存，交由英潍 捷基(上海)贸易有限公司测序。
[0060] ③序列分析:登陆NCBI网站，进行同源性分析，并采用MEGA6.06软件将测得序列与 GenBank中的模式菌株16S rDNA序列进行分析，制作系统发育树。
[0061 ] 1.9耐消化道环境的乳酸菌的初筛
[0062] (1)耐酸实验
[0063] 37°C条件下，在试管中培养12h的菌液按1 %的接种量接种于lOOmLMRS液体培养基 中，37°C°C静置培养24h。将菌液按1%的接种量（调整菌液浓度为10 7cfu/mL)分别接种至 ρΗ7.0，ρΗ2.0，pH2.5的MRS培养基中（盐酸调节），37°C °C静置培养24h，分别在Oh和24h测定 不同pH值培养基的4_，判断菌株在酸性环境下的耐受情况。每组设2个重复。
[0064] (2)耐胆盐实验
[0065] 37°C条件下，将在试管中培养12h的菌液按1 %的接种量接种于lOOmLMRS液体培养 基中，37°C静置培养24h。将菌液按1%的接种量(调整菌液浓度为107cfu/mL)分别接种至含 0% (空白），0.15%，0.3% (W/V)三号胆盐的MRS培养基100mL中，摇匀，37°C静置培养24h后 测A?，计算菌株对三号胆盐的耐受能力的大小。每组设2个重复 [24'25]。
[0067] 1.10耐消化道环境的乳酸菌的复筛
[0068] (1)耐酸实验
[0069] 37°C条件下，在试管中培养12h的菌液按1 %的接种量接种于lOOmLMRS液体培养基 中，37°C静置培养24h。将菌液稀释100倍后按1%的接种量（调整细胞浓度约为105cfu/mL) 分别接种至pH2.0，pH2.5的MRS培养基中（盐酸调节），37°C静置培养24h。在Oh和24h分别倾 注平板进行活菌计数，并计算存活率，以此来判断菌株的耐酸能力。
[0070] (2)耐胆盐实验
[0071] 37°C条件下，将在试管中培养12h的菌液按1 %的接种量接种于lOOmLMRS液体培养 基中，37°C静置培养24h。将菌液稀释100倍后按1%的接种量（调整细胞浓度约为105cfu/ mL)分别接种至含0.15%，0.3%(1八)三号胆盐的1?3培养基10011^中，摇匀，37°(：静置培养 24h。在Oh和24h分别倾注平板进行活菌计数，并计算存活率，以此来判断菌株的耐胆盐能 力。
[0072] 1.11乳酸菌抗氧化的测定
[0073]种子液的制备:分别将保藏于4°C条件的菌种接种在MI?固体培养基上，37°C，培养 24h，待用。分别挑1-2环活化的菌株接种于SmLMRS液体培养基中，37°C，静置培养12h，即为 种子液。
[0074]无细胞提取物的制备：将种子液按1 %的比例，接种在MRS液体中，37°C静置培养 24h，在8000r/min，10min，4 °C条件下将发酵液离心，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体3次，菌 体重悬于生理盐水中，制成菌悬液，A6QQ为2.473。在菌悬液中加入10%的溶菌酶37°C处理 2.5h，将处理后的菌悬液置于冰浴中，在功率为800W条件下超声破碎细胞，工作5s，间歇7s， 全程时间50min。然后在10000r/min，10min，4°C条件下将破碎后的液体离心，收集上清液， 上清液即为无细胞提取物 [21]。
[0075] (1)清除轻自由基（· 0H)能力的测定
[0076]以羟自由基测试盒为参照（其中蛋白浓度用BCA法测定），测定原理为Fenton反应 是最常见的产生羟自由基的化学反应，H2〇2的量和Fenton反应产生的0H ·量成正比，当给予 电子受体后，用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与0H·的多少成正比关系。
[0077]具体操作方法如下(简要过程见表1):
[0078]试剂组成与配制：
[0079] 试剂一 :3%H202标准品贮备液0.5mLX 1支，4°C保存3个月。
[0080] 0.03 %标准品应用液的配制：3 % H2〇2标准品贮备液:双蒸水=1:99稀释，现用现 配。
[0081 ]试剂二:底物贮备液lmL XI支，4°C保存3个月。
[0082]底物应用液的配制：
[0083]本样品为抑制羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，
[0084] 则底物应用液的配制:底物贮备液:双蒸水=1:99稀释，现用现配。
[0085]试剂三：甲液贮备液2mLX 1支，4°C保存3个月，用时加双蒸水1:9稀释成应用液。 [0086] 乙液:7mLX2支，4°C保存3个月。
[0087] 试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比例混合，按需配制，余下4°C保存。 [0088] 试剂四：液体1 OmL X 1瓶，4°C保存3个月。用时加双蒸水稀释至1 OOmL，制备应用液， 4°C
[0089] 保存。若有结晶，则放置37°C水浴至全部溶解后再稀释。
[0090] 试剂五:液体30mLX 1瓶，避光4°C冰箱保存3个月。
[0091 ]试剂六:液体30mLX 1瓶，避光4°C冰箱保存3个月。
[0092]试剂七:分析纯的冰乙酸(冰醋酸）自备。
[0093] 显色剂的配制:试剂四应用液:试剂五:试剂六:冰乙酸=8:3:3:2,现用现配。
[0094] 操作步骤：
[0095]以上配制好的应用液，先在37 °C水浴中预温3分钟，以下操作在37 °C水浴中进行。 混匀，室温放置20分钟，波长550nm，lcm光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
[0096]当清除率在20%_50%之间可利用公式计算其抑制羟自由基能力，羟自由基清除 率计算公式如下：
[0098] MRS发酵液与上清液抑制羟自由基能力的计算公式如下：
[0100]菌体抑制羟自由基能力的计算公式如下：
[0102] (2)清除超氧阴离子自由基(02 ·)能力的测定
[0103]以抗超氧阴离子试剂盒为参照（其中蛋白浓度用BCA法测定），具体操作方法如下 (简要过程见表2):
[0104]试剂组成与配制：
[0105] 试剂一:液体5mLXl瓶，（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再 用）；
[0106] 试剂一应用液的配制：用时每瓶5mL|C备液加双蒸水稀释至50mL，4°C保存1年。 [0107]试剂二:液体5mL X 1瓶，4 °C保存1年。
[0108] 试剂三:液体5mL X 1瓶，4 °C保存1年。
[0109] 试剂四：1C备液350yLX 1支，4°C保存，不可冷冻;稀释液5mLX 1瓶，4°C保存半年。 [0110] 试剂四应用液的配制：按贮备液:稀释液= 1:14比例配制，现用现配，4°C保存，不 可冷冻。
[0111] 试剂五:粉剂X 1支，用时加70~80°C热双蒸水37.5mL溶解。配好后4°C避光保存。
[0112] 试剂六:粉剂XI支，用时加双蒸水37.5mL溶解后备用。配好后的试剂4°C避光保 存。
[0113] 显色剂的配制:按照5号试剂:6号试剂:冰乙酸= 3:3:2的体积比配成显色剂，4°C 避光保
[0114]存3个月（冰乙酸自备）。
[0115] 试剂七:Vc标准品X4支。
[0116] Vc标准品贮备液配制:将一支Vc标准品加双蒸水定容至5mL(Vc标准配制后当天内 使用）
[0117] 0.15mg/mL Vc标准品应用液配制:取lmLlC备液加4mL双蒸水，5倍稀释现用现配。
[0118] [注]:Vc标准品配制后见光极易分解，配制的0.15mg/mL Vc标准应用液需30分钟 内检测
[0119] 操作表：
[0120] 混匀，静置10分钟，双蒸水调零，波长550nm，光径lcm，测定各管吸光度0D值。
[0121 ]当清除率在10 % -60 %之间可利用公式计算其抗超氧阴离子活力单位，超氧阴离 子自由基清除率计算公式如下：
[0123] MRS发酵液与上清液抗超氧阴离子活力单位的计算公式如下：
[0125]菌体抗超氧阴离子活力单位的计算公式如下：
[0127]表1 ·清除轻自由基能力的测定
[0129]表2.清除超氧阴离子自由基的测定
[0131] 2实验结果
[0132] 选出的JR14的菌落形态如图1所示，革兰氏染色结果如图2所示。
[0133] 2.1植物乳酸菌JR14产酸定性结果
[0134] 植物乳酸菌JR14在pH值为7.0的条件下培养24h后，pH值下降到3.75，说明植物乳 酸菌JR14产酸良好。
[0135] 2.2植物乳酸菌JR14的耐酸结果
[0136] 植物乳酸菌JR14经24h培养后耐酸结果如表3所示。
[0137] 进行活菌计数后，植物乳酸菌JR14在pH2.5的条件下保持24h的存活率为80.39 %， 如表3所示。
[0138] 表3
[0140] 2.3植物乳酸菌JR14的耐胆盐结果
[0141] 进行活菌计数后，植物乳酸菌JR14的耐胆盐结果如表4所示。
[0142] 表4
[0143]
[0144] 2.4植物乳酸菌JR14的生理生化鉴定结果
[0145] 参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)可知菌株植物乳酸菌JR14为植物乳杆菌属， 鉴定结果见表5。
[0146] 表5生化试验及糖发酵试验鉴定结果
[0148] 2.5 16S rDNA鉴定
[0149] 菌株PCR扩增后进行100V，30min电泳，图3为电泳条带图，菌株分子量在2000bp到 lOOObp之间，将送检结果经过16S rDNA基因序列比对分析，制作进化树，可知JR14与植物 乳杆菌同源性达到了 89 %，可能为植物乳杆菌变种。
[0150] 2.6清除羟自由基（· 0H)能力的测定
[0151] 由图5可知，JR14菌株的发酵液、上清液以及菌体对于羟自由基的抑制率分别为 29.47%、27.56%和42.74%。由于发酵液稀释了 125倍，因此可知发酵液的抑制效果最好， 其次是菌体，上清液的抑制率最低，通过计算得知发酵液和上清液的抑制能力分别22.4U/ mL和20 · 95U/mL，菌体的抑制能力为11 · 75U/mgprot。即发酵液的抑制能力最强，上清液次 之，菌体最弱。
[0152] 2.7清除超氧自由基(〇2 ·)能力的测定
[0153] JR14菌株对超氧阴离子自由基的抑制能力，经过测定发现发酵液的抑制率为 89.38%，而菌体及上清液几乎无抑制效果。
[0154] 实施例2
[0155] 将植物乳酸菌JR14发酵液喷洒至青贮饲料原料中，搅拌均匀，控制青贮饲料的水 分为60 % (wt % )，密封常温发酵3周，即得青贮饲料。
【主权项】
1. 一株高抗氧化耐胆盐耐酸植物乳杆菌JR4，其特征在于，所述植物乳杆菌JR4的分类 命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No. 11928，保藏时间为2015年12月24日。2. 权利要求1所述植物乳杆菌JR4在抗氧化方面的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括在清除羟基自由基和在清除 超氧自由基方面上的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在清除羟基自由基时，利用的是植物乳杆 菌JR4菌体、植物乳杆菌JR4无细胞破碎液、植物乳杆菌JR4发酵液中的至少一种。5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在清除超氧自由基时，利用的是植物乳杆 菌JR4发酵液。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌JR4无细胞破碎液的制备 方法为:将细菌培养后，取菌体利用生理盐水冲洗，加入溶菌酶处理，然后进行超声破碎处 理，即得。7. 权利要求1所述植物乳杆菌在制备青贮饲料、食品防腐剂、发酵乳制品食品添加剂方 面的应用。
【文档编号】A23C9/123GK105969681SQ201610188977
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】周康, 梁运改, 江然, 杨梦露, 王亮, 何利, 陈淑娟, 刘密
【申请人】四川农业大学