专利名称：具有交叉保护力的革兰氏阴性病原菌灭活疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及革兰氏阴性病原菌灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
许多革兰氏阴性菌是重要的病原菌，如某些血清型大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌等。这些病原菌导致禽类发病率和死亡率很高，给家禽养殖业和人类健康都带来了很大危害。由于革兰氏阴性菌的抗原组成复杂、血清型众多，经体外培养制备的灭活疫苗只对同型菌感染有保护作用，而对异型菌感染基本不产生保护作用。革兰氏阴性菌的这一特点给相应禽类传染病的免疫预防带来了极大困难。
研究表明革兰氏阴性菌在体内生长时可以表达交叉保护因子(cross-protective factor，CPF)，并且这种交叉保护因子的表达受到体内低浓度铁的诱导，而CPF可以进一步诱导机体产生交叉保护抗体，从而对该革兰氏阴性菌各血清型菌株的感染均产生保护作用。这一发现为实现体外培养时诱导革兰氏阴性菌表达CPF，从而制备出具有交叉保护作用的新型革兰氏阴性菌灭活疫苗提供了新的思路和方法。目前，国外有一种革兰氏阴性菌外膜蛋白疫苗，其制备工艺是用含铁螯合剂培养基培养细菌；浓缩细菌；弃去上清液，收集并洗涤细菌沉淀；破碎细菌；高速离心收集含外膜蛋白的上清液；浓缩上清液；用变性剂溶出外膜中的外膜蛋白；分离提纯外膜蛋白；制成外膜蛋白疫苗。这种工艺制备出的疫苗交叉免疫保护效果较好，但外膜蛋白的提取工艺复杂，并且需要使用超速冷冻离心，这使得制备的外膜蛋白疫苗成本过高，无法在生产上广泛应用。因此如何制备出具有良好交叉免疫保护力并能产业化的革兰氏阴性菌灭活疫苗是当前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简单、生产成本低、能用于大规模生产的具有交叉免疫保护力的革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法。
本发明提供的这种具有交叉免疫保护力的革兰氏阴性病原菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤a、采用添加有铁螯合剂的固体培养基或液体培养基，取菌种复壮后用所述培养基进行体外培养；b、对固体培养基培养的细菌，用灭菌的疫苗稀释液洗下，直至最终菌液浓度达到本行业标准；或者对上述最终菌液浓度低于本行业标准的菌液以及用液体培养基培养的菌液进行浓缩，保留菌体和脱落的外膜蛋白，直至最终菌液浓度达到本行业标准；c、对步骤b获得的最终菌液用体积百分比为0.1-0.3％的甲醛灭活；d、加入佐剂，制成疫苗。
本发明的有益效果1)采用不经洗涤直接将菌液调至所需浓度的方法，并且当菌液浓度达不到所需浓度时，在进行菌体和液体分离后，收集分离的液体，浓缩后再用于悬浮菌体，并使得到的菌液达到所需浓度。这样能避免CPF在洗涤过程中丢失，且保留了细菌的所有外膜蛋白，从而保证了灭活疫苗具有较好的交叉免疫保护效果。
2)本发明的制备工艺简单，省去了对外膜蛋白的分离纯化工艺，从而大大降低了疫苗的制备成本，可有力地推动革兰氏阴性菌灭活疫苗的产业化。
具体实施例方式
实施例一本发明用于禽霍乱蜂胶灭活疫苗的制备方法及其免疫保护性实验。
本实施例涉及的A型多杀巴氏杆菌强毒冻干菌种购自中国兽医药品监察所，由该所鉴定和保存。
1、菌种复壮及制苗用菌液制备冻干菌种以1ml无菌生理盐水溶解后，在血液马丁琼脂培养基上划线接种，37℃培养20-22小时。将长出的细菌洗下，在鸡体内连续传代2次复壮，取肝脏病料划线接种于血液马丁琼脂平板，37℃培养20-22小时。取4-6个典型菌落划线接种于血液马丁琼脂斜面，37℃培养20-22小时。培养结束后每管斜面加入2ml灭菌生理盐水将培养物洗下，转接到含血红素马丁琼脂的固体培养基上，其中固体培养基内添加了200umol/L 2，2’-联吡啶，也可用5-10umol/L的去铁敏或者0.2-0.4mg/mL的乳铁蛋白作为铁螯合剂。37℃培养24小时。将培养后长出的细菌用适量灭菌生理盐水洗下，对所得菌液进行细菌计数，如果菌液浓度在150-200亿CFU/ml范围，则不需再进行浓缩；如果菌液浓度高于200亿CFU/ml则用灭菌生理盐水将其稀释至150-200亿CFU/ml范围；如果菌液浓度低于150亿CFU/ml，则将所得菌液在6000rpm下离心30min，再将上清液用超滤法浓缩100倍，所用超滤膜截留分子量以5-20kDa为宜，最大截留分子量不高于25kDa，以保留上清液中的脱落的外膜蛋白。用截留的浓缩液将离心沉淀的细菌洗下，并将菌液浓度调整至150-200亿CFU/ml。除了上述浓缩方法外，还可用聚乙二醇沉淀法、凝胶层析法等。
若采用含以上铁螯合剂的血红素马丁营养肉汤为培养基，则可以将培养后的菌液在6000-8000rpm下离心10-30min分离菌体，再将离心上清液用上述超滤法浓缩一定倍数。用浓缩液将离心沉淀的细菌洗下，将菌液浓度调整至150-200亿CFU/ml。
2、水提蜂胶佐剂的制备称取一定量的蜂胶原胶，将其粉碎后加入蒸馏水和1-2％的表面活性剂，表面活性剂可采用吐温80、聚乙二醇等，50℃下浸泡2-5h，然后在40KHz下超声处理30-45min，溶液温度控制在50-60℃，超声结束后将溶液6000-8000rpm下离心20-30min，取上清，60℃下灭菌2-4h即制得水提蜂胶佐剂。含纯蜂胶20-30mg/ml。
3、禽霍乱蜂胶灭活疫苗配制将上述灭活菌液和蜂胶水提取液等体积混合，充分混匀后即制成新型霍乱蜂胶灭活疫苗，其中细菌浓度为75亿CFU/ml，蜂胶含量为12mg/ml。吸取0.1ml疫苗，加至冷却至46℃左右的营养琼脂培养基中，迅速混匀，凝固后置于37℃培养箱培养24h，结果没有细菌生长，表明灭活疫苗符合无菌要求。
4、禽霍乱蜂胶灭活疫苗的安全性实验将制备的疫苗接种于5只2月年龄大的鸡，每只胸部肌注3ml，观察2周进行安全性检查，实验结果表明鸡接种后未见任何不良反应，说明疫苗的安全性良好。
5、禽霍乱蜂胶灭活疫苗对小白鼠的短期交叉保护实验取60只体重为15-18g的健康禽霍乱抗体阴性小白鼠，随机分为三组，每组20只，分别于背部皮下注射0.3ml新型禽霍乱蜂胶灭活疫苗、常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗和生理盐水。14天后，各组分别用2倍最小致死剂量的禽多杀性巴氏杆菌C48-3株和P1662株进行攻毒(其中禽多杀性巴氏杆菌C48-3株和P1662株的最小致死剂量分别为25CFU和20CFU)。每种细菌攻毒10只小白鼠，攻毒后观察2周，计算免疫保护率。实验结果参见表1。
表1 禽多杀性巴氏杆菌疫苗短期交叉保护实验结果
结果显示用本发明方法制备的禽霍乱蜂胶灭活疫苗对同型菌(C48-3株)的免疫保护率达100％，对异型菌(P1662)的免疫保护率达90％；常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗对同型菌的免疫保护率为100％，而对异型菌的免疫保护率仅为30％；生理盐水对照组动物全部死亡。说明用本发明方法制得的禽霍乱蜂胶灭活疫苗的短期交叉免疫保护力明显优于常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗。
6、用本发明方法制得的禽霍乱蜂胶灭活疫苗对鸡的长期交叉免疫保护实验取60只2月龄大的健康禽霍乱抗体阴性鸡，随机分为三组，每组20只，分别于胸部肌肉注射1ml新型禽霍乱蜂胶灭活疫苗、常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗和生理盐水，180天后各组分别用2倍最小致死剂量的禽多杀性巴氏杆菌C48-3株和P1662株进行攻毒，每组细菌攻毒10只鸡，攻毒后观察2周，计算免疫保护率。实验结果参见表2。
表2 禽多杀性巴氏杆菌疫苗长期交叉保护实验结果
实验结果显示用本发明方法制得的禽霍乱蜂胶灭活疫苗对同型菌(C48-3株)的免疫保护率达80％，对异型菌(P1662)的免疫保护率达70％；常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗对同型菌的免疫保护率为80％，而对异型菌的免疫保护率仅为10％；生理盐水对照组动物全部死亡。说明用本发明方法制得的禽霍乱蜂胶灭活疫苗的长期交叉免疫保护力明显优于常规禽霍乱蜂胶灭活疫苗。
实施例二本发明用于大肠杆菌灭活疫苗的制备方法及其免疫保护性实验本实施例涉及的标准大肠杆菌CMCC44115株冻干菌种(血清型为O2型)，购自中国兽医药品监察所，由该所鉴定和保存。
1、菌种复壮及制苗用菌液制备冻干菌种以1ml无菌生理盐水溶解后，在血液马丁琼脂培养基上划线接种，37C培养20-22小时。将长出的细菌洗下，在鸡体内连续传代2次复壮，取肝脏病料划线接种于血液马丁琼脂培养平板，37℃培养20-22小时。取4-6个典型菌落划线接种于血液马丁琼脂斜面，37℃培养20-22小时。培养结束后每管斜面加入2ml无菌生理盐水将培养物洗下，转接到含血红素马丁肉汤的三角瓶内，肉汤培养基内添加了200umol/L 2，2’-联吡啶作为铁螯合剂，也可用5-10umol/L的去铁敏或者0.2-0.4mg/ml的乳铁蛋白代替。37℃培养24小时。将培养后的菌液6000rpm离心30min，再将上清液用超滤法(所用滤膜最小截留分子量为10kDa)浓缩100倍，用截留的浓缩液将离心沉淀的细菌洗下，不经洗涤直接将菌液浓度调整至50-100亿CFU/ml。再加0.3％(体积百分比)的甲醛，37℃下灭活24h，期间摇匀数次，经无菌检测安全后4-8℃冷藏备用。
2、油乳剂的制备以稀释液将细菌稀释成含所需浓度(175CFU/ml)的菌液，添加2％的吐温-80为水相；以7号矿物油加入6％的司班-80，然后每100ml加入2g硬脂酸铝为油相。
3、本发明用于大肠杆菌灭活疫苗配制以2.5份油相中加入1份水相，经高速乳化2min，并加入1∶10000的硫柳汞，制成油包水新型大肠杆菌灭活疫苗。
4、交叉免疫保护力测定取40只7日龄大肠杆菌非免疫肉仔鸡，随机分为2组，每组20只，第一组胸部肌注制备好的疫苗(0.3ml/只)，第二组胸部肌注相同体积的生理盐水。14天后分别用2倍最小致死剂量的大肠杆菌O2血清型菌株和O78血清型菌株交叉攻毒，每种细菌攻毒10只鸡，观察2周，计算免疫保护率。实验结果参见表3。
表3 用本发明方法制得的大肠杆菌疫苗交叉保护实验结果比较
实验结果显示用本发明方法制得的大肠杆菌灭活疫苗对同型菌(O2血清型菌株)的免疫保护率达100％，对异型菌(O78血清型菌株)的免疫保护率达90％。对照组鸡全部死亡，说明用本发明方法制得的大肠杆菌灭活疫苗具有良好的短期交叉免疫保护效果。
实施例三本发明用于鸭疫里氏杆菌疫苗的制备方法及其免疫保护性实验。
本实施例涉及的鸭疫里氏杆菌冻干菌种(血清型为I型)分离自临床病死鸭体内。
1、菌种复壮及制苗用菌液制备冻干菌种以1ml无菌生理盐水溶解后，接种于血清营养肉汤，37℃培养16-18小时。取培养液接种于血清营养琼脂平板，37℃培养16-18小时。将长出的细菌用灭菌生理盐水洗下，作为种子液。将种子液按培养液体积5％的比例接种到制造疫苗用的含血红素血清的肉汤培养基中，肉汤培养基内添加了200umol/L 2，2′-联吡啶作为铁螯合剂，也可用5-10umol/l的去铁敏或者0.2-0.4mg/ml的乳铁蛋白代替。37℃通气摇床培养24h，将培养后的菌液6000rpm离心30min，再将上清液用超滤法(所用滤膜最小截留分子量为10kDa)浓缩100倍，用截留的浓缩液将离心沉淀的细菌洗下，不经洗涤直接将菌液浓度调整至150-300亿CFU/ml。再加0.3％(体积百分比)的甲醛，37℃下灭活24h，期间摇匀数次，经无菌检测安全后4-8℃冷藏备用。
2、油乳剂的制备以稀释液将细菌稀释成含所需浓度(175CFU/ml)的菌液，添加2％的吐温-80为水相；以7号矿物油加入6％的司班-80，然后每100ml加入2g硬脂酸铝为油相。
3、本发明用于鸭疫里氏杆菌灭活疫苗配制以2.5份油相中加入1份水相，经高速乳化2min，并加入1∶10000的硫柳汞，制成油包水鸭疫里氏杆菌灭活疫苗。
4、交叉免疫保护力测定取40只7日龄鸭疫里氏杆菌非免疫小鸭，随机分为2组，每组20只，第一组胸部肌注制备好的疫苗(0.3ml/只)，第二组胸部肌注相同体积的生理盐水。14天后分别用2倍最小致死剂量的鸭疫里氏杆菌I型血清型菌株和II型血清型菌株交叉攻毒，每种细菌攻毒10只鸭，观察2周，计算免疫保护率。实验结果参见表4。
表4 交叉保护实验结果比较
实验结果显示用本发明方法制得的鸭疫里氏杆菌灭活疫苗对同型菌(I型血清型菌株)的免疫保护率达100％，对异型菌(II型血清型菌株)的免疫保护率达90％。对照组小鸭全部死亡，说明用本发明方法制得的鸭疫里氏杆菌灭活疫苗具有良好的短期交叉免疫保护效果。
权利要求
1.一种具有交叉保护力的革兰氏阴性病原菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、采用添加有铁螯合剂的固体培养基或液体培养基，取菌种复壮后用所述培养基进行体外培养；b、对固体培养基培养的细菌，用灭菌的疫苗稀释液洗下，直至最终菌液浓度达到本行业标准；或者对上述最终菌液浓度低于本行业标准的菌液以及用液体培养基培养的菌液进行浓缩，保留菌体和脱落的外膜蛋白，直至最终菌液浓度达到本行业标准；c、对步骤b获得的最终菌液用体积百分比为0.1-0.3％的甲醛灭活；d、加入佐剂，制成疫苗。
2.根据权利要求1所述的具有交叉保护力的革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤b对菌液浓缩的方法是用低速离心或微滤法进行菌体和液体分离，将所述液体用超滤法进行浓缩，所用滤膜的最小截留分子量不大于25kDa，不小于0.5kDa，然后用浓缩后的液体将沉淀的菌体悬浮直至最终菌液浓度达到本行业标准。
3.根据权利要求1或2所述的具有交叉保护力的革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤a培养基中添加的铁螯合剂为150-200umol/L的2，2’-联吡啶，或者为5-10umol/L的去铁敏，或者为0.2-0.4mg/mL的乳铁蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的具有交叉保护力的革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤d所述佐剂可以采用蜂胶水提取液、蜂胶乙醇提取液、油乳剂、脂质体。
5.根据权利要求3所述的具有交叉保护力的革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于步骤d所述佐剂可以采用蜂胶水提取液、蜂胶乙醇提取液、油乳剂、脂质体。
全文摘要
本发明公开了一种具有交叉保护力的革兰氏阴性病原菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤a.采用添加有铁螯合剂的固体培养基或液体培养基，取菌种复壮后用所述培养基进行体外培养；b.对固体培养基培养的细菌，用灭菌的疫苗稀释液洗下，直至最终菌液浓度达到本行业标准；或者对上述最终菌液浓度低于本行业标准的菌液以及用液体培养基培养的菌液进行浓缩，保留菌体和脱落的外膜蛋白，直至最终菌液浓度达到本行业标准；c.对步骤b获得的最终菌液用体积百分比为0.1－0.3％的甲醛灭活；d.加入佐剂，制成疫苗。本发明方法工艺简单，制造成本低，容易实现产业化。
文档编号A61P31/00GK101036783SQ20071003473
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月13日 优先权日2007年4月13日
发明者徐海军 申请人:徐海军