一种动物防御素保健制品及用途的制作方法

技术领域：

本发明属于动物保健用品，具体就是一种动物使用的防御素保健制剂品。

背景技术：
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防御素(defensins)是生物体在抵御病原微生物侵袭的防御反应过程中产生的一种基本物质，分子量一般在4kd-10kd之间。防御素的功能和应用情况如下：

(1)防御素在机体的防御系统中起重要作用

动物每天会直接接触、食入、吸入大量的病原微生物而不患感染性疾病，这种抵抗外来致病微生物的能力主要是通过天然免疫的防御机制得以实现的。防御素是所有物种中天然防御机制的重要组成部分，具有广谱的抗菌活性，能杀灭革兰氏阴性菌及阳性菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞以及一些囊膜病毒如hiv、肝炎病毒等。防御素通过趋化作用参与机体的获得性免疫过程，实验证明a-防御素能够吸引t细胞，有趋化作用，使之回流至炎症部位，从而在细胞免疫反应中发挥作用。防御素的趋化作用有利于炎症效应细胞及效应分子向感染部位的回流，使机体能更有效的杀灭病原微生物。防御素还具有提高动物免疫水平和特异性免疫抗体水平，调节动物的生长发育。从另一方面来讲，防御素也是获得性免疫反应中效应细胞的重要活性介质，例如在b细胞能合成防御素，对入侵的病源微生物起直接杀菌作用，所以防御素是天然免疫与机体获得性免疫的桥梁，在机体抵御外来病原微生物的入侵中起着重要的作用。

(2)防御素有重要的应用价值

防御素对很多病原微生物有杀灭作用，包括一些抗生素耐药株，它们能快速杀灭病原微生物而不易产生耐药的突变株，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。防御素与一些传统的抗生素、其他抗菌分子、溶菌酶有协同作用。因此更多的研究焦点是将其发展为新的抗微生物药，应用在治疗感染，食品防腐剂，饲料添加剂等领域。

技术实现要素：

为了充分发挥防御素的抗病原微生物的作用，本发明的目的是提供一种利用鸵鸟皮肤提取制作的动物防御素保健制品。

本发明的技术方案是以下述方式实现的：

一种动物防御素保健制品：它是以液氮冷冻的生鲜鸵鸟皮肤为原料、经过下述制作步骤：

(1)将液氮冷冻的生鲜鸵鸟皮肤置5％～5.5％乙酸冰水混合物中混合、匀浆、水浴、离心、上清液浸提过夜；

(2)将步骤(1)中的沉淀物用等体积5％～5.5％乙酸混合，再次搅拌浸提过夜，离心取上清液：

(3)合并步骤(1)、(2)中的两次上清液，调整ph值至6.0，离心，保留上清液；

(4)将上清液上样于sephadexg-100凝胶柱，用乙酸钠洗脱，经核酸蛋白检测仪检测后，自动收集器收集，通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对大肠杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存，真空度-60kpa～-75kpa、冷冻干燥温度为-10℃～-15℃、时间为18h～20h，制得防御素制品上述步骤1中液氮冷冻的生鲜鸵鸟皮肤重量与乙酸冰水混合物的体积比按1:10～15，上述步骤1中水浴的温度为95℃～100℃灭活样品中的其他微生物、时间为10min～12min，然后迅速冷却至室温；

上述步骤4中乙酸钠水溶液浓度为0.20mol/l～0.25mol/l。

上述步骤中(1)：

所述的液氮冷冻的生鲜鸵鸟皮肤冷冻需先剪碎；所述的离心速度为4000r/min、时间为40min。

上述步聚4中：

所述的自动收集器收集，每4分钟收集一管，每管1.6ml。

上述步聚4中：

所述的乙酸钠水溶液浓度为0.2mol/l，恒流泵的速度为4滴/分，经核酸蛋白检测仪检测后有od值，收集值在0.3～0.6的收集管，意味着有蛋白。

上述防御素制品在制备动物保健食品中的应用。

本发明人发现：低温/室温保存对防御素空间结构影响较大，易失活。有抑菌作用的洗脱液经真空冷冻可有效保存其活

防御素的活性检测:

鸵鸟皮肤经乙酸浸提，sephadexg-100葡聚糖凝胶分离后，出现两个峰，选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行体外抗菌活性试验。结果表明：提取的抗菌肽对g+和g-都有抑菌作用，且抑菌作用的主要在第二峰，但皮肤抗菌肽对大肠杆菌的抑菌结果更明显。1g鸵鸟皮肤经乙酸(1:10w/v)提取后，一般可得到12ml提取液。sephadexg-100每次分离2ml提取液，一般得到5ml有抑制细菌活性的洗脱液，经真空冷冻干燥，可得到约5mg含有少量的乙酸钠盐成分及一些杂蛋白的蛋白成分，有效抑菌浓度为3.2-6.4mg/ml。

本发明的积极效果是：

本发明防御素制品可调节动物免疫功能，包括促进中枢免疫功能，增强疫苗的免疫效果。防御素上调鸡免疫器官的免疫反应，法氏囊和胸腺是中枢免疫器官，是免疫细胞发生，分化，成熟的场所。脾脏是外周免疫器官捕获和消化抗原。鸵鸟皮肤防御素(1μg/ml)作为无害抗原促进中枢免疫器官的成熟。我们的实验通过观察组织学切片也没有检测到防御素对细胞的损伤，也证明了在实验中使用的鸵鸟皮肤防御素浓度没有发现毒性作用。可能有部分鸵鸟皮肤防御素在消化道被蛋白酶降解，但是实验结果证明口服途径还是有效果。

附图说明：

图1为本发明的鸵鸟皮肤抗菌肽粗提物在sephadexg-100层析行为。

图2为鸵鸟皮肤抗菌肽对抗原刺激的雏鸡免疫器官淋巴细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例一

取液氮冷冻的新鲜鸵鸟皮肤，称重，剪碎；按鸵鸟皮肤与乙酸冰水混合物的重量体积(w/v)比为1:10比例加入5％乙酸冰水混合物，手动匀浆器匀浆，100℃水浴10min，然后迅速冷却，4000r/min离心30min去除沉淀。取上清液4℃浸提过夜，将沉淀物用等体积5％乙酸混合，再次搅拌浸提过夜，离心取上清液。合并两次上清液，调整ph值至6.0，4000r/min离心30min，保留上清液。将上清液上样于sephadexg-100凝胶柱，用0.2mol/l乙酸钠溶液洗脱，恒流泵的速度为4滴/分，经核酸蛋白检测仪检测有od值，收集值在0.3的收集管，自动收集器收集，每4分钟收集一管，每管1.6ml，通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对大肠杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存。

低温/室温保存对防御素空间结构影响较大，易失活。有抑菌作用的洗脱液经真空冷冻干燥，真空度-60kpa、冷冻温度-10℃、时间18h，可有效保存其活性。

实施例二

取液氮冷冻的新鲜鸵鸟皮肤，称重，剪碎；按鸵鸟皮肤与乙酸冰水混合物的重量体积(w/v)比为1:10～15比例加入5.5％乙酸冰水混合物，手动匀浆器匀浆，100℃水浴10min，然后迅速冷却，4500r/min离心40min去除沉淀。取上清液4℃浸提过夜，将沉淀物用等体积5.5％乙酸混合，再次搅拌浸提过夜，离心取上清液。合并两次上清液，调整ph值至6.0，4500r/min离心40min，保留上清液。将上清液上样于sephadexg-100凝胶柱，用0.2mol/l乙酸钠水溶液洗脱，恒流泵的速度为4滴/分，经核酸蛋白检测仪检测有od值，收集值在0.3的收集管，自动收集器收集，每4分钟收集一管，每管1.6ml，通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对大肠杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存。

低温/室温保存对防御素空间结构影响较大，易失活。有抑菌作用的洗脱液经真空冷冻干燥，真空度-65kpa、冷冻温度-12℃、时间19h，可有效保存其活性。

实施例三

取液氮冷冻的新鲜鸵鸟皮肤，称重，剪碎；按鸵鸟皮肤与乙酸冰水混合物的重量体积(w/v)比为1:12比例加入5.2％乙酸冰水混合物，手动匀浆器匀浆，100℃水浴10min，然后迅速冷却，4200r/min离心42min去除沉淀。取上清液4℃浸提过夜，将沉淀物用等体积5.2％乙酸混合，再次搅拌浸提过夜，离心取上清液。合并两次上清液，调整ph值至6.0，4300r/min离心40min，保留上清液。将上清液上样于sephadexg-100凝胶柱，用0.2mol/l乙酸钠水溶液洗脱，恒流泵的速度为4滴/分，经核酸蛋白检测仪检测有od值，收集值在0.3的收集管，自动收集器收集，每4分钟收集一管，每管1.6ml，通过琼脂糖弥散方法检测各收集管液体对大肠杆菌的抗菌活性，收集有抑菌作用的洗脱液，真空冷冻干燥保存。

低温/室温保存对防御素空间结构影响较大，易失活。有抑菌作用的洗脱液经真空冷冻干燥，真空度-75kpa、冷冻温度-15℃、时间20h，可有效保存其活性。

本发明防御素制器的应用实例如下：

一、1ug/ml的防御素可调节动物免疫功能，包括促进中枢免疫功能，增强疫苗的免疫效果如表1、表2。

表1鸵鸟皮肤防御素对雏鸡免疫器官指数和体重的影响

注：免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)/雏鸡体重(g)

表2雏鸡免疫ibd疫苗后血清中ibdv抗体滴度的变化(490nmod)

ibd：鸡传染性法氏囊炎

ibdv：鸡传染性法氏囊炎病毒

从表1、表2中可以看出：为研究鸵鸟皮肤防御素是否对雏鸡的体重有影响，本研究在1、4、7、10、17日龄对雏鸡的体重进行了记录，结果见表1。由此结果可知，对照组和鸵鸟皮肤防御素组雏鸡的体重无明显差别，统计学上没有差异。为研究鸵鸟皮肤防御素是否对雏鸡的免疫器官指数有影响，本研究在1、4、7、10、17日龄对雏鸡的免疫器官重量和体重进行了记录，并计算免疫器官指数，结果见表1。由此结果可知，与对照组比较，鸵鸟皮肤防御素提高了7～17日龄雏鸡的胸腺指数，4～7日龄雏鸡的法氏囊指数并且在4日龄差异显著(p<0.10)。鸵鸟皮肤防御素组4～17日龄雏鸡的脾脏指数低于对照组雏鸡，但无统计学差异，其余各组无统计学差异(p>0.05)。

为研究鸵鸟皮肤防御素与疫苗是否有协同作用，本研究对鸵鸟皮肤防御素组和对照组雏鸡常规滴鼻点眼接种ibdv疫苗，在疫苗免疫后选取一些时间点观察两组雏鸡血清中ibdv抗体滴度的变化。结果见表2，由结果可见在实验的观察期间，即疫苗免疫后14～35d，鸵鸟皮肤防御素组雏鸡血清中ibdv抗体水平高于对照组，并且在第21d明显高于对照组，且差异显著(p<0.05)。

从图1中可以看出：本发明防御素制品对多种细菌病毒有明显的抑制或杀灭作用，如对多杀性巴氏杆菌有杀灭作用，最低杀死浓度0.16mg/ml。从图1中还可以看出：有抑菌作用的主要在第二峰，琼脂糖弥散方法检测洗脱液对巴氏杆菌的抑菌作用，主要集中在7～10管。

从图2中可知：鸵鸟皮肤抗菌肽对抗原刺激的雏鸡免疫器官淋巴细胞增殖的影响中可以看出：由于此防御素在功能上具有免疫调节作用，可开发为绿色环保型动物保健剂。