免疫调节组合物和其用途的制作方法

专利名称：免疫调节组合物和其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及免疫反应的调节。更特别地，本发明涉及基本上由Gag多肽或其 至少一部分，和可选的抗原呈递细胞或其前体组成的组合物，用于治疗或预防慢病毒感染， 包括相关的获得性免疫缺陷疾病的治疗或预防。在某些具体实施方式
中，该组合物基本由 多种重叠的和/或不重叠的源自单一 Gag多肽或源自不同Gag多肽的肽组成。本说明书中各种通过数字引用的出版物的书目详情在本说明书的末尾列出。
背景技术：
需要有效的用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的免疫治疗方法。药物治疗终生伴有显 著的毒性。迄今，几个使用常规疫苗的HIV免疫治疗尝试在人类试验中免疫原性差且效率 低下1_4。使用专能抗原呈递细胞如树突状细胞递送HIV免疫治疗剂已经在猕猴(macaque) 和人类先导研究中显示出功效但是限于高度专门化的设备5’6。一种简单的减少长期抗逆转 录病毒治疗(ART)需要的间歇型免疫治疗方法将是治疗HIV的一大进步。最近，本发明人开发了一种免疫治疗方法，其涉及用重叠的病毒衍生的肽处理未 分级的全血或外周血单核细胞(PBMC)。显著地，这一简单的免疫治疗方法，称为OPAL (重叠 的肽脉冲的自体白细胞)，在远亲后代群体中产生了强有力的细胞介导的对抗病毒感染包 括HIV感染的免疫反应7’8。OPAL技术具有几个优点，包括(1)不需要离体地长期培养抗原 呈递细胞，(2)诱导针对结构和调节蛋白的CD4+和CD8+T细胞反应，和(3)促进产生肽抗原 在内。现在，本发明人发现，当短尾猕猴用暴露于重叠猿猴免疫缺陷病毒(SIV)肽的新 鲜血细胞免疫时，在针对单独Gag免疫的动物(“OPAL-Gag动物”)和针对整个SIV基因组 免疫的动物(“0PAL-ALL动物”)之间没有病毒结果的差异，这显示单独的Gag是用于T细 胞免疫治疗方法的有效抗原。另外，出乎意料地发现在OPAL-Gag动物中Gag-特异性CD4+ 和CD8+T细胞反应显著大于在OPAL-All动物中的Gag-特异性⑶4+和⑶8+T细胞反应，虽 然Gag重叠肽的剂量相同。这表明，在来自Gag的肽和其它SIV蛋白之间有抗原竞争性，也 表明，通过多蛋白HIV疫苗诱导免疫显性的非Gag T细胞反应可以限制治疗性或预防性Gag 特异性T细胞反应的开发。已经将这些发现引入新型组合物的实践中和用于治疗或预防慢 病毒感染，包括与那些感染相关的疾病的治疗和预防方法的实践中。

发明内容
因此，本发明的一个方面提供了治疗或预防受试者慢病毒感染的方法，其中所述 方法基本上由增加受试者抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体的数目组成，所述抗原呈递细 胞或抗原呈递细胞前体在其表面上呈递至少一个含有对应于Gag多肽一部分的氨基酸序 列的肽。这样的抗原呈递细胞和前体在本文也分别称作“Gag特异性抗原呈递细胞”和“Gag 特异性抗原呈递细胞前体”。非限制性的抗原呈递细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和朗格汉 斯细胞。
本发明考虑到任何增加受试者Gag特异性抗原呈递细胞或前体的数目的适当方 法。在一些具体实施方式
中，向受试者施予增加抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体的数目 的免疫刺激剂，所述抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体在其表面呈递至少一个包含对应于 Gag多肽一部分的氨基酸序列的肽。在这类说明性例子中，免疫刺激剂是抗原呈递细胞或 前体的形式，其在足以使抗原呈递细胞或其前体呈递Gag多肽或肽，或Gag多肽或肽的经处 理形式的条件下，与基本上由Gag多肽或至少一个含有对应于Gag多肽的氨基酸序列的肽 组成的组合物接触一段时间。在其它说明性例子中，免疫刺激剂是抗原呈递细胞或抗原呈 递细胞前体的形式，其含有包含编码Gag多肽或至少一个包含对应于Gag多肽一部分的氨 基酸序列的肽的核苷酸序列的核酸构建体，其中核苷酸序列可操作地连接至在抗原呈递细 胞或其前体中可操作的调节元件。这样的核酸构建体在本文也被称为“表达Gag的核酸构 建体”。还是在其它说明性例子中，免疫刺激剂是基本上由至少一个Gag分子组成的组合物 的形式，所述Gag分子选自Gag多肽、含有对应于Gag多肽一部分的序列的肽或表达Gag的 核酸构建体。在这类说明性例子中，各个Gag分子是适合于引入(例如通过转化、内化、内 吞作用或吞噬作用)抗原呈递细胞或其前体的形式，其包括可溶的和颗粒形式的Gag分子。 在一些具体实施方式
中，颗粒含有Gag分子或Gag分子与颗粒结合，其说明性例子包括脂质 体、微粒、脂质颗粒、陶瓷/无机颗粒和聚合物颗粒。在一些具体实施方式
中，方法不包括向 受试者施予抗原呈递细胞，所述细胞在其表面呈递包含对应于其它慢病毒多肽的部分的氨 基酸序列的肽。在一些具体实施方式
中，方法不包括向受试者施予与其它慢病毒分子接触 的其它慢病毒分子或抗原呈递细胞，其中其它慢病毒分子选择慢病毒的非Gag多肽、慢病 毒的非Gag多肽的部分或其中非Gag多肽或非Gag多肽部分可以表达的核酸构建体。在一 些具体实施方式
中，组合物含有由至少一个Gag分子组成的蛋白质性质的成分，所述Gag分 子选自Gag多肽、包含对应于Gag多肽一部分的序列的肽或表达Gag的核酸构建体。在某些具体实施方式
中，免疫刺激剂与药学上可接受的载体和/或稀释剂一起施 予。或者，或另外，免疫刺激剂与佐剂或与稳定上面广泛描述的Gag分子而免受宿主的酶降 解的化合物一起施与。合适地，慢病毒选自人类免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺陷病毒 (SIV)。在一些具体实施方式
中，免疫刺激剂基本上由多个肽组成，其中各个肽包含对应 于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分，和可选地，与多个肽的至少一个其他肽显示部分序 列同一性或相似性。在这类说明性例子中，在各个肽的一端或两端含有部分序列同一性或 相似性。合适地，在一个或两个这些末端上有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个连续的 氨基酸残基，其序列与至少一个其它肽中含有的氨基酸序列相同或相似。在某些具体实施 方式中，肽的长度为至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29或30个氨基酸残基，并且合适地不多于约500、200、100、80、60、50、40个氨基 酸的长度。合适地，选择肽的长度从而增加细胞溶解性T淋巴细胞反应的产生(例如长度 为约8至约10个氨基酸的肽)或T辅助细胞淋巴细胞反应的产生(例如长度为约12至20 个氨基酸的肽)。在一些具体实施方式
中，肽序列源自至少约30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42.43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的对应于Gag多肽的序列。在特定的具体实施实施方式中，多个肽包含来自两个或更多不同Gag多肽的肽。因此，在相关的方面，本发明考虑到用于在受试者中治疗或预防慢病毒感染的方 法，其中该方法包括在受试者中增加Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞 前体的数目的方法，所述Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体在其表 面上呈递至少一个包含对应于Gag多肽一部分的氨基酸序列的肽，其中Gag特异性抗原呈 递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体通过如下方式产生在足以使抗原呈递细胞或前 体在其表面上呈递肽或肽的经处理形式的条件下，将抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体与 基本上由多个肽组成的组合物接触一段时间，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的 氨基酸序列的不同部分和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似 性。在一些具体实施方式
中，向受试者施与Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈 递细胞前体。在其它具体实施方式
中，向受试者施与组合物。本发明的另一个方面提供用于治疗与预防慢病毒感染的组合物，其中所述组合物 基本上由下列物质组成如上广泛描述的Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递 细胞前体，或如上广泛描述的，选自Gag多肽、包含对应于Gag多肽一部分的序列的肽或表 达Gag的核酸构建体的至少一个Gag分子。在一些具体实施方式
中，所述Gag分子或每个 Gag分子是颗粒的形式。在相关的方面，本发明提供用于产生治疗或预防慢病毒感染的抗原呈递细胞的方 法。这些方法通常包括在足以使抗原呈递细胞或其前体在其表面上呈递包含对应于一部 分Gag多肽的氨基酸序列的至少一个肽的条件下，将抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体与 基本上由选自Gag多肽、包含对应于Gag多肽一部分的序列的肽或表达Gag的核酸构建体 (如上广泛描述)组成的组合物接触一段时间。合适地，当使用前体时，在足以从前体分化 抗原呈递细胞的条件下培养前体一段时间。在一些具体实施方式
中，所述Gag分子或每个Gag分子实质上与纯化的抗原呈递 细胞或其前体的群体接触。在其它的具体实施方式
中，单个Gag分子与抗原呈递细胞或其 前体的异质群体接触。在这些具体实施方式
中，细胞的异质群体可以是血或外周血单核细 胞。抗原呈递细胞或其前体一般选自单核细胞、巨噬细胞、骨髓系细胞、B细胞、树突状细 胞或朗格汉斯细胞。还在其它的具体实施方式
中，将Gag分子与未培养的抗原呈递细胞或 其前体的群体接触。因此，未培养的群体可以是同质的或异质的，其说明性例子包括全血、 新鲜血或其组分，如但不限于，外周血单核细胞、全血的棕黄层组分、沉积的红细胞、经辐射 的血、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞和天然杀伤T 细胞。在一些具体实施方式
中，与Gag分子接触的未培养的群体ο未经历激活条件。上面广泛描述的Gag特异性抗原呈递细胞还可以用于产生淋巴细胞，包括T淋巴 细胞和B淋巴细胞，用于调节针对Gag多肽的免疫反应。因此，在另一个方面，本发明提供 了用于产生Gag预处理的(primed)淋巴细胞的方法，其中所述方法包括在足以使淋巴细胞 对Gag多肽起始反应的条件下，将淋巴细胞或其前体的群体与如上广泛描述的Gag特异性 抗原呈递细胞接触。在另一个方面，本发明包括用于在受试者中治疗或预防慢病毒感染的方法。这些 方法通常包括以有效治疗或预防慢病毒感染的量向受试者施与如上广泛描述的免疫刺激 剂或如上广泛描述的Gag预处理的淋巴细胞。在一些具体实施方式
中，免疫刺激剂或Gag预处理的淋巴细胞为全身给药，通常通过注射进行。在相关的方面，本发明提供了用于在受试者中治疗或预防获得性免疫缺陷疾病的 方法。这些方法通常包括以有效治疗或预防疾病的量向受试者施与如上广泛描述的免疫刺 激剂或如上广泛描述的Gag预处理的淋巴细胞。在另一个方面，本发明考虑到如上广泛描述的免疫刺激剂或如上广泛描述的Gag 预处理的淋巴细胞用于治疗或预防选自慢病毒感染或获得性免疫缺陷疾病的状况的用途。 在一些具体实施方式
中，该用途包括制备适合于治疗或预防该状况的药物。


图1是说明OPAL接种的T细胞免疫原性的图示。通过细胞内细胞因子染色随时 间研究表达IFN-γ的SIV Gag特异性⑶4(a)和⑶8(b)T细胞。显示了相对于对照的未 接种动物(圆圈)的疫苗组的平均值士标准误差。猕猴的最初OPAL接种(箭头，SIVma。251 感染后4、6、8和10周)由用重叠的SIV Gag 15mer肽(OPAL-Gag，三角)或跨越所有9个 SIV蛋白的肽(0PAL-A11，方块)脉冲的自体PBMC组成。最初的接种在抗逆转录病毒治疗 (ART)的覆盖下施与。在相同的随机组中，无ART，在39、42和42周用OPAL免疫治疗再次激 发动物。在12周，在最后接种后的两周，通过细胞内细胞因子染色在所有动物中评估相对 于跨越SIV Gag、Env、Pol的重叠肽或组合的调节/辅助蛋白质(Nef、Tat、Rev、Vif、Vpx, Vpr [Reg])集合的CD4(c)和⑶8 (d) T细胞的比例。另外，对SIV Gag CD8T细胞抗原决定簇 KP9的反应通过Mane-A*10/KP9四聚体评估。疫苗组的平均值士标准误差与< 0. 10的两 侧t-检验ρ值一起显示。(e)在所有21只活的OPAL免疫动物中，SW Gag特异性⑶8T细 胞反应与对非Gag(Env+P0l+调节蛋白质)反应总合的CD8T细胞反应是反向相关的。对合 并的群有> 50%⑶8T细胞反应的动物有50. 4%和54. 5%的总反应，主要是针对Env (分别 为50. 和54. 2% )。显示了斯皮尔曼等级相关。图2是显示了 OPAL免疫治疗效率的图示。在最后接种后第10周撤掉抗逆转录病 毒治疗(ART)，且随后撤掉(a)血浆SIV RNA。利用ART控制了病毒血症的26只动物用疫 苗组的平均值士标准误差显示。(b)显示了接种和对照动物的存活。图3是显示了 OPAL接种的非Gag T细胞免疫原性的图示。通过对Env (a、b)、 Pol (c、d)和跨越结合的调节/辅助蛋白质的重叠肽的集合的细胞内细胞因子染色随时间 研究了表达IFN- γ的SIV特异性⑶4+和⑶8+T细胞(RTNVVV，e、f)。显示了相对于未接 种的动物(圆圈)的免疫组的平均值士标准误差。在第4-10周给予四个最初接种，在第 36-42周给予第二组的3个免疫接种。图4是显示了 CD8+T细胞Env应答者(responder)和Gag应答者之间的比较的图 示。研究了 6只只有Env的应答者，3只只有Gag的应答者，具有Env和Gag特异性⑶8T细 胞反应的3只动物和7只未接种的对照。A.病毒装载。B.外周⑶4T细胞水平。C.显示了 在感染后第44周安乐死的6只只有Env应答者中的2只，在第64周安乐死的3只Gag应 答者中的0只，在第44周安乐死的具有Env和Gag特异性反应的3只动物中的2只，在第 64周安乐死的11只对照动物中的7只的存活图。不包括ManeA*10阳性动物。最后，将进 行前进分析的观察用于VL和CD4+T细胞的计数，其中动物在第64周前安乐死。
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具体实施例方式1.定义除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的本领域技 术人员通常理解的相同意思。虽然与本文描述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和 材料可以用于本发明的实施或测试中，描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下面 限定了下列术语。本文使用的冠词“a”和“an”是指一个或一个以上(例如至少一个)冠词的语法 对象。通过举例子的方式说明，“一个元件”意思是一个元件或一个以上的元件。“约”的意思是相对于参考的数量、水平、值、数目、频率、百分率、尺寸、大小、量、重 量或长度以如30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 %—样多改变的数量、水平、值、数
目、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度。术语“激活条件”是指引起CD2、CD83、CD14、MHC I类、MHC II类和TNF_ a中的 每一个的表达的处理条件，所述表达的水平或功能活性由选自下列的激活处理条件引起 在选自细胞因子(例如IL-4、GM-CSF或I型干扰素)、趋化因子、促细胞分裂原、脂多糖的 试剂存在下或在抗原呈递细胞或其前体中诱导干扰素合成的试剂存在下，孵育抗原呈递细 胞或其前体；或将抗原呈递细胞或其前体暴露于物理压力。但是，应该理解的是，术语“激 活的条件”不包括引起细胞可忽略的激活的处理条件，例如当20 %、15 %、10 %、9 %、8 %、 7%,6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 2%或 0. 1 % 以下的细胞被激活，或当 CD2、CD83、 ⑶14、MHCI类、MHC II类和TNF-a中每一个表达的水平或功能活性达到约10% (1/10)、 20% (1/5) ,30% (3/10) ,40% (2/5) ,50% (1/2) ,60% (3/5) ,70% (7/10) ,80% (4/5)或 90% (9/10)的经过上述激活处理条件处理的抗原呈递细胞或其前体中的水平或功能活 性。“抗原”的意思是能够在脊椎动物中优选在哺乳动物中引起免疫反应的全蛋白或 部分蛋白、肽或其他分子或大分子。这样的抗原还与来自用所述蛋白、肽或其他分子或大分 子免疫的动物的抗体反应。“抗原结合分子”的意思是对靶抗原具有结合亲和力的分子。应该理解的是，这一 术语扩展至源自显示抗原结合活性的蛋白构架的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球 蛋白。“自体的”意思是源自相同生物体的某些东西(例如细胞、组织等)。本文使用的术语“异体的(allogeneic) ”是指具有不同遗传组成的细胞、组织、器官等。“同种抗原”的意思是只在物种的一些成员中发现的抗原，如血型抗原。相反地， “异种抗原”是指在一个物种的成员中存在但不存在于另一个物种的成员的抗原。因此，“同 种异体移植(allograft) ”是相同物种成员之间的移植，“异种移植(xenograft) ”是不同物 种成员之间的移植。除非上下文需要，否则贯穿本说明书，单词“包含(comprise) ”、“包含 (comprises) ”和“包含(comprising) ”将被理解为意指包括所述步骤或元素，或步骤或元 素的组但不排除任何其它的步骤或元素，或步骤或元素的组。因此，术语“包含”等的使用表 明所列元素是需要的或强制的，但是其它元素是可选的，和可以存在或可以不存在。“由…
10组成”意思是包括但限于短语“由…组成”后的任何事物。因此，短语“由…组成”表明所列 元素是需要的或强制的，且没有其它元素可以存在。“基本上由…组成”的意思是包括任何 短语后所列的元素，且限于不干扰或影响本说明书中指定的所列元素的中活性或作用的其 它元素。因此，短语“基本上由…组成”表明所列元素是需要的或强制的，但是其他元素是 可选的和可以存在或可以不存在，而这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。如本文使用的，术语“培养(culturing) ”、“培养(culture) ”等是指体外使用的成 套过程，其中在显示为支持细胞体外生长或维持的条件下孵育细胞群体(或单个细胞)。本 领域认得广泛数目的形式、介质、温度范围、气体浓度等，其需要在培养系统中限定。所述参 数将基于所选的形式和实施本文公开的方法的个体的特殊需要而变化。但是，应认识到培 养参数的确定在本质上是常规的。“对应于(corresponds to) ”或“对应于(corresponding to) ”的意思是编码显示 与靶抗原中的氨基酸序列本质上相似的氨基酸序列的抗原。通常，抗原将显示与靶抗原的 至少一部分有约 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、 76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的相 似性或同一性。在调节免疫反应或治疗或预防疾病或状况的上下文中，“有效量”的意思是以单一 剂量或作为一系列剂量的部分向需要其的个体施与有效调节、治疗或预防的量的组合物。 有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类学组、组合物的组成、医疗 状况的评估和其他相关的因素而改变。据预期，该量将落入可以通过常规试验确定的相对 广的范围中。“表达载体”的意思是任何能够指导载体编码的蛋白合成的自主遗传元件。这样的 表达载体是本领域技术人员已知的。本文使用的术语“基因”是指任何和所有的细胞基因组的分离的编码区，以及相关 的非编码区和调节区。基因还预期指编码特异性多肽的开放阅读框、内含子和参与表达调 节的相邻的5’和3’非编码核苷酸序列。在这点上，基因可以进一步包含控制信号如启动 子、增强子、终止子和/或与给定基因天然相连的多腺苷酸化信号，或异源控制信号。DNA序 列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。基因可以引入合适的载体中用于染色体外维持或 用于整合进入宿主。如果一个化合物或组合物能够进行下列操作，则其是“免疫原性的” :a)在首次用 于实验的个体中产生针对抗原(例如病毒抗原)的免疫反应；或b)在个体中重建、激发或 维持超出不施与化合物或组合物时将发生的免疫反应的免疫反应。当施与单一或多剂量 时，如果化合物或组合物能够获得这些标准之一，其是免疫原性的。本文对“免疫相互作用”的参考包括对任何分子间的相互作用、反应或其他形式的 结合的参考，特别是其中分子之一是免疫系统的成分或免疫系统成分的模拟物。“分离的”的意思是本质上或基本上没有在其天然状态下正常伴随其的成分的材 料。术语“慢病毒”包括和包含灵长类动物慢病毒，例如人类免疫缺陷病毒1和2 型(HIV-1/HIV-2)；来自黑猩猩(SIV。PZ)、乌白眉猴(SIVsJ、非洲绿猴(SIV_)、Syke氏猴(SIVsyk)、山魈(SIV d)和猕猴(SIVma。)的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒还包括猫科动物 慢病毒例如猫科动物免疫缺陷病毒(FIV)；牛族动物慢病毒，例如牛免疫缺陷病毒(BIV)； 绵羊慢病毒，例如梅迪/威斯纳病毒(Maedi/Visnavirus，MVV)和山羊关节炎和脑炎病毒 (CAEV)；和马科动物慢病毒，例如马传染性贫血病毒(EIAV)。除了 Gag、Pol和Env蛋白以 外，所有的慢病毒还表达至少两个另外的调节蛋白质(Tat、Rev)。灵长类动物慢病毒产生其 它辅助蛋白质，包括Nef、Vpr、Vpu、VpX和Vif。通常，慢病毒是各种疾病，加上免疫缺陷，包 括神经退化和关节炎的病原体。各种慢病毒的核苷酸序列可以在GenBank中的下列登录号 下找到(来自 J. M. Coffin, S. H. Hughes和H. E. Varmus,"Retroviruses"ColdSpring Harbor Laboratory Press, 199, 7p 804) : 1) HIV-1 :K03455、M19921、K02013、M38431、M38429、 K02007 和 M17449 ；2)HIV_2 :M30502、J04542、M30895、J04498、M15390、M31113 和 L07625 ；3) SIV :M29975、M30931、M58410、M66437、L06042、M33262、M19499、M32741、M31345 和 L03295 ； 4)FIV :M25381、M36968 和 U11820 ；5)BIV. M32690 ；6)EIAV :M16575、M87581 和 U01866 ；6)威 斯纳病毒:M10608、M51543、L06906、M60609 和 M60610 ；7) CAEV :M33677 ；和 8)绵羊慢病毒 M31646和M34193。各种慢病毒多肽的氨基酸序列还在这些GenBank登录中提供。还可以 从美国模式培养物保藏所(ATCC)中获得慢病毒DNA。例如，猫科动物免疫缺陷病毒可以在 ATCC保藏号VR-2333和VR-3112下获得。马传染性贫血病毒A可以在ATCC保藏号VR-778 下获得。山羊关节炎和脑炎病毒可以在ATCC保藏号VR-905下获得。威斯纳病毒可以在 ATCC保藏号VR-779下获得。“调节”的意思是直接地或间接地增加或减少个体的免疫反应。在某些具体实施方 式中，“调节(modulation) ”或“调节(modulating)，，的意思是与抗原不存在或比如果单独 使用抗原时相比，所需的/所选的反应更有效(例如至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 % 或更多)，更快(例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多)，强度更大(例如至 少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多)，和/或更容易被诱导(例如至少10%、20%、 30%、40%、50%、60%或更多)。本文使用的术语“可操作连接的(operably connected) ”或“可操作连接的 (operably linked) ”的意思是将结构基因置于调节元件(包括但不限于启动子)的调节 控制之下，然后其控制基因的转录和可选的翻译。在异源启动子/结构基因组合的构建中， 通常优选的位置为遗传序列或启动子至基因转录起始位点的距离与该遗传序列或启动子 和在其天然环境中其控制的基因(即遗传序列或启动子源自于其的基因)之间的距离是大 约相同的。如本领域已知的，这一距离的一些变化是可以调节的而不丧失功能。相似地，关 于在调节序列元件控制下放置的异源基因，优选其定位由在其天然环境中的元件的定位限 定；即元件所源自的基因。术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”在本文可交换使用，是指任何受试者， 特别是脊椎动物受试者，更特别地是哺乳动物受试者，其需要治疗或预防。合适的落入本 发明范围的脊椎动物包括但不限于任何脊索动物亚门的成员，包括灵长类、啮齿类(例如 小鼠大鼠、豚鼠)、兔类(例如家兔、野兔)、牛类(例如牛(cattle))、绵羊类(例如绵羊 (she印))、山羊类(例如山羊)、猪类(例如猪)、马类(例如马)、犬类(例如狗)、猫类(例 如猫)、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅，伴侣鸟例如金丝雀、相思鹦鹉(budgerigar)等)、海洋 哺乳动物(例如海豚、鲸)、爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。优选的受试者是需要治疗
12或预防状况或疾病的灵长类(例如人、猴、黑猩猩)。但是，应该理解的是前面提到的术语不 意味着存在症状。“药学上可接受的载体”的意思是可以安全地用于局部或全身给药的固体或液体 的填充剂、稀释剂或封装物质。本文可交换使用的“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物和其变体和 合成类似物。因此，这些术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非 天然存在的氨基酸，如对应于天然存在的氨基酸的化学类似物以及天然存在的氨基酸聚合 物。本文对“启动子”的参考采取其最广泛的语境并且包括经典基因组基因的转录调 节序列，包括精确转录起始所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列和根据发育和/或环 境刺激而改变基因表达的另外的调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)，或以组织 特异性或细胞类型特异性的方式改变基因表达。启动子通常位于其调节表达的结构基因的 上游或5’，但并非必须。另外，含有启动子的调节元件通常位于基因转录的起始位点的2kb 内。根据本发明优选的启动子可以含有一个或多个特异性调节元件的额外拷贝从而增强在 细胞中的表达，和/或改变其可操作连接的结构基因的表达的周期。术语“纯化的多肽”或“纯化的肽”的意思是多肽或肽基本上没有来自所述多肽或 肽源自的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染性蛋白，或当被化学合成时基本上没有化 学前体或其他化学品。“基本上没有”的意思是本发明的Gag多肽或肽的制备物是至少10% 纯的。在某些具体实施方式
中，Gag多肽或肽的制备物具有约30%、25%、20%、15%、10% 和目标的5% (干重)以下的非肽蛋白(本文也称作“污染性蛋白”)或化学前体或非肽化 学品。本发明包括分离的或纯化的至少0. 01,0. 1,1. 0和10毫克干重的制备物。本文使用的术语“重组的多核苷酸”是指在体外通过操作核酸使成为自然中正常 情况下不能发现的形式形成的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体的形式。通 常，这样的表达载体包括与核苷酸序列可操作连接的转录和翻译调控核酸。“重组的多肽”意思是使用重组技术，即通过表达重组多核苷酸制备的多肽。“调控元件”或“调控序列”的意思是在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序 列所需的核酸序列(例如DNA)。适合原核细胞的调控序列例如包括启动子和可选的，顺式 作用序列如操纵基因序列和核糖体结合位点。适合真核细胞的控制序列包括启动子、多腺 苷酸化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的引导或尾随序列以及将转录的 多核苷酸编码的产物靶向细胞内的胞内隔室或细胞外环境的靶向序列。术语“序列同一性”和“同一性”在本文可交换使用，是指在比较窗口上在核苷 酸_核苷酸的基础上或氨基酸_氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，“序列同一性百分 比”是通过下述步骤计算而得在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定在两个序列中发 生相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pr0、Ser、Thr、Gly、Val、 Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Iys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys 和 Met)的位置的数目而产生 匹配位置的数目，匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)并将该结果 乘以100从而产生序列同一性的百分比。为了本发明的目的，将理解的“序列同一性”意思 是通过DNASIS计算机程序(windows的为2. 5版本；可以从Hitachi Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA获得)并使用软件随附的参考手册中使用的标准缺省值计算的“匹配百分比”。术语“序列相似性，，和“相似性”在本文可交换使用，是指相同的或如以下表 1中定义的组成保守性置换的氨基酸的百分比数目。相似性可以使用序列比较程序如 GAP(Deveraux 等人 1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)确定。以这种方式，与那 些本文引用的序列具有相似的或基本上不同长度的序列可以通过向比对中插入空位而得 以比较，这样的空位可以例如通过GAP使用的比较算法而确定。用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间序列关系的术语包括“参考序列”、“比 较窗口 ”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本上同一”。“参考序列”是长度上为 至少12但经常是15至18，且通常是至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。由于 两个多肽可以每个均包含(1)在两个多肽之间相似的序列(即只有完整多肽序列的一部 分)，和⑵两个多肽之间不同的序列，两个(或更多)多肽之间的序列比较通常通过在“比 较窗口 ”上比较两个多肽的序列而进行，从而鉴定和比较序列相似性的局部区域。“比较窗 口 ”是指至少6个连续位置，通常约50至约100个连续位置，更通常约100至约150个连 续位置的概念片段(segment)，其中两个序列最佳比对后序列与具有相同连续位置数目的 参考序列比较。与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包含添加或删除)相比，比较 窗口可以包含约20%或以下的添加或删除(即空位)。用于比对比较窗口的最佳序列比 对可以通过计算机化的算法实施(Wisconsin Genetics Software Package Release7. 0， Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison，WI，美国的 GAP、BESTFIT、FASTA， 和TFASTA)或通过任意的各种所选方法产生的检查和最佳比对(即在比较窗口引起最高百 分比同源性)进行。还可以参考如例如Altschul等人，1997，Nucl. Acids Res. 25 :3389公 开的程序的BLAST家族。序列分析的详细讨论可以在Ausubel等人“Current Protocols in Molecular Biology”，John ffiley&Sons Inc，1994-1998，第 15 章 19. 3 单元中找到。“基本上纯化的群体”等的意思是在所选类型的抗原呈递细胞的群体中大于细胞 的约80 %，通常大于约90 %，更通常大于约95 %，通常大于约98 %，和更通常大于约99 %。“治疗”的意思是至少改善与困扰宿主的病理状况相关的症状，其中改善以广泛的 意义使用，是指至少减少参数的强度，例如与治疗的病理状况相关的症状，如每单位血中的 病毒颗粒的数目。照这样，治疗还包括病理状况或至少与其相关的症状被完全抑制(例如 防止发生或停止，例如终止)的情况，以至宿主不再患有病理状况或至少没有病理状况的 特征的症状。本文使用的术语“非培养的”是指一群细胞(或单个细胞)，其从动物中移出并在 不引起细胞在体外生长或扩增，或引起细胞的可忽略的生长或扩增(例如与在孵育或处理 的开始的细胞数目相比，细胞数目增加约50%,40%,30%,20%,15%,10%,9%,8%,7%, 6%,5%,4%,3%,2%U%>0. 5%,0. 2%或0. 以下)的条件下孵育或处理。在某些希望 的具体实施发生中，在支持细胞在体外维持的条件下孵育或处理细胞群体(或单个细胞)。“载体”的意思是核酸分子，合适地为源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分 子，其中核酸序列可以被插入或克隆。载体优选含有一个或多个单一限制性位点并且能够 在限定的宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织中自主复制，或可以与限定的宿主 的基因组整合，以便克隆的序列可以复制。因此，载体可以是自主复制的载体，即作为染色 体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如线性的或闭环的质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何保证自我复制的成分。或者，载体可以是 这样的载体当被引入宿主细胞中时，其整合至基因组中并与其整合进入的染色体一起复 制。载体系统可以包含单个载体或质粒、两个或更多载体或质粒，其一起含有待引入宿主细 胞的基因组中的总DNA或转座子。载体的选择通常取决于载体与需要引入载体的宿主细胞 的相容性。载体还可以包括选择性标记，如可以用于选择合适的转化子的抗生素抗性基因。2.缩写贯穿本申请，使用下列的缩写AIDS =获得性免疫缺陷疾病APC =抗原呈递细胞ART =抗逆转录病毒治疗BIV =牛免疫缺陷病毒CAEV =羊关节炎和脑炎病毒cm=厘米CTL =细胞毒T淋巴细胞EIAV =马传染性贫血病毒FIV =猫免疫缺陷病毒g =克G-CSF =粒细胞集落刺激因子GM-CSF =粒细胞巨噬细胞集落刺激因子hr=小时HIV =人免疫缺陷病毒IFN-y = Y 干扰素IFN-a = a 干扰素IL=白介素IV =静脉内mAb =单克隆抗体mL =毫升mg=毫克u g =微克u L =微升um=微米MVV =梅迪/威斯纳病毒nm=纳米NF_KB=核因子 KBOPAL =重叠肽脉冲的自体白细胞(overlapping p印tide—pulsedautologous leukocytes)PMBC =外周血单核细胞pro-GP =祖细胞生成素(progenipoietin)SIV=猿猴免疫缺陷病毒CN TGF^ =转化生长因子βTNF=肿瘤坏死因子VL =病毒装载VLP =病毒样颗粒3.基于慢病毒Gag抗原的免疫调节组合物本发明部分基于以下令人惊讶的发现在只免疫了 SIV Gag的动物与免疫了整个 SIV基因组的动物之间没有病毒结果的差异。另外，出乎意料地发现，抗SIVGag以及其它 SIV抗原的免疫诱导免疫显性的非Gag T细胞反应，其可以限制治疗性或预防性Gag特异性 T细胞反应的发展。基于这些观察，本发明人提出，受试者中的慢病毒治疗或预防不需要针 对最宽的多蛋白慢病毒疫苗，而是基本上通过增加受试者中抗原呈递细胞或抗原呈递细胞 前体(本文还分别称作Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体)可以获 得，所述细胞或细胞前体呈递包含对应于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一个肽。因 此，本发明提供了治疗或预防受试者中慢病毒感染的方法，其中所述方法基本上由增加受 试者中Gag特异性抗原呈递细胞或前体的数目组成。在一些具体实施方式
中，该方法包括向受试者施与增加Gag特异性抗原呈递细胞 或其前体的有效量的免疫刺激剂。例如，免疫刺激剂可以基本上由Gag多肽或包含对应于 Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一个肽(本文还称作Gag肽)组成。或者，免疫刺激剂 可以基本上由包含Gag多肽或至少一个Gag肽的编码序列的核酸构建体(可操作地连接至 调控序列)组成。在其它的说明性例子中，免疫刺激剂基本上由自体或异体Gag特异性抗 原呈递细胞或其前体组成。非限制性的抗原呈递细胞包括树突状细胞、巨噬细胞和朗格汉 斯细胞。因此，在说明性例子中，可以通过下列方法增加Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特 异性抗原呈递细胞前体的数目(1)向受试者施与抗原呈递细胞或前体(例如来自受试者的自体抗原呈递细胞或 前体或来自组织相容的供体的异体抗原呈递细胞或前体)，所述细胞或前体已经在使抗原 呈递细胞或其前体足以呈递Gag多肽或肽，或Gag多肽或肽经处理的形式的条件下与基本 上由Gag多肽或包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的至少一个肽组成的组合物接触(例如 离体的或体内的)一段时间；(2)向受试者施与抗原呈递细胞或前体(例如来自受试者的自体抗原呈递细胞或 前体或来自组织相容的供体的异体抗原呈递细胞或前体)，所述细胞或前体含有包含核苷 酸序列的核酸构建体(本文也称为表达Gag的核酸构建体)，所述核苷酸序列编码Gag多肽 或包含对应于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一个肽，其中核苷酸序列可操作地连接 至在抗原呈递细胞或其前体中可操作的启动子；(3)向受试者施与基本上由至少一个Gag分子组成的组合物，所述Gag分子选自 Gag多肽、包含对应于Gag多肽一部分的序列的肽或表达Gag的核酸构建体。Gag分子是可 溶的或颗粒的形式。3. IGaR多肽和肽本发明考虑到全长Gag多肽以及肽(本文也称作Gag肽)的用途，所述肽包含对 应于全长Gag多肽的部分的氨基酸序列，用于产生Gag特异性抗原呈递细胞或前体。说明
16性的肽包含存在于全长Gag多肽中的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400 或 500 个连续的氨
基酸残基，或几乎达氨基酸的总数。通常，Gag肽是可以被抗原呈递细胞或其前体处理和/ 或呈递的合适的大小。一些因素可以影响肽大小的选择。例如可以选择肽的大小以至其包 括或对应于CD4+T细胞抗原决定部位、CD8+T细胞抗原决定部位和/或B细胞抗原决定部位 和其处理需要的大小。本领域技术人员将认识到I类限制的CD8+T细胞抗原决定部位的长 度通常在8至10个氨基酸残基之间，并且如果被置于非天然侧翼残基旁边，这样的抗原决 定部位通常需要2至3个天然的侧翼氨基酸残基以保证它们可以有效的被处理和呈递。II 类限制的CD4+T细胞抗原决定部位的长度通常在12至25个氨基酸残基之间的范围，并且 有效的蛋白水解处理可以不需要天然侧翼残基，虽然据信天然侧翼残基可以起作用。II类 限制的抗原决定部位的另一个重要特征是其在中间通常含有9-10个氨基酸残基的核心， 所述核心特异性结合至II类MHC分子，在该核心的两侧具有侧翼序列，以不依赖序列的方 式通过与II类MHC抗原两侧上的保守结构结合而稳定结合。因此，II类限制的抗原决定 部位的功能区的长度通常在15个氨基酸残基以下。线性B细胞抗原决定部位的大小和影 响其处理的因素如II类限制的抗原决定部位是非常可变的，虽然这样的抗原决定部位的 大小经常小于15个氨基酸残基。从上述内容可见，肽的大小为至少6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、20、25、30个氨基酸残基是有利的但不是必须的。合适地，肽的大小不在约500、200、 100、80、60、50、40个氨基酸残基以上。在一些具体实施方式
中，肽的大小大得足以最小化T 细胞和/或B细胞抗原决定部位的损失。在其它的具体实施方式
中，肽的大小足以使抗原 呈递细胞呈递肽中含有的T细胞和/或B细胞抗原决定部位。在这类说明性例子中，肽的 大小为约15个氨基酸残基。本领域中已知许多Gap多肽序列和其对应的编码序列，其可以用于制备纯化的、 合成的或重组的Gag多肽和肽或其编码序列。说明性的Gag多肽序列可以从任何公开可 获得的数据库，包括GenBank, EMBL和SffISSPROT中获得。例如，代表性的HIV-IGag多 肽序列可以从GenBank的下列登录号下获得AAB04036、AAB03744、AAB59875、AAA44853、 AAB04036、AAB50258、AAA44987 和 AAB59747。非限制性的 HI V_2Gag 多肽序列可以从 GenBank 的下列登录号下获得AAB00736、AAA76840、AAA43932、AAB00745、AAB00763、AABO1351 和AAA43941。另外，说明性的SIV Gag多肽序列可以从GenBank的下列登录号下获得 AAA91905、AAA91913、AAA47588、AAA91922、AAA74706、AAA47632、AAB59905、AAA91930 和 AAB59769。代表性的FIV Gag多肽序列可以从GenBank的下列登录号下获得AAB59936、 AAA43075和AAB09309。非限制性的BIV Gag多肽序列的例子可以从GenBank的下列登录 号下获得AAA91270。说明性的ElAVGag多肽序列可以从GenBank的下列登录号下获得 AAB59861和AAA43003。非限制性的威斯纳Gag多肽序列可以从GenBank的下列登录号下 获得AAA17520、AAA48353、AAA48358、AAA17523 和 AAA17528。代表性的 CAEVGag 多肽序列 可以从GenBank的下列登录号下获得AAA91825。说明性的绵羊慢病毒Gag多肽序列可以 从GenBank的下列登录号下获得AAA66811和AAA46779。但应该理解的是，本发明不限于 任何特定的Gag氨基酸或核酸序列并且广泛延伸至任何天然或重组的Gag多肽或其编码序 列。在特别的具体实施方式
中，多个肽用于产生Gag特异性抗原呈递细胞或其前体，其中各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，显示与多个肽的至少 一个其他肽的部分序列同一性或相似性。部分序列同一性或相似性通常包含在各个肽的一 端或两端。在一个具体实施方式
中，在各个肽的一端或两端有至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、20、25、30、40、50个连续的氨基酸残基，其序列与至少一个其它肽中包含的氨基 酸序列相同或相似。在可选的具体实施方式
中，在各个肽的一端或两端有500、100、50、40、 30个以下的连续氨基酸残基，其序列与至少一个其它肽中包含的氨基酸序列相同或相似。 这样的‘序列重叠’有利于防止或减少Gag多肽内包含的任何潜在抗原决定部位的损失。在 本文公开的特别的例子中，序列重叠为11个氨基酸残基。在某些具体实施方式
中，各个肽的大小为约14或15个氨基酸残基，并且在各个肽 的一端或两端重叠的序列为约11个氨基酸残基。但是应该理解的是，本发明考虑到其它合 适的肽大小和序列重叠大小，其可以容易地被本领域技术人员确定。通常，当肽具有部分序列相似性时，其序列通常有一个或多个保守的和/或非保 守的氨基酸置换的差异。示例性的保守的置换在表1中列出。保守的或非保守的置换可以 对应于Gag内的多态性。在这一点上，熟知的是多态性的Gag多肽通过不同的病毒株或分 化枝(clade)表达。因此，在Gag中有多态性区域的地方，通常需要使用额外几套覆盖多态 性位点上的氨基酸残基变异的肽。有利地但不用必须使用Gag多肽的全序列以产生多个重叠的肽。通常使用对应 于 Gag 多肽的序列的至少 330、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42. 43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99%以产生重叠的肽。但是，应该理解的是，用于产生重叠肽的来自Gag多肽的序列信 息越多，重叠肽作为免疫原的远亲繁殖群体的覆盖度越大。合适地，无来自Gag多肽的序列 信息被排除在外(例如由于明显缺少免疫的抗原决定部位，因为更稀少的或亚显性的抗原 决定部位会不可避免的丢失)。如果需要，Gag多肽内的高可变序列可以从一套重叠肽的构 建中被排除，或可以构建或施与另外几套覆盖多态性区域的肽。肽序列可以包括不源自Gag 多肽的额外序列。这些额外的序列可以具有各种功能，包括增加可溶性、稳定性或免疫原性 或有利于纯化。通常，这样的额外序列包含在各自肽的一端或两端上。可以基于任何合适的Gag氨基酸序列设计重叠肽，其说明性例子在上面以及在表 4和5中列出。用于调节针对猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和/或嵌合体SIV-HIV-I (SHIV)的 免疫反应的代表性重叠肽(已知两者是人类中致病性HIV-I病毒的合适模型)，可以基于一 个或多个下表2和3中列出的Gag多肽序列。可以通过本领域技术人员已知的任何合适的过程制备Gag多肽和肽。例如， 可以使用溶液合成或固相合成方便的合成Gag肽，如例如Atherton和Sh印hard(1989、 Solid Phase Peptide Synthesis :A Practical Approach. IRL Press, Oxford)中的第 9章和Roberge等人(1995，Science 269:202)中描述的。合成可以使用例如t_叔丁氧 羰基(t-Boc)或 9-芴甲氧羰基(Fmoc)化学(见 Coligan 等人 Current Protocols in ProteinScience, John Wiley&Sons， Inc.1995—1997 第 9. 1 章；Stewart 禾口 Young，1984， SolidPhase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chemical Co. , Rockford, 111 ；禾口上面 的Atherton和Sh印hard)。在特别的具体实施方式
中，各个肽以高浓度(Img肽/10-30 μ LDMS0)溶解于DMSO(例如100%纯的DMS0)以便当大量集中的肽被脉冲至细胞时不含有过 量的DMS0。在某些有利的具体实施方式
中，可溶形式的一套或多套肽为了方便地向受试者 给药被置于单个容器中(例如再输注即时可用的输血导管或瓶)并且这样的容器也被本发 明考虑到了。或者，可以通过包括下列步骤的过程制备Gag多肽或肽(a)制备包含编码Gag多 肽或肽的核苷酸序列的核酸构建体，其中核苷酸序列被可操作地连接至调控序列；(b)将 核酸构建体引入至合适的宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达核苷酸序列；和(d)分离Gag 多肽或肽。核酸构建体通常是表达载体的形式。例如，表达载体可以是自我复制的染色体 外载体，如质粒，或整合进入宿主基因组的载体。通常，调控序列包括但不限于启动子序列、 引导或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或 激活子序列。本发明考虑到本领域已知的组成性或诱导性启动子。启动子可以是天然存在 的启动子或组合了一个以上启动子元件的混合启动子。调控序列通常适合于用于表达的宿 主细胞。许多类的用于各种宿主细胞的合适的表达载体和合适的调控多核苷酸在本领域是 已知的。在某些具体实施方式
中，表达载体含有可选择的标记基因以允许选择转化的宿主 细胞。选择基因在本领域是熟知的并将随着使用的宿主细胞改变。在其它的具体实施方式
中，表达载体还包括编码融合伴侣(partner)的核酸序列以便Gag多肽或肽作为融合多肽 与融合伴侣一起表达。融合伴侣的主要优点是其帮助融合多肽的鉴定和/或纯化。举例性 的融合伴侣包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麦芽糖结合蛋白 (MBP)和六组氨酸(HIS6),其特别有用于通过亲和色谱分离融合多肽。为了通过亲和色谱 纯化融合蛋白的目的，用于亲和色谱的相关基质分别为谷胱甘肽、直链淀粉和镍或钴共轭 连接的树脂。许多这样的基质可以以试剂盒的形式获得，如与(His6)融合伴侣一起使用的 QIAexpress 系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。在优选的具体实施方式
中，重组多 核苷酸在商业载体PFLAG 中表达。有利地，融合伴侣还具有蛋白酶切割位点如Factori^ 凝血酶和内蛋白(inteins，蛋白内含子)的切割位点，其允许相关蛋白酶部分消化本发明 的融合多肽从而释放重组Gag多肽或源自其的肽。然后被释放的Gag多肽或肽可以通过随 后的色谱分离从融合伴侣中分离出来。根据本发明的融合伴侣的范围还包括“抗原决定部 位标签”，其通常是短的肽序列，其特异性抗体是可以获得的。抗原决定部位标签(其特异性 单克隆抗体是容易获得的)的熟知例子包括c-Myc、流行性感冒病毒、血细胞凝集素和FLAG 标签。可以通过使用任何合适的技术，包括转染和转化，实现将核酸构建体引入宿主细 胞的步骤，所述技术的选择取决于应用的宿主细胞。这样的方法对本领域技术人员是熟知 的。可以通过培养用合成构建体转化的宿主细胞产生本发明的肽。适用于蛋白质表达的条 件随选择的表达载体和宿主细胞而变化。这可以容易地被本领域的技术人员通过常规实验 而确定。用于表达的合适的宿主细胞可以是原核的或真核的。用于表达根据本发明的多肽 的一个优选的宿主细胞是细菌。使用的细菌可以是大肠杆菌(Escherichia coli)。或者， 宿主细胞可以是昆虫细胞，例如可以与杆状病毒表达系统一起使用的SF9细胞。Gag多肽或肽的氨基酸可以是非天然存在的或天然存在的。肽合成过程中非天 然的氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟 基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、t- 丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基
19甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2_噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-同分异构体。本发明考虑到的 非天然氨基酸的名单显示于表6中。本发明还考虑到使用一般的分子生物学技术修饰Gag多肽和肽以便改变其对蛋 白降解的抗性或优化溶解性质或使其更适于作为免疫原性试剂。3. 2用于基因治疗的表汰Gag的核酸构津体在特别的具体实施方式
中，将可操作地连接至调控元件的包含Gag编码序列的核 酸构建体用于经由基因治疗制备Gag特异性抗原呈递细胞。基因治疗是指通过向受试者施 与表达的或可表达的核酸进行的治疗。在本发明的这些具体实施方式
中，核酸构建体在抗 原呈递细胞中产生其编码的Gag多肽或肽，从而介导所需的治疗或预防效果。可以根据本发明使用任何本领域中可获得的用于基因治疗的方法。下面描述了示 例的方法。基因治疗方法的一般性综述参见Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12: 488505(1993) ； ；Wu 禾口 Wu，Biotherapy 3:8795(1991) ；Tolstoshev, Ann.Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 573596(1993) ；Mulligan, Science 260 =926932 (1993)；和 Morgan 和 Anderson, Ann. Rev.Biochem. 62 191217 (1993) ；TIBTECH11(5) 155215(1993 年 5 月))。 可以使用的本领域中公知的重组DNA技术的方法在Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY(1993)；禾口 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY(1990)中有描述。可以通过将患者直接暴露于核酸构建体或通过首先用核酸构建体在体外转化抗 原呈递细胞或其前体，然后将经转化的抗原呈递细胞或前体移植进入患者而实现向抗原呈 递细胞或前体递送核酸构建体。这两个方法分别作为体内或离体基因治疗是已知的。如所述的，例如在美国专利号5，976，567 (Inex)中，天然的或合成的核酸的表达 通常通过将目的核酸可操作地连接至启动子(其可以是组成性的或诱导性的)而实现， 通常将构建体整合进入表达载体，并将载体引入合适的宿主细胞。典型的载体含有转录和 反应终止子、转录和反应起始序列和用于调控特定核酸表达的启动子。载体可选地包含 遗传表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许在真核生物或原核生物或两者(例 如穿梭载体)中复制该盒的序列和用于原核和真核系统二者的选择标记。载体可以在原 核生物、真核生物或优选两者中适于复制和整合，参见Giliman和Smith(1979)，Gene,8 81-97 ；Roberts等人(1987) ,Nature, 328 :731_734 ；Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods inEnzymology, volume 152, Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger) ；Sambrook ^A (1989), Molecular Cloning-Α Laboratory Manual(2nd ed. )Vol. 1-3, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N. Y. , (Sambrook)；禾口 F. M. Ausubel 等人·，Current Protocols in Molecular Biology, eds. , Current Protocols, a joint venturebetween Greene Publishing Associates, Inc.和 John ffiley&Sons, Inc.，(1994 增刊)(Ausubel)。含有来自真核病毒如逆转录病毒的调控元件的表达载体通常用于表达真核细胞 中的核酸序列。SV40载体包括pSVT7和pMT2。源自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV_lMTHA， 源自EB病毒的载体包括pHEBO和p205。其它示例的载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTOlO/ A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和任何其它在SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它 对真核细胞中表达显示有效的启动子的指导下允许表达蛋白的载体。虽然可以使用各种载体，应该注意的是，病毒表达载体可以用于修饰真核细胞，因 为病毒载体转染靶细胞和整合进入靶细胞基因组具有高效率。说明性的这类表达载体可以 源自病毒DNA序列，包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯性疱疹病毒和逆转录病毒如B、 C和D逆转录病毒以及泡沫病毒和修饰的慢病毒。用于转染动物细胞的合适的表达载体例 如被 Wu 和 Ataai (2000, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2), 205-208) ,Vigna 和 Naldini (2000， J. Gene Med. 2 (5)，308-316) ,Kay 等人(2001，Nat. Med. 7 (1)，33-40) ,Athanasopoulos 等人 (2000，Int.J. Mol. Med. 6(4)，363-375)和 Walther 和 Stein(2000，Drugs 60(2)，249-271) 所描述。表达载体的编码Gag的部分可以包含天然存在的序列或其变体，其已经使用重组 技术被工程化。在变体的一个例子中，编码抗原的多核苷酸的密码子组成被修饰以允许使 用国际出版物WO 99/02694和WO 00/42215中详细列出的方法增强抗原在靶细胞或所选组 织中的表达。简而言之，这些方法基于这样的观察不同密码子的翻译效率在不同的细胞或 组织之间变化并且这些差异可以与基因的密码子组成一起被应用以便调控蛋白在特定细 胞或组织类型中的表达。因此，为了构建密码子优化的多核苷酸，至少一个现有的亲代多核 苷酸密码子用相对于其所替换的现有密码子在靶细胞或组织中具有更高翻译效率的同义 密码子替换。虽然希望用具有更高翻译效率的同义密码子替换所有现有的亲代核酸分子的 密码子，但这不是必须的，因为甚至用部分替换就可实现表达增加。合适地，替换步骤影响 5%、10%、15%、20%、25%、30%，更优选地35%、40%、50%、60%、70%或更多的现有亲代 多核苷酸的密码子。表达载体与其引入的抗原呈递细胞或前体相容以便编码抗原的多核苷酸在所述 细胞或前体中是可表达的。可以使用任何合适的方法将表达载体引入抗原呈递细胞或 前体，这将取决于表达载体的特定选择和使用的抗原呈递细胞。这样的引入方法对本领 域技术人员是熟知的。例如，可以利用接触(例如在病毒载体的情况下)、电穿孔、转化、 转导、共轭连接或三亲交配、转染、用阴离子脂质进行的感染膜融合、用包被DNA的微粒 (microprojectile)的高速轰击、用磷酸钙-DNA沉淀进行的孵育、直接显微注射入单个 细胞等影响引入。其它的方法也是可获得的并且对于本领域技术人员是已知的。或者， 利用阴离子脂质的方法，例如脂质体，引入载体。这样的脂质体是商业上可获得的(例如 Lipofectin<D、Lipofectamine 等，由 Life Technologies^Gibco BRL、Gaithersburg，Md.提 供)。在其它的具体实施方式
中，通过将核酸构建体与进行受体介导的内吞作用的 配体一起施与将其引入抗原呈递细胞或其前体(参见例如Wu和Wu，J. Biol. Chem. 262 44294432(1987))(其可以用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。还是在其它的具 体实施方式中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包含可产生融合(fusogenic)的 病毒肽以便破坏内含体，以允许核酸构建体避免溶酶体降解。仍是在其他的具体实施方 式中，可以通过靶向特异性受体在体内靶向核酸构建体以使细胞特异性摄取和表达(参 见例如1992年4月16日的PCT公布WO 92/06180 (Wu等人)；1992年12月23日的WO 92/22635 (Wilson 等人)；1992 年 11 月 26 日的 W092/20316 (Findeis 等人)；1993 年 7 月22 日的 W0093/14188 (Clarke 等人)；禾口 1993 年 10 月 14 日的 WO 93/20221 (Young))。或 者，可以通过同源重组将核酸引入细胞内并整合进入宿主细胞DNA，以进行表达(Koller和 Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 89328935 (1989) ；Zijlstra 等人，Nature 342 435438(1989))。另一个基因治疗的方法包括将核酸构建体转移至组织培养中的细胞，其通常包括 将选择标记转移至细胞。然后将细胞置于选择之下以便分离那些已经摄取并表达所述经转 移的基因的细胞。然后，将这些细胞递送入患者。在这一具体实施方式
中，在体内施与所得 重组细胞前，将核酸构建体引入抗原呈递细胞或前体。可以通过本领域中的任何已知方法 进行这样的引入，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体 载体进行的感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微孔介导的基因转移、原生质体融合 等。用于将外源基因引入细胞的许多技术在本领域是已知的(参见例如Loeffler和Behr， Meth. Enzymol. 217 599618 (1993) ；Cohen 等人，Meth. Enzymol. 217 618644 (1993) ；Cline, Pharmac. Ther. 29 :6992 (1985))，并且可以根据本发明使用，只要受体细胞必需的发育和生 理功能不被破坏。该技术应该提供核酸向细胞的稳定转移，以便核酸可以被细胞表达和优 选地被其细胞后代遗传和表达。可以通过各种本领域中已知的方法将所得的重组细胞递送 至患者。重组抗原呈递细胞通常通过静脉内施与。3. 3颗粒
具体实施例方式在一些具体实施方式
中，如3. 1部分中广泛描述的Gag多肽或肽或如3. 2部分中 广泛描述的表达Gag的核酸构建体(在本文也称作“免疫刺激剂”或“Gag免疫刺激剂”)以 颗粒的形式提供(在本文也称作“Gag颗粒”)。这些具体实施方式
对于向抗原呈递细胞或 其前体在离体的或在体内递送免疫刺激剂是特别有利的，因为颗粒优选地被这样的细胞摄 取(例如通过内吞作用或吞噬作用)。各种颗粒可以用于本发明，包括但不限于脂质体、微 粒、脂质颗粒、陶瓷/无机颗粒和聚合物颗粒，并且通常选自纳米颗粒或微粒。适当地调整 颗粒的大小以用于抗原呈递细胞或其前体的吞噬作用或内吞作用。抗原呈递细胞包括专能和兼性类型的抗原呈递细胞。专能抗原呈递细胞包括但不 限于巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、骨髓系细胞包括单核细胞-粒细胞-DC前体、边缘区 枯否细胞(marginal zone Kupffer cells)、小胶质细胞、T细胞、朗格汉斯细胞和树突状细 胞包括指突状树突状细胞和滤泡树突状细胞。兼性抗原呈递细胞的例子包括但不限于激活 的T细胞、星形胶质细胞、滤泡细胞、内皮细胞和成纤维细胞。在一些具体实施方式
中，抗原 呈递细胞选自单核细胞、巨噬细胞、B-淋巴细胞、骨髓系细胞、树突状细胞或朗格汉斯细胞。 在特别的具体实施方式
中，抗原呈递细胞表达CDllc并且包括树突状细胞。在说明性的例 子中，颗粒具有约100 μ m以下的尺寸，更适合地在等于约500nm或以下的范围内，虽然颗粒 可大至约10 μ m和小至几个nm。脂质体基本上由在水核周围形成外壳的磷脂双层组成。优 点包括“模拟”细胞的外膜层的外层的亲油性及相对容易被各种细胞摄取。聚合物载体通 常由生物相容的聚合物形成的微/纳米球和微/纳米胶囊组成，其是生物可降解的(例如 聚乳酸)或不能生物降解的(例如乙烯醋酸乙烯酯)。聚合物装置的一些优点是容易制造 和高承载能力、直径大小的范围为从纳米至微米以及受控制的释放和降解特征。在一些具体实施方式
中，颗粒在其表面上包含抗原结合分子，其与在抗原呈递细 胞上(例如树突状细胞)(相对于在非抗原呈递细胞上)有更高水平的表达的标记有免疫相互作用。这类的说明性的标记包括MGL、DCL-I、DEC-205、巨噬细胞甘露糖R、DC-SIGN 或其它DC或骨髓特异性的(凝集素)受体，如例如Hawiger等人(2001，J Exp Med 194， 769)，Kato 等人 2003，J Biol Chem 278，34035)，Benito 等人(2004，J Am Chem Soc 126， 10355) ,Schjetne 等人 2002，Int Immunol 14，1423)和 van Vliet 等人 2006，Nat Immunol Sep 24 ；[电子版在印刷版之前])(van Vliet 等人 Immunobiology 2006，211 :577_585)所 公开的。可以从免疫刺激剂和表面活性剂、赋形剂或聚合物材料的组合制备颗粒。在一些具体实施方式
中，颗粒是生物可降解的和生物相容的，可选地能够以受控制的速率生物降 解以用于递送治疗或诊断试剂。颗粒可以由各种材料制成。无机的和有机的材料都可以使 用。可以使用聚合物的和非聚合物的材料，如脂肪酸。其它合适的材料包括但不限于明胶、 聚乙二醇、海藻糖、葡聚糖和壳聚糖。基于因素如颗粒材料，可以设计和制备具有从几秒至 几个月范围的降解和释放时间的颗粒。3. 3.1聚合物颗粒聚合物颗粒可以从任何生物相容的和所需的生物可降解聚合物、共聚物或混合物 中形成。可以专门制作聚合物以优化颗粒的不同特征，包括i)待递送的免疫刺激剂和聚 合物之间的相互作用，以提供免疫刺激剂的稳定性和递送时活性的保留；ii)聚合物降解 的速率，从而影响试剂释放速率的特征；iii)通过化学修饰的表面特征和定向能力；和iv) 颗粒的多孔性。可以使用表面侵蚀的聚合物如聚酐来形成颗粒。例如，可以使用聚酐如聚[(P-羧 基苯氧基)-己烷酐](PCPH)。生物可降解的聚酐在美国专利号4，857，311中有描述。在其它的具体实施方式
中，可以使用大块侵蚀聚合物，如那些基于聚酯的聚合物， 包括聚(羟基酸)或聚(酯)。例如，可以使用聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或其共聚物 来形成颗粒。聚酯还可以具有带电荷的或官能化基团，如氨基酸。在说明性的例子中，具 有受控制的释放性质的颗粒可以由聚(D，L-乳酸)和/或聚(D，L-乳酸乙醇酸共聚物) (“PLGA”)形成，其加入了表面活性剂如DPPC。其它聚合物包括聚氰基丙烯酸烷基酯(polyfelkylcyanoacrylates))、聚酰胺、聚 碳酸酯、聚烯烃(polyalkylenes)如聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚对苯 二甲酸乙酯(poly (ethylene ter印hthalate))、聚乙烯化合物如聚乙烯醇、聚乙烯醚和聚 乙烯酯、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物、纤维素和其它多糖和肽或蛋白，或其共聚物或混合 物。可以选择或修饰聚合物而在体内具有合适的稳定性和降解速率以用于不同的受控制的 药物递送应用。在一些具体实施方式
中，颗粒从功能化的聚酯移植共聚物形成，如Hrkach等 人(1995, Macromolecules, 28 4736-4739 ；禾口“Poly(L—Lactic acid-co—amino acid) GraftCopolymers :A Class of Functional Biodegradable Biomaterials，，in Hydrogels andBiodegradable Polymers for BioappIications, ACS Symposium Series No. 627, RaphaelM. Ottenbrite ^A Eds.，American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996.)中描述的。生物可降解的聚合物之外的材料可以用于形成颗粒。合适的材料包括各种不能生 物降解的聚合物和各种赋形剂。颗粒还可以从免疫刺激剂和表面活性剂单独形成。
聚合物颗粒可以使用单和双乳化溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂提取、溶剂蒸发、相分 离、简单和复杂凝聚法、界面聚合作用和其它本领域普通技术人员熟知的方法制备。颗粒可 以使用本领域已知的制作微球或微胶囊的方法制备，只要优化条件以形成具有所需直径的 颗粒。用于制作递送封装试剂的微球而开发的方法在文献中有描述，例如在Doubrow， Μ. , Ed. , "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy,，，CRC Press, Boca Raton, 1992 中描述的。方法还在 Mathiowitz 禾口 Langer (1987，J. ControlledRelease 5,13-22) ；Mathiowitz 等人(I987，Reactive Polymers 6,275-283)；和 Mathiowitz 等 人(1988，J. Appl. Polymer Sci. 35，755-774)以及美国专利号 5，213，812、美国专利号 5，417，986、美国专利号5，360，610和美国专利号5，384，133中有描述。方法的选择取决 于聚合物的选择、大小、外部形态和所需的结晶度，例如Mathiowitz等人(1990，Scanning Microscopy 4 329-340 ； ； 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45，125-134)；和Benita等人(1984， J. Pharm. Sci. 73，1721-1724)所述的。在例如Mathiowitz 等人(1990)，Benita ；和授予 Jaffe 的美国专利号 4，272，398 中所述的溶剂蒸发中，聚合物溶解于挥发性有机溶剂，如二氯甲烷。可以使用几个不同的聚 合物浓度，例如在0. 05至2. Og/mL之间。将可溶形式或作为细颗粒分散的免疫刺激剂加入 聚合物溶液，将混合物悬浮于含有表面活性试剂如聚(乙烯醇)的水相中。水相可以是例 如蒸馏水中浓度为的聚(乙烯醇)w/v。将所得乳剂搅拌直到大多数有机溶剂蒸发，剩 下固体的微球，其可以用水洗涤并在冷冻干燥器中干燥过夜。可以通过这一方法获得具有 不同大小(在1至1000 μ m之间)和形态的微球。最初设计溶剂的去除以用于较不稳定的聚合物，如聚酐。在这一方法中，将试剂分 散或溶解于在挥发性有机溶剂如二氯甲烷中的所选聚合物的溶液中。然后将混合物悬浮于 油中，如硅油，通过搅拌而形成乳剂。在24小时内，溶剂扩散进入油相，乳剂小滴变硬进入 固体聚合物微球。不同于例如Mathiowitz等人(1987，Reactive Polymers,6 275)中描 述的热熔微胶囊化方法，这一方法可以用于从具有高熔点和宽分子量范围的聚合物制作微 球。用这一过程可以获得具有例如在1至300 μ m之间直径的微球。对于一些聚合物系统，使用单或双乳剂技术制备的聚合物颗粒的大小根据小滴的 大小而变化。如果在油包水乳剂中的小滴大小不适于形成具有所需大小范围的颗粒，可以 制备更小的小滴，例如通过乳剂的超声处理或勻浆，或通过加入表面活性剂。如果通过任何上述方法制备的颗粒的大小范围在所需范围以外，可以使用例如筛 子改变颗粒的大小，并根据密度使用本领域技术人员已知的技术进一步分离。可以通过喷雾干燥制备聚合物颗粒。喷雾干燥的方法如由Sutton和Johnson申 请的PCT WO 96/09814所公开的，其公开了水溶性材料的光滑球形微粒(至少90%的颗粒 具有1-10 μ m的平均大小)的制备。3. 3. 2陶瓷颗粒陶瓷颗粒也用于递送本发明的免疫刺激剂。这些颗粒通常使用与熟知 的溶胶_凝胶过程相似的过程制备，并且通常需要简单的和室温的条件，如例 如 Brinker 等人("Sol-Gel Science :The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing ； ”AcademicPress :San Diego,1990, p-60)禾口 Avnir 等 人(1994，Chem.
24Mater. 6,1605)中描述的。可以以所需大小、形状和多孔性制备陶瓷颗粒，并且非常稳定。 这些颗粒还有效地保护掺杂的分子(多肽、药物等)免受极端PH和温度诱发的变性(Jain 等人1998，J. Am. Chem. Soc. 120，11092-11095)。另外，其表面可以容易地用不同的基团功能 化(Lal 等人 2000，Chem. Mater. 12,2632-2639 ；Badley 等人 1990，Langmuir, 6, 792-801), 因此可以将其连接至各种单克隆抗体或其它配体上以便将它们在体内靶向所需的位点。已经描述了用于在体内递送含有活性试剂的有效负荷(payloads)的各种陶瓷颗 粒。例如英国专利1590574公开了将生物活性成分加入溶胶-凝胶基质中。国际公布WO 97/45367公开了通过溶胶-凝胶过程制备的可控制的可溶的二氧化硅干凝胶，其中通过浸 渍入预烧结的颗粒(1至500μπι)或圆盘加入生物活性试剂。国际公布WO 0050349公开了 通过溶胶_凝胶过程制备的可控制地生物可降解的二氧化硅纤维，其中在纤维合成过程中 加入生物活性试剂。美国专利申请公布20040180096描述了其中加入生物活性物质的陶瓷 纳米颗粒。通过染料的胶束组合物形成制备陶瓷纳米颗粒。将陶瓷材料加入胶束组合物，并 通过碱水解沉淀陶瓷纳米颗粒。美国专利申请公布20050123611公开了受控制释放的包含 在整个颗粒中本质上均质分散的活性材料的陶瓷颗粒。通过将表面活性剂与无极性溶剂混 合制备这些颗粒以制备反胶束溶液；(b)将凝胶前体、催化剂、凝结剂和可溶的活性材料溶 解于极性溶剂中以制备前体溶液；(c)将反胶束溶液与前体溶液结合以提供乳剂和(d)凝 结乳剂中的前体。美国专利申请公布20060210634公开了通过蒸发将生物活性物质吸附至 包含金属氧化物(例如氧化钛、氧化错、氧化钪、氧化铈和氧化钇)的陶瓷颗粒上。Kortesuo 等人(2000，Int J Pharm. May 10 ；200 (2) =223-229)公开了一种喷雾干燥方法，用于产生 受控制递送药物如枸橼酸托瑞米芬和右旋美托咪啶HCl的具有窄颗粒大小范围的球形硅 胶颗粒。Wang 等人(2006，Int J Pharm. 308(1-2) 160-167)描述了通过多孔 CaCO3 微粒 的吸附和通过聚合电解质多层膜的封装的组合，以用于递送生物活性物质。3. 3. 3 脂质体可以通过Kim等人(1983，Biochim.Biophys. Acta 728,339-348) ；Liu等人(1992， Biochim. Biophys. Acta 1104,95-101) ；Lee φ 人(1992, Biochim. Biophys. Acta.1103, 185-197)，Brey 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20020041861)，Hass 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20050232984) ,Kisak 等人(U. S. Pat. Appl. Pub. 20050260260)和 Smyth-TempIeton 等 人(美国专利申请公布20060204566)报道的那些标准方法制备脂质体。另外，可以参考 Copeland等人(2005，Immunol. Cell Biol. 83 95-105)综述的用于递送抗原的基于脂质 的颗粒组成和 Bramwell 等人(2005，Crit Rev TherDrug Carrier Syst. 22(2) :151_214 ； 2006，J Pharm Pharmacol. 58 (6) :717_728)综述的用于疫苗的颗粒递送系统，包括制备负 载蛋白的脂质体的方法。使用各种不同脂质成分的许多脂质体组成已经用于各种体外细 胞培养和动物实验中。已经鉴定了确定脂质体性质的参数并且在文献中有报道，例如Lee 等人(1"2，Biochim. Biophys. Acta. 1103,185-197) ；Liu 等人(1"2，Biochim. Biophys. Acta, 1104,95-101)；和 Wang 等人(1989，Biochem. 28，9508-951)。简而言之，将溶解于有机溶剂中的选择的脂质(和任何有机可溶的生物活性剂) 混合并在真空下干燥在玻璃管底。通过轻柔旋转并使用含有任何水溶性的待封装的生物活 性剂的缓冲水溶液将脂质膜再水化。然后，可以通过挤压进一步处理水化的脂质小囊泡，进 行一系列冻融循环或脱水，然后再水化从而促进生物活性剂的封装。然后，可以通过离心洗涤脂质体或加载至大小排阻的柱上以从脂质体组成中去除未包入的生物活性剂，并储存在 40C ο 在 Thierry 等人(1992，Nuc. Acids Res. 20 5691-5698)中更详细地描述了用于脂质 体制备的基本方法。运送免疫刺激剂的有效负荷的颗粒可以使用Pautot等人(2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100 (19) 10718-21)中描述的过程制备。通过使用Pautot等人的技术，抗 生物素蛋白链菌素包被的脂质(DPPC、DSPC和相似的脂质)可以用于制备脂质体。Needham 等人(2001，Advanced Drug Delivery Reviews, 53 (3) :285_305)描述的药物封装技术可以 用于向这些小囊泡中加载一个或多种活性试剂。可以通过将各种脂质混合物的氯仿溶液暴露至高真空并随后用pH4的缓冲液水 化所得的脂质膜(DSPC/CH0L)，在冷冻和融化过程后将它们从聚碳酸酯膜挤出制备脂质体。 可以使用添加了 DSPC或胆固醇的DPPC增加封装的效率或增加稳定性等。通过加入碱化试 剂调整膜泡外介质的pH至7. 5而产生跨膜pH梯度。随后，可以通过在升高的温度下以小 等份将免疫刺激剂的溶液加入膜泡溶液中封装Gag免疫刺激剂，从而允许积累脂质体内的 免疫刺激剂。其它适于递送本发明的免疫刺激剂的基于脂质的颗粒如泡囊在Copeland等人 (2005, Immunol. Cell Biol. 83 :95_105)中有描述。3. 3. 4 弹道颗粒(Ballistic particles)本发明的免疫刺激剂可以连接至(例如通过包被或共轭连接)适用于无针的或 “弹道”(生物导弹)递送的颗粒或与之结合。用于弹道递送的说明性颗粒在例如国际公布 WO 02/101412 ；WO 02/100380 ；WO 02/43774 ；WO 02/19989 ；W001/93829；WO 01/83528 ；WO 00/63385 ；WO 00/26385 ；WO 00/19982 ；WO 99/01168 ；WO 98/10750 和 WO 97/48485 中有描 述。但应理解的是，这样的颗粒不限于与弹道递送设备一起使用，还可以通过将颗粒递送至 免疫细胞的任何可选择的技术(例如注射或纤维针递送)施与。使用本领域已知的各种技术可以包被免疫刺激剂或将其化学偶联至载体颗粒上 (例如核心载体)。载体颗粒选自具有通常用于细胞内递送的颗粒大小范围的适当密度的 材料。当然，最佳载体颗粒的大小将取决于靶细胞的直径。说明性的颗粒具有的大小为从 约0. 01至约250 μ m,从约10至约150 μ m,和从约20至约60 μ m ；颗粒的密度为从约0. 1至 约25g/cm3，堆积密度为约0. 5至或约3. Og/cm3或更大。这类非限制性颗粒包括金属颗粒如 钨、金、钼和铱载体颗粒。直径为0. 5至2. 0 μ m的平均大小的钨颗粒容易获得。还可以使用 金颗粒或微晶体金颗粒(例如金粉A1570，可以从Engelhard Corp.，East Newark,N. J.获 得)。金颗粒提供均勻的大小(从Alpha Chemicals可以获得，颗粒大小为1-3 μ m，或可以 从Degussa, SouthPlainfield, N. J.获得，颗粒大小范围包括0. 95 μ m)和低毒性。微晶体 金提供不同的颗粒大小分布，通常在0. 1-5μπι的范围。微晶体金的不规则表面面积提供与 本发明的活性试剂的高效包被。用于吸附、偶联或连接生物活性分子(例如亲水性分子如蛋白和核酸)至颗粒如 金或钨颗粒的许多方法是已知的并已经被描述。在说明性例子中，这样的方法将预定量的 金或钨与生物活性分子、CaCl2和亚精胺组合。在其它的例子中，乙醇用于将生物活性分子 沉淀在金或钨颗粒上(参见例如Jumar等人，2004，Phys Med. Biol. 49 =3603-3612)。在包 被的过程中适当持续地振荡所得的溶液可以保证反应混合物的均勻。在连接生物活性分子后，可以将颗粒转移至例如合适的膜并允许在使用前干燥，包被在样品组件或盒的表面上， 或加载至递送盒，以用于特定颗粒介导的递送设备。可以使用标准技术将配置的组合物适当制备为颗粒，如通过简单蒸发(空气干 燥)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干)、喷雾冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界流体颗 粒形成等。如果需要，可以使用国际公布WO 97/48485中描述的技术修饰所得的颗粒。3. 3. 5表面活性剂可以加入颗粒的表面活性剂包括磷酸甘油酯。示例的磷酸甘油酯包括磷脂酰胆 碱，如天然存在的表面活性剂、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(“DPPC”)。表面活性剂有利于 通过例如减少颗粒_颗粒相互作用改善表面性质，并可以使颗粒的表面粘附性变小。使用 对肺是内源性的表面活性剂可以避免使用非生理性表面活性剂的需要。假设在颗粒表面上的表面活性剂可以减少颗粒由于相互作用如静电相互作用、范 德华力和毛细管作用聚集的倾向。颗粒表面上的表面活性剂的存在可以提供增加的表面粗 造性(糙度)，从而通过减少颗粒_颗粒亲密相互作用可用的表面面积增加烟雾化。可以使用本领域已知的表面活性剂，包括任何天然存在的表面活性剂。其它示 例的表面活性剂包括双磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪醇如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙 烯-9-十二烷基醚；表面活性脂肪酸，如棕榈酸或油酸；三油酸山梨坦((Span85)；甘氨胆 酸盐；表面活性肽(surfactin)；泊洛沙姆(poloxamer)；山梨聚糖脂肪酸酯如三油酸山梨 坦；泰罗沙伯(tyloxapol)和磷脂。3. 4抗原旱.递细胞
具体实施例方式在一些具体实施方式
中，用于增加受试者中Gag特异性抗原呈递细胞数目的免疫 刺激剂是抗原呈递细胞或其前体，其获自需要治疗的受试者(即自体抗原呈递细胞或前 体)或获自与受试者的MHC匹配的或不匹配的供体(即异体抗原呈递细胞)。所希望地，供 体与受试者是组织相容的。在这些具体实施方式
中，通过将抗原呈递细胞或前体与下列物 质接触产生Gag特异性抗原呈递细胞或前体(i)在例如3. 1部分中所述的Gag多肽或Gag 肽，其合适地是例如3. 3部分中所述的可溶的形式或颗粒的形式，或(ii)在例如3. 2部分 中所述的表达Gag的核酸构建体，其合适地是例如3. 3部分中所述的可溶的形式或颗粒的 形式，上述物质的量和接触的时间足以使抗原呈递细胞或前体在其表面上呈递Gag肽。3. 4. 1抗原呈递细胞和其前体的来源可以通过本领域技术人员已知的方法分离抗原呈递细胞或其前体。这样的细胞的 来源将根据调节特异性免疫反应所需的抗原呈递细胞而变化。在本文中，抗原呈递细胞可 以选自树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞或其它骨髓系细胞。通常，可以从任何组织中分离抗原呈递细胞的前体，但是最容易地是从血、脐 带血或骨髓中分离(Sorg 等人，2001，Exp Hematol 29，1289-1294 ;Zheng 等人，2000，J Hematother Stem Cell Res 9，453-464)。还可能从疾病组织如类风湿滑膜组织或在活组 织检查或关节带(joint tap)后的液体(Thomas 等人，1994a，J Immunol 153，4016-4028 ； Thomas等人，1994b，Arthritis Rheum 37(4))。其它例子包括但不限于肝、脾、心、肾、 肠和扁桃体(Lu 等人，1994，J Exp Med 179，1823-1834 ;McIlroy 等人，2001，Blood 97， 3470-3477 ;Vremec 等人，2000，J Immunol 159，565-573 ;Hart 和 Fabre，1981，J Exp Med 154(2)，347-361 ；Hart 和 McKenzie，1988，J Exp Med 168 (1)，157-170 ；Pavli 等人，1990，
27Immunology 70(1), 40-47)。从组织中直接分离的白细胞提供抗原呈递细胞前体的主要来源。通常，通过在存 在或不存在各种生长因子的情况下培养这些前体才可以使其仅分化成抗原呈递细胞。根 据本发明的实践，抗原呈递细胞可以从粗混合物或从部分或基本上纯化的前体制备物中如 此分化。可以通过密度梯度离心，使用例如去除中性粒细胞和红细胞(外周血单核细胞或 PBMC)的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll Hypaque)，或通过氯化铵裂解红细胞(白细胞或白血 细胞)从血或骨髓中方便的纯化白细胞。许多抗原呈递细胞的前体作为不繁殖的单核细胞 存在于外周血中，其可以通过在特异性细胞因子存在的情况下培养而分化成特异性的抗原 呈递细胞，包括巨噬细胞和树突状细胞。通常可以通过切碎组织(例如真皮的基底层)和用胶原酶或分散酶消化，接着通 过密度梯度分离或基于细胞表面标记的表达选择前体，获得源自组织的前体如组织树突状 细胞或朗格汉斯细胞的前体。例如，朗格汉斯细胞前体表达CDl分子以及HLA-DR并且可以 基于此被纯化。在一些具体实施方式
中，抗原呈递细胞前体是巨噬细胞的前体。通常，这些前 体可以从任何来源的单核细胞获得，并可以通过在存在介质和巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)的情况下延长孵育而被分化为巨噬细胞(Erickson-Miller等人，1990，Int J Cell Cloning 8，346-356 ；Metcalf 和 Burgess，1982，J Cell Physiol,111，275—283)。在其它的具体实施方式
中，抗原呈递细胞前体是朗格汉斯细胞的前体。通常，朗 格汉斯细胞可以从人单核细胞或CD34+骨髓前体、在存在粒细胞/巨噬细胞集落刺激因 子(GM-CSF)、IL-4/TNF α 和 TGF β 的情况下产生(Geissmann 等人，1998，J ExpMed, 187, 961-966 ；Strobl 等人，1997a，Blood 90,1425-1434 ；Strobl 等人，1997b，dvExp Med Biol 417，161-165 ;Strobl 等人，1996，J Immunol 157,1499-1507)。还在其它的具体实施方式
中，抗原呈递细胞是树突状细胞的前体。几个潜在的树 突状细胞前体可以从外周血、脐带血或骨髓中获得。这些包括单核细胞、CD34+干细胞、粒细 胞、CD33+CDllc+DC前体和定型的骨髓祖细胞-在下面描述。单核细胞可以在存在组织培养基(例如RPMI)和血清(例如人或胎牛血清)的情况下 或在无血清培养基中，通过附着至塑料1-2小时纯化单核细胞(Anton等人，1998，Scand J Immunol 47，116-121 ;Araki 等人，2001，Br J Haematol 114，681-689 ;Mackensen 等 人，2000，Int J Cancer 86，385-392 ;Nestle 等人，1998，Nat Med 4，328-332 ;Romani 等 A, 1996, J Immunol Meth 196，137-151 ;Thurner 等人，1999，J Immunol Methods 223， 1-15)。还可以从外周血中淘选单核细胞(Garderet等人，2001，J Hematother Stem Cell Res 10,553-567)。还可以通过免疫亲和技术，包括免疫磁性选择、流式细胞仪分选或淘选 (Araki 等人，2001，上文；Battye 和 Shortman，1991，Curr. Opin. Immunol. 3,238-241)并使 用抗CD14抗体获得CD14hi细胞而纯化单核细胞。可以通过体内使用各种细胞因子，包括 GM-CSF，增加循环的单核细胞的数目(因此增加产量)(Groopman等人，1987，N Engl J Med 317,593-598 ;Hill 等人，1995，J Leukoc Biol 58,634-642) 可以通过在 GM-CSF 和 IL-4 存在下延长孵育使单核细胞分化成树突状细胞(Romani等人，1994，J Exp Medl80,83-93 ； Romani等人，1996，上文)。在GM-CSF和IL-4的每个浓度为约200至约2000U/mL之间将
28其组合，更优选地在约500至约1000U/mL之间和甚至更优选地在约800U/mL (GM-CSF)和 1000U/mL(IL-4)之间将其组合，产生显著量的未成熟树突状细胞，即获取抗原的吞噬性树 突状细胞。其它促进单核细胞向获取抗原的吞噬性树突状细胞分化的细胞因子包括例如 IL-13。CD34+干细胞树突状细胞还可以在GM-CSF、TNFa 士干细胞因子(SCF、c-kitL)或GM-CSF、 IL-4士flt3L存在的情况下从源自CD34+骨髓的前体中产生(Bai等人，2002，Int JOncol 20，247-53 ;Chen 等人，2001， Clin Immunol 98，280-292 ;Loudovaris 等人，2001， J Hematother Stem Cell Res 10，569-578)。CD34+细胞可以源自骨髓抽吸或源自血，并可以 使用用于单核细胞的方法例如免疫磁性选择或免疫柱被富集(Davis等人，1994，J Immunol Meth 175,247-257)。可以通过在体内使用各种细胞因子，包括(最常见的)G-CSF，但还 有flt3L和祖细胞生成素(progenipoietin)，增加血中CD34+细胞的比例(Fleming等人， 2001, Exp Hematol 29，943-951 ;Pulendran等人，2000，J Immunol 165,566-572 ；Robinson 等人，2000，J Hematother Stem CellRes 9,711-720)。其它的骨髓祖细胞可以用与⑶34+干细胞相似的方式在存在GM-CSF和IL-4/TNF的情况下从定型 的早期骨髓祖细胞中产生DC。这样的骨髓前体浸润许多炎症中的组织，包括类风湿关节炎 滑膜液(Santiago-Schwarz 等人，2001，J Immunol. 167，1758-1768)。包括循环的树突状 细胞前体和单核细胞的总体骨髓细胞的扩增可以使用某些细胞因子，包括flt-3配体、粒 细胞集落刺激因子(G-CSF)或祖细胞生成素(pro-GP)完成(Fleming等人，2001，见上文； Pulendran等人，2000，见上文；Robinson等人，2000，见上文)。向人类或其它哺乳动物施与 这样的细胞因子数日可以能够使大量的前体从外周血或骨髓中产生，以用于体外操作。树 突状细胞可以在GM-CSF、IL-4和TNFa存在下从外周血中性粒细胞前体中产生(Kelly等 人，2001，Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47，43-54 ;0ehler 等人，1998，J Exp Med. 187， 1019-1028)。应该注意的是，还可以使用相似的方法从急性骨髓白血病细胞中产生树突状 细胞(Oehler 等人，2000，Ann Hematol. 79，355-62)。 组织DC前体和其它来源的APC前体用于产生DC的其它方法来自于例如在IL-3+/-GM-CSF存在下的胸腺前体，在 GM-CSF和胶原基质存在下的肝DC前体。可以使用原癌基因产生经转化的或永生的树突状 细胞系，如例如(Paglia等人，1993)所述的v-myc或(Banyer和Hapel，1999 ；Gonda等人， 1993)所述的myb。循环DC前体这些已经在人类和小鼠的外周血中有描述。还可以利用特定的细胞表面标记用于 鉴定合适的树突状细胞前体。特别地，各种树突状细胞前体群可以在血中通过表达CDllc 和不表达或低表达 CD14、CD19、CD56 和 CD3 鉴定(0' Doherty 等人，1994，Immunology 82， 487-493 ；0' Doherty 等人，1993，J Exp Med 178,1067-1078)。这些细胞还可以通过细胞 表面标记 CD13 和 CD33 鉴定(Thomas 等人，1993b，J Immunol 151 (12)，6840-6852)。已知是 类浆细胞树突状细胞前体的缺少⑶14、⑶19、⑶56和⑶3的第二亚型不表达⑶11c，但表达 0)123(11^-31 链)和!11^-01 尔&『1 18等人，2001，六111 J Pathol 159，237-243 ;Grouard 等人，1997, J Exp Med 185，1101-1111 ;Rissoan等人，1999，Science 283，1183-1186)。大多数循 环⑶Ilc+树突状细胞前体是HLA-DR+，但一些前体可以是HLA-DR-。已经明确地证明了外周 血树突状细胞前体缺少MHC II类的表达(del Hoyo等人，2002，Nature 415，1043-1047)。可选地，上述的⑶33+⑶14_λ°或⑶llc+HLA-DR+、谱系标记阴性的树突状细胞前体 可以通过在培养基或在单核细胞条件培养基中孵育18-36小时分化成更多成熟的抗原呈 递细胞(Thomas 等人，1993b，见上文；Thomas 和 Lipsky，1994，J Immunol 153，4016-4028) (0' Doherty等人，1993，见上文)。或者，在孵育外周血非T细胞或未纯化的PBMC后， 通过低密度鉴定成熟的外周血树突状细胞并因此可以用密度梯度纯化，包括甲泛葡胺 禾口 Nycodenz 纯化(Freudenthal 禾口 Steinman，1990，Proc Natl Acad Sci U S A 87， 7698-7702 ；Vremec 和 Shortman，1997，JImmunol 159，565-573)，或通过特异性单克隆抗 体，例如但不限于 CMRF-44mAb 纯化(Feamley 等人，1999，Blood 93，728-736 ；Vuckovic 等 人，1998，Exp Hemat0126，1255-1264)。类浆细胞树突状细胞可以直接从外周血中基于细 胞表面标记被纯化，然后在IL-3存在下孵育(Grouard等人，1997，见上文；Rissoan等人， 1999，见上文)。或者类浆细胞DC可以从上述的密度梯度或经孵育的外周血细胞的CMRF-44 选择中产生。通常，对于从任何前体产生的树突状细胞，当激活因子如源自单核细胞的细胞因 子、脂多糖和含有CpC重复的DNA、细胞因子如TNF-α、IL-6、IFN-α、IL-Ιβ、坏死细胞、 再粘附(re-adherence)、全细菌、膜成分、RNA或polyIC存在下孵育未成熟的树突状细胞 时，其将被激活(Clark，2002，J Leukoc Biol，71，388-400 ；Hacker 等人，2002，Immunology 105,245-251 ；Kaisho 和 Akira，2002，BiochimBiophys Acta 1589，1-13 ;Koski 等人，2001， Crit Rev Immunol 21，179-189)。树突状细胞激活的这一过程在NF-κ B抑制因子的存在 下被抑制(0' Sullivan 和 Thomas，2002，J Immunol 168,5491-5498)。在一些具体实施方式
中，可以将抗原呈递细胞或其前体的未培养群体引入受试 者，其未经历激活条件。抗原呈递细胞或其前体的未培养群体的说明性例子包括全血、新鲜 血或其组分，如但不限于外周血单核细胞(PMBC)、全血的棕黄层、浓缩红细胞、经照射的血、 树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞和天然杀伤T细 胞。在特别的具体实施方式
中，抗原呈递细胞的未培养群体选自新鲜分离的血或PMBC。在 其它具体实施方式
中，抗原呈递细胞的未培养群体是坏死的或细胞凋亡的群体。因此，细胞 的非培养群体可以与抗原接触，然后经历坏死的条件，这导致不可逆的细胞外伤(例如渗 透性冲击或暴露于化学毒物，如戊二醛)，其中细胞的特征是线粒体和细胞质的明显膨大， 然后是细胞的破坏和自溶。或者，非培养的细胞群体可以与本发明的生物活性分子接触， 然后经历细胞凋亡条件。可以使用本领域中已知的方法，包括但不限于病毒感染、用紫外线 照射、Y照射、类固醇、固定(例如用戊二醛)、细胞因子或通过在细胞培养基中去除供体 细胞的营养素，在体外或体内诱导表达或呈递抗原的细胞进行细胞凋亡。时程研究可以确 定足以在细胞群体中最佳诱导细胞凋亡的孵育时间。例如，用流行性感冒病毒感染的单核 细胞在感染后6个小时开始表达细胞凋亡的早期标记。细胞凋亡的特异性标记的例子包括 Annexin V、TUNEL+细胞、DNA梯状条带和碘化丙啶的摄取。3. 4. 2离体递送多肽或核酸可以用各种形式(包括核酸和多肽，其可以是可溶的或颗粒的)将本发明的Gag抗原呈递细胞。需要与抗原呈递细胞接触的Gag免疫刺激剂的量可以由 本领域技术人员通过经验确定。抗原呈递细胞应该以足以使这些细胞在其表面上呈递Gag 肽的时间暴露于Gag免疫刺激剂，以调节T细胞。在一些有利的具体实施方式
中，在Gag多 肽或Gag肽存在下孵育抗原呈递细胞约48、36、24、12、8、7、6、5、4、3或2小时以下或甚至约 60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2分钟以下)。可以使用脉冲追踪规程确定细胞 可选地处理和呈递Gag肽所需的时间和多肽的剂量，其中暴露于Gag抗原，然后清洗和暴露 于读出系统，例如抗原反应性T细胞。一旦确定了细胞在其表面上表达Gag肽所需的最佳时 间和剂量，可以使用规程制备细胞和用于诱导免疫原反应的Gag抗原。本领域技术人员应 该认识到这一点抗原呈递细胞在其表面上呈递抗原所需的时间长短可以取决于抗原或使 用的抗原的形式、其剂量和使用的抗原呈递细胞以及进行抗原加载的条件而变化。可以使 用常规过程由熟练的技术人员确定这些参数。可以通过在体外分析T细胞细胞毒活性或使 用抗原呈递细胞作为CTL的靶标确定抗原呈递细胞的引发效率。本发明还考虑到在暴露于 Gag抗原后可以检测抗原呈递细胞表面存在的Gag肽的本领域技术人员已知的其他方法。通常，约0. 1至20 μ g/mL的Gag抗原(例如Gag肽抗原)至约1百万至1千万的 抗原呈递细胞适合于产生预处理的抗原特异性抗原呈递细胞。通常，抗原呈递细胞与抗原 在37°C孵育约1至6小时，虽然还可能在与一个或多个生长因子孵育的时期内将抗原呈递 细胞暴露于Gag抗原。如本发明人以前确定的，肽抗原的成功呈递可以使用更短的孵育时 间(例如约5、10、15、20、30、40、50分钟)并使用浓度约10-20 μ g/mL的抗原获得。如果需要，可以将所有抗原呈递细胞或其一部分在合适的冷冻保存溶液中冷冻， 直到需要使用它们时。例如，可以将细胞稀释在合适的培养基中，如含有10%自体血清 +10%磷酸缓冲盐水中的二甲基亚砜的培养基。在某些具体实施方式
中，细胞以脱水的形式 保存。在一些具体实施方式
中，可以通过本领域技术人员已知的方法增加外源性Gag 抗原向抗原呈递细胞的递送。例如，已经开发了几个不同的策略以将外源性抗原递送至 抗原呈递细胞，特别是树突状细胞的内源性处理途径。这些方法包括将抗原插入PH敏感 的脂质体(Zhou和Huang，1994，Immunomethods 4，229-235)、可溶性抗原的胞饮细胞摄 取后的吞饮体的渗透性裂解(Moore等人，1988，Cell 54，777-785)、将抗原偶联至强的佐 剂(Aichele 等人，1990，J. Exp. Med.，171，1815-1820 ；Gao 等人，1991，J. Immunol.，147， 3268-3273 ；Schulz 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，991-993 ；Kuzu 等 A, 1993, Euro. J. Immunol. 23，1397-1400 ；和 Jondal 等人，1996，Immunity 5，295-302)、外来体 (exosome) (Zitvogel 等人，1998Nat Med. 4,594-600 ；2002, Nat Rev Immunol. 2,569-79) 和抗原的细胞凋亡细胞递送(Albert等人，1998，Nature 392,86-89 ；Albert等人，1998， Nature Med. 4，1321-1324 和国际公布 WO 99/42564 和 WO 01/85207)。可以将重组的细菌 (例如大肠杆菌)或转染的宿主哺乳动物细胞脉冲到用于抗原递送的树突状细胞(分别作 为颗粒抗原或凋亡小体)。在逻辑上，这样的递送系统可以与用于抑制NF-κ B的物质，如编 码显性负性I κ Ba的质粒(Pai等人，2002，J Virol 76，1914-1921)组合。还已经使用重 组嵌合病毒样颗粒(VLP)作为载体，所述载体用于将外源性异种抗原递送至树突状细胞系 的 MHC I 类处理途径(Bachmann 等人，1996，Eur. J. Immunol.，26 (11)，2595-2600)。或者，或另外，可以将抗原连接至溶细胞素或与之结合，以增加抗原向本发明的抗
31原呈递细胞的胞质溶胶的转移，所述抗原呈递细胞用于递送至MHC I类途径。示例的溶细 胞素包括皂素化合物，如含有皂素的免疫刺激复合物(ISCOM)(参见例如Cox和Coulter， 1997，Vaccine 15 (3)，248-256 和美国专利号 6，352，697)、磷脂酶(参见例如 Camilli 等 人，1991，J.Exp. Med. 173，751-754)、形成孔的毒素(例如α -毒素)、革兰氏阳性细菌的天 然溶细胞素如李斯特菌素0(LL0，例如Mengaud等人，1988，Infect. Immun. 56，766-772和 Portnoy 等人，1992，Infect. Immun. 60，2710-2717)、链球菌溶血素 O (SL0，例如 Palmer 等 人，1998，Biochemistry 37 (8)，2378-2383)和产气荚膜梭菌溶血素 O (perfringolysin 0， PF0,例如Rossjohn等人，Cell 89 (5)，685-692)。当抗原呈递细胞是吞噬小体时，可以有利 地使用酸激活的溶细胞素。例如，在微酸性pH(吞噬小体中的pH条件)下李斯特菌素显示 更大的形成孔的能力，从而促进液泡(包括吞噬小体和内含体)成分递送至细胞质中(参 见例如 Portnoy 等人，1992，Infect. Immun. 60，2710-2717)。溶细胞素可以与Gag多肽或肽一起以单一组合物的形式提供或可以作为分开的 组合物提供，以用于接触抗原呈递细胞。在一个具体实施方式
中，将溶细胞素与Gag多肽 或肽融合或与其连接，其中融合或连接允许将Gag多肽或肽递送至抗原呈递细胞的胞质溶 胶中。在另一个具体实施方式
中，溶细胞素和Gag多肽或肽以递送载体的形式提供，所述 载体例如但不限于脂质体或选自病毒、细菌或酵母的微生物递送载体。合适地，当递送载 体是微生物递送载体时，递送载体是无毒性的。在这类的优选具体实施方式
中，递送载体 是无毒性的细菌，如例如Portnoy等人在美国专利号6，287，556中描述的，其包含编码非 分泌的功能性溶细胞素的第一多核苷酸(其可操作地连接至表达细菌中的溶细胞素的调 控序列)，和编码Gag多肽或肽的第二多核苷酸。可以通过各种机制提供非分泌的溶细胞 素，例如缺少功能性信号肽、分泌机能不全的微生物如具有遗传损伤(例如功能性信号序 列突变)的微生物或中毒的微生物等。可以使用广泛种类的非毒性、非致病性的细菌；优 选的微生物是被相对良好鉴定的株，特别是实验室大肠杆菌株，如MC4100、MC1061、DH5 α 等。可以为本发明工程化的其它细菌包括良好鉴定的、非毒性的、非致病性的单核细胞增 多性李其j 特菌(Listeria monocytogenes)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、分支杆菌 (mycobacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。在特 定的具体实施方式
中，细菌被减毒为在宿主基因组中是非复制的、非整合的，和/或在细胞 间或细胞内是非运动的。上述递送载体以及例如在3. 3部分中描述的颗粒载体实质上可以用于将一个或 多个Gag多肽和/或肽递送至任何能够内吞所述载体的抗原呈递细胞，包括吞噬性和非吞 噬性抗原呈递细胞。在具体实施方式
中，当递送载体是微生物时，所述方法通常需要靶细胞 摄取微生物并随后在抗原呈递细胞液泡(包括吞噬小体和内含体)内将其裂解。4.淋巴细胞
具体实施例方式可以通过任何数目的方法获得或制备本发明的抗原呈递细胞，以使其含有和/或 表达Gag抗原，以便抗原或其经处理的形式被这些细胞呈递，所述这些细胞用于潜在调节 其它免疫细胞，所述其他免疫细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，并特别用于产生经预处理 而对Gag抗原反应的T淋巴细胞和B淋巴细胞。经预处理而对Gag抗原反应的淋巴细胞在 本文也称为Gag预处理的淋巴细胞。在一些具体实施方式
中，Gag特异性抗原呈递细胞可以用于产生用Gag抗原预
32处理的T淋巴细胞。诱导淋巴细胞(特别是T淋巴细胞)显示针对Gag抗原的免疫反应 的效率可以通过任何合适的方法确定，所述方法包括但不限于使用例如抗原特异性的抗 原呈递细胞作为抗原特异性溶细胞T淋巴细胞(CTL)的靶标在体外分析T淋巴细胞的溶 细胞活性的方法；分析抗原特异性T淋巴细胞增殖的方法(参见例如Vollenweider和 Groseurth, 1992，J. Immunol. Meth. 149 :133_135)、使用例如 ELISPOT 分析和 ELISA 分析的 测定B细胞对抗原的反应的方法；探寻细胞因子特征的方法；或通过测试皮肤对特异性抗 原的反应测定迟发型超敏(DTH)反应的方法(参见例如Chang等人(1993，CanCer Res. 53 1043-1050)。本发明还考虑到可以检测在暴露于Gag抗原后抗原呈递细胞表面存在Gag肽 的本领域技术人员已知的其他方法。因此，本发明还提供了抗原特异性B或T淋巴细胞，特别是T淋巴细胞，其以抗原 特异性的方式对Gag抗原的呈递有反应。在一些具体实施方式
中，通过将以上限定的Gag 特异性抗原呈递细胞与T淋巴细胞群体接触产生抗原特异性T淋巴细胞，T淋巴细胞可 以从任何合适的来源，如脾或扁桃体/淋巴结中获得，但优选从外周血中获得。T淋巴细 胞可以用作粗制备物或作为部分纯化的或基本上纯化的制备物，其使用标准技术，如例如 “Immunochemical Techniques, Part G :Separationand Characterization of Lymphoid Cells” (Meth. in Enzymo 1. 108，Edited by Di Sabato 等人，1984，Academic Press)中描 述的技术合适地获得。这包括与羊红血细胞形成花环、穿过尼龙羊毛柱传代或塑料粘附以 去除粘附细胞、使用合适的单克隆抗体的免疫磁性或流式细胞仪选择是本领域已知的。将T淋巴细胞的制备物与本发明的Gag特异性抗原呈递细胞接触足够的时间，以 用Gag抗原或那些抗原呈递细胞呈递的抗原预处理T淋巴细胞。该过程将优选为至少约1 天，并多达约5天。在一些具体实施方式
中，在T淋巴细胞的异种群体存在下培养Gag特异性抗原呈 递细胞的群体，所述淋巴细胞与本发明的多个Gag肽一起从外周血中适当地获得。在足以 使抗原呈递细胞呈递肽或其经处理的形式的条件下，和足以使抗原呈递细胞起始T淋巴细 胞的亚群对Gag抗原反应的条件下培养这些细胞一段时间。5.基于细胞的治疗或预防在3. 4部分中描述的Gag特异性抗原呈递细胞和在4部分中描述的Gag预处理的 淋巴细胞可以单独或组合施与患者，以调节免疫反应，特别是调节对Gag多肽的免疫反应。 因此，这些基于细胞的组合物可以用于治疗或预防慢病毒感染或相关的状况。可以通过任 意方法(例如注射)将本发明的细胞引入患者，其产生对抗原或抗原组的所需免疫反应。 细胞可以源自患者(即自体细胞)或源自与患者的MHC匹配的或不匹配的(即异体的)个 体。通常，将自体细胞注射回获得细胞的患者中。注射位点可以是皮下、腹膜内、肌肉内、 真皮内、静脉内或淋巴内。可以将细胞以治疗或预防或减轻疾病或状况的症状的足够量施 与已经患有疾病或状况的患者，或易得疾病或状况的人。注射入需要该治疗或预防的患者 中的细胞数目可以根据(尤其)抗原或个体的大小而变化。这一数目可以在例如约IO3至 IO11之间的范围，通常在约IO5至IO7细胞之间(例如以血、PMBC或纯化的树突状细胞或T 淋巴细胞的形式)。可以进行单次或多次(2、3、4或5)施与细胞，细胞的数目和方式由治疗 医师选择。应该在药学上可接受载体中施与细胞，其对于细胞和个体是非毒性的。这样的 载体可以是细胞生长的生长培养基，或任何合适的缓冲的介质，如磷酸盐缓冲盐水。细胞可以单独施与或作为辅助治疗与本领域已知的其它治疗剂结合施与，以治疗或预防不良的免 疫反应，所述其他治疗剂例如但不限于糖皮质激素、氨甲喋呤、D-青霉胺、羟氯喹、金盐、柳 氮磺吡啶、TNF-α或白介素-1抑制因子和/或其它形式的特异性免疫治疗。6.治疗和预防在3. 1部分中描述的Gag多肽和肽，和在3. 2部分中描述的表达Gag的核酸构建 体，以及在3. 3部分中描述的Gag颗粒，和在3. 4部分中描述的Gag特异性抗原呈递细胞和 在4部分中描述的Gag预处理的淋巴细胞(“免疫刺激剂”或“Gag免疫刺激剂”)可以单 独使用或一起使用作为活性成分，以治疗或预防慢病毒感染，包括治疗慢病毒相关的疾病 或状况，如但不限于获得性免疫缺陷疾病。这些免疫刺激剂可以单独或以组合物形式(其 中它们与合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂或佐剂混合)施与患者。因此，本发明包括治疗或预防慢病毒感染的方法，其基本上由向需要这样的治疗 的患者施与有效量的上面广泛描述的至少一个Gag免疫刺激剂组成。在一些具体实施方式
中，方法基本上由下列步骤组成以有效增加Gag特异性抗体呈递细胞或其前体数目的量 向具有慢病毒感染的个体或具有慢病毒感染风险的个体施与Gag免疫刺激剂，从而治疗或 预防慢病毒感染。因此，本发明的方法适于治疗具有慢病毒感染的个体；具有患上慢病毒感染风险 的个体；和曾经治疗慢病毒感染但复发的个体。这样的个体包括但不限于具有健康的完整 免疫系统但有变为HIV感染风险的个体(“危险”个体)。危险个体包括但不限于与变为 HIV感染的一般群体相比有更大可能性的个体。具有变为HIV感染风险的个体包括但不限 于由于与HIV感染个体有性活动而具有HIV感染风险的个体；静脉内药物使用者；可能已 经暴露于HIV感染的血、血制品或其他HIV污染的体液的个体；和由HIV感染母亲照顾的婴 儿。适于治疗的个体包括被HIV-I和/或HIV-2和/或HIV-3或任何其变体感染或有变为 被HIV-I和/或HIV-2和/或HIV-3或任何其变体感染风险的个体。适于用本发明的方法 治疗的个体还包括具有难以用其他抗病毒治疗剂治疗的慢病毒感染的个体。在特别的具体实施方式
中，该方法用于治疗或预防慢病毒相关疾病(例如获得性 免疫缺陷疾病，如AIDS)，因此本发明还延伸至在受试者中治疗或预防慢病毒相关疾病的方 法，其中所述方法通常包括以有效治疗或预防疾病的量向受试者施与如上广泛描述的Gag 免疫刺激剂。使用任何可获得的方法和适于药物递送的途径，包括体内和离体方法以及全身的 和局部的给药途径，向个体施与Gag免疫刺激剂。制剂和给药的技术可以在“Remington’ s Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing Co. ,Eaton,Pa.的最近版本中找至lj。合适的 途径可以包括例如肠内(例如口腔或直肠)、跨粘膜或肠内给药；胃肠外递送，包括肌肉内、 皮下、髓内注射以及鞘膜内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。为了注射，其组 成本发明的一个希望的具体实施方式
，本发明的免疫刺激剂可以以水溶液的形式配制，通 常以生理上相容的缓冲液，如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理盐水缓冲液的形式。为了 跨粘膜给药，在制剂中使用适于透过屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知 的。例如，为了施与免疫原组合物、疫苗和DNA疫苗，肌肉内和皮下注射是适当的。在本发 明的某些具体实施方式
中，静脉内施与免疫刺激剂。可以使用本领域中熟知的药学上可接受的载体容易地将Gag免疫刺激剂配制成
34适于口服给药的剂量。这样的载体使本发明的化合物能配制成剂量形式，如片剂、药丸、胶 囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，以用于需要治疗的患者的口腔吞咽。这些载体可以选 自糖、淀粉、纤维素和其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻朊酸、 磷酸盐缓冲的溶液、乳化剂、等渗盐水或无致热原的水。用于胃肠外给药的药物制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化 合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油， 如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水质注射悬浮液可以含 有增加悬浮液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。可选地，悬浮液还可以含 有适当的稳定剂或增加化合物可溶性的试剂，以允许制备高浓度的溶液。用于口腔使用的药物制备物可以通过将活性化合物与固体赋形剂组合，可选地在 加入合适的辅助剂(如果需要)后研磨所得混合物并处理颗粒的混合物而获得片剂或糖 衣片的核心。合适的赋形剂是(特别地)填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇； 纤维素制备物，如例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维 素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯酮(PVP)。如果需要，可以加入 崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯酮、琼脂或藻朊酸或其盐，如藻朊酸钠。可以通过任何药学方 法制备这样的组合物，但是所有的方法包括以下的步骤用构成一个或多个必需成分的载 体与上述的一个或多个治疗试剂结合。通常，可以以自知的方式制造本发明的药物组合物， 例如通过常规的混合、溶解、粒化、制作糖衣片、磨细、乳化、装入胶囊、包入或冻干过程的方 法。糖衣片的核心具有适当的涂层。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可选地可以 含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适 当的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣片涂层中加入染料或色素以便识别或鉴别 活性化合物剂量的不同组合。可以口服使用的药物包括由明胶制成的推入配合的胶囊以及由明胶和增塑剂 (如甘油或山梨醇)制成的软的密闭的胶囊。推入配合的胶囊可以含有与填充剂如乳糖、 粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和可选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊 中，活性化合物可以溶解或悬浮于合适的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另 外，可以加入稳定剂。本发明的Gag免疫刺激剂的剂型还可以包括特别为此目的设计的注射或植入控 释设备，或被修饰而以这一方式另外起作用的其它形式的植入物。本发明的试剂的控释可 以受下列因素影响例如以疏水性聚合物，包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪族醇、聚乳酸和聚 乙醇酸，和某些纤维素衍生物，如羧丙基甲基纤维素包被同一试剂。另外，控释可以受使用 其它的聚合物基质、脂质体和/或微球影响。本发明的Gag免疫刺激剂(例如Gag多肽和肽)可以与药学上相容的抗衡离子一 起作为盐提供。药学上相容的盐可以用许多酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、 酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐倾向于在水质或其它质子溶剂(为相应的游离碱形式)中更 可溶。或者，可以以局部而不是全身的方式施与Gag免疫刺激剂，例如通过将化合物直 接注射至组织中，通常用储存的或持续释放的制剂。另外，可以施与定向药物递送系统中的如，在用组织特异性抗体包被的脂质体中，如例如3. 3部分中所述的。脂质 体可以靶向组织和有选择地被组织摄取。适于本发明使用的药物组合物包括这样的组合物其中以获得其预期目的的有效 量含有活性成分。施与患者的试剂的剂量应该足以随时间影响患者的有益反应，如减少于 状况相关的症状。需要施与的免疫刺激剂的量可以取决于需要治疗的受试者，包括其年龄、 性别、体重和一般健康状况。在这一点上，用于给药的免疫刺激剂的精确量将取决于执业医 师的判断。为了确定在治疗或预防所述状况中施与的免疫刺激剂的有效量，医生可以评估 靶抗原的组织水平和疾病或状况的进展。在任何情况下，本领域技术人员可以容易的确定 本发明的免疫刺激剂的合适剂量。对于本发明的方法中使用的任何化合物，有效剂量可以最初从细胞培养分析或动 物模型中估计。本发明的免疫刺激剂的毒性或治疗效率可以通过细胞培养或动物实验中的 标准药学过程确定，例如用于测定LD50(50%群体致死的剂量)和ED50(50%群体治疗有 效的剂量)的药学过程。在毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗的指数，其可以表达为 LD50/ED50的比例。优选显示大的治疗指数的化合物。从这些细胞培养分析和动物研究中 获得的数据可以用于配置一系列用于人的剂量。这样的化合物的剂量优选处于包括有很少 或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。所述剂量可以在这一范围内根据使用的剂量形式 和使用的给药途径而变化。准确的制剂、给药途径和剂量可以由各个医生考虑患者的状况 而选择(参见例如 Fingl 等人，1975，in“The Pharmacological Basisof Therapeutics，，， Ch. Ip 1)。可以个别地调整剂量量和间隔以提供活性化合物的血浆水平，所述水平足以维持 Gag减少的效应或减轻慢病毒感染或相关疾病或状况的影响。用于全身给药的通常患者剂 量的范围为l_2000mg/天，常见地为l_250mg/天和通常10_150mg/天。根据患者的体重 而定，通常的剂量为0. 02-25mg/kg/天，常见地为0. 02_3mg/kg/天，通常为0. 2-1. 5mg/kg/ 天。根据患者体表面积而定，通常剂量为0. 5-1200mg/m2/天，常见地为0. 5-150mg/m2/天， 通常为5-100mg/m2/天。在一些具体实施方式
中，施与Gag免疫刺激剂的单一剂量。在其它的具体实施方 式中，施与免疫刺激剂的多剂量。当在一段时间内施与多剂量时，在一段时间内每日施与免 疫刺激剂两次(qid)、每日一次(qd)、每两天一次(qod)、每三天一次、每周三次(tiw)或每 周两次(biw)。在说明性例子中，在从一天至约2年或更长的时间内以qid、qd、qod、tiW或 biw施与免疫刺激剂。合适地，以任何上述的频率施与免疫刺激剂一周、两周、一个月、两个 月、六个月、一年或两年或更长，这取决于各种因素。在一些具体实施方式
中，免疫刺激剂的有效量是这样的量相对于没有用免疫刺 激剂治疗的个体的慢病毒载量，在经治疗的个体中减少慢病毒载量至少约10%、至少约 20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少 约90%、至少约95%或更多。在一些具体实施方式
中，Gag免疫刺激剂的有效量是这样的量相对于没有用免 疫刺激剂治疗的个体的CD4+T细胞计数，增加个体中的CD4+T细胞计数至少约10%、至少约 20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少 约90%、至少约100%、至少约2. 5倍、至少约3倍、至少约3. 5倍，至少约4倍，至少约5倍
36或至少约10倍或更多。在一些具体实施方式
中，Gag免疫刺激剂的有效量是恢复CD4+T细胞计数至正常范 围内的量。在人血中，被认为是在正常范围的⑶4+T细胞数目是从约600至约1500个⑶4+-T 细胞/mm3血。治疗或预防慢病毒感染包括但不限于降低慢病毒感染的可能性、减少来自受感染 的细胞的慢病毒向易感染细胞的扩散、减少慢病毒感染个体中的病毒载量、减少慢病毒感 染个体中病毒编码的多肽量和增加慢病毒感染个体中CD4+T细胞计数。各种方法中的任一个可以用于确定治疗/预防方法是否有效。例如，确定本发明 的方法是否可以有效减少慢病毒载量和/或治疗慢病毒感染的方法是任意已知的用于慢 病毒感染指征的测试，包括但不限于通过下列方式测定病毒载量例如通过测量生物样品 中慢病毒的量(例如使用对慢病毒多核苷酸序列特异性的引物进行聚合酶链反应(PCR))； 检测和/或测定慢病毒编码的多肽，例如p24、gpl20、逆转录酶(使用例如对多肽特异的抗 体进行酶联免疫吸附法(ELISA)的免疫测定方法)；和测定个体中的CD4. sup.+T细胞计 数。分析慢病毒感染(或任何与慢病毒感染相关的指征)的方法是本领域中已知的，并在 许多出版物，如 HIV 规程(Methods in Molecular Medicine，17)N. L. Michael 和 J. H. Kim， eds. (1999)HumanaPress 中有描述。根据上文，应该理解的是，本发明的试剂可以用作治疗的或预防的免疫调节组合 物或疫苗。因此，本发明延伸至含有一个或多个本发明的Gag免疫刺激剂作为活性化合物 的免疫调节组合物的制备。考虑到任何合适的用于制备这样的疫苗的过程。示例的过程包 括例如那些New Generation Vaccines (1997，Levine 等人，Marcel Dekker, Inc. New York, Basel Hong Kong)中描述的过程。根据本发明的免疫调节组合物可以含有生理上可接受的稀释剂或赋形剂，如水、 磷酸盐缓冲的盐水和盐水。它们还可以包括本领域中熟知的佐剂。合适的佐剂包括但不限 于表面活性物质，如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、双十八烷 基二甲基溴化铵、N，N-双十八烷基-N’，N’双(2-羟乙基丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和 复合多元醇；聚胺，如吡喃、右旋糖酐硫酸酯、poly IC卡波姆(carbopol)；肽，如胞壁酰二 肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin)；油乳剂；和矿物胶，如磷酸铝、氢氧化铝 或明矾；淋巴因子、QuilA和免疫刺激复合物(ISCOMS)。本发明的Gag特异性抗原呈递细胞或前体和用Gag特异性抗原呈递细胞产生 的Gag处理的T淋巴细胞(如上述)可以用作用于预防或治疗应用的免疫调节组合物中 的免疫刺激剂。在一些具体实施方式
中，本发明的抗原特异性抗原呈递细胞用于产生大 量的CD8+或CD4+CTL，用于过继转移至不能进行正常免疫反应的免疫抑制的个体。例如， 可以过继转移Gag处理的CD8+CTL，用于受到慢病毒感染个体中的治疗目的(Koup等人， 1991，J. Exp. Med.，174 1593-1600 ；Carmichael 等人，1993，J. Exp. Med.，177 :249_256 ；和 Johnson 等人，1992，J. Exp. Med.，175 :961_971)。7.组合治疗Gag免疫刺激剂可以与至少一个第二治疗试剂组合(例如在同一个制剂中或在分 开的制剂中)施与个体(“组合治疗”)。可以将免疫刺激剂与第二治疗试剂混合施与或可 以在分开的制剂中施与。当在分开的制剂中施与时，可以基本上同时施与Gag免疫刺激剂和第二治疗试剂(例如相互在约60分钟、约50分钟、约40分钟、约30分钟、约20分钟、约 10分钟、约5分钟或约1分钟内)或时间间隔约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约 10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约72小时或更长。治疗试剂的有效量如上所述。治疗试剂可以与例如抗炎症性、抗病毒、抗真菌、抗分枝杆菌、抗生素、杀阿米巴 (amoebicidal)、杀毛滴虫(trichomonacidal)、止痛剂、抗肿瘤、抗高血压、抗微生物和/ 或类固醇药物在组合治疗中施与，以治疗抗病毒感染。在一些具体实施方式
中，用一个或 多个Gag免疫刺激剂与一个或多个下列物质组合治疗具有病毒或细菌感染的患者β _内 酰胺抗生素、四环素、氯霉素、新霉素、短杆菌肽、杆菌肽、磺胺类、呋喃西林、萘啶酸、可的 松、氢化可的松、倍他米松、地塞米松、氟可龙、强的松龙、曲安奈德、吲哚美辛、舒林酸、阿 昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、重组可溶⑶4 (rs⑶4)、抗受体抗体(例如对抗鼻病毒)、奈 韦拉平、西多福韦(Vistide )、膦甲酸钠(Foscarnet )、泛昔洛韦(famcyclovir)，更昔 洛韦(pencyclovir)、万乃洛韦(valacyclovir)、核酸/复制抑制剂、干扰素、齐多夫定 (zidovudine) (AZT，Retrovir )、齐多夫定 / 拉米夫定(Iamivudine) (Combivir)、去羟肌苷 (didanosine(双脱氧肌苷，ddl，Videx ))、司他夫定(stavudine (d4T, Zerit ))、扎西他 滨(zalcitabine (双脱氧胞嘧啶，ddC，Hivid ))、奈韦拉平(nevirapine (Viramune ))、拉 米夫定(lamivudine (Epivir , 3TC))、蛋白酶抑制剂、沙奎那韦(saquinavir (Invirase , Fortovase ))、利托那韦(ritonavir (Norvir ))、奈非那韦(nelf inavir (Viracept ))、 依非韦伦(efavirenz (Sustiva )),阿巴卡韦(abacavir (Ziagen ))、氨普那 韦(amprenavir(Agenerase ))茚地那韦(indinavir(Crixivan )),更昔洛韦 (ganciclovir)、AzDU、地拉韦啶(delavirdine (Rescriptor ))、洛匹那韦 / 利托那韦 (lopinavir/ritonavir (Kaletra))、三协韦(trizivir)、利福平(rifampin)、克拉霉素、促 红细胞生成素、集落刺激因子(G-CSF和GM-CSF)、非核苷逆转录酶抑制剂、核苷抑制剂、阿 霉素、氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、天冬酰胺酶和其组合。抗HIV试剂是那些在前述名单中特异性 靶向一个或多个HIV蛋白功能的试剂。在一些具体实施方式
中，Gag免疫刺激剂与二个或多个抗HIV试剂一起在组合 治疗中施与。例如，所述试剂可以与一个、两个或三个核苷逆转录酶抑制剂一起在组合 治疗中施与(例如可比韦(Combivir)、益平维(Epivir)、扎西他滨(Hivid)、叠氮胸苷 (Retrovir)、去羟肌苷(Videx)、赛瑞特(Zefit)、阿波卡伟(Ziagen)等)。本发明的免疫 刺激剂可以与一个或两个非核苷逆转录酶抑制剂(例如地拉韦定(Rescriptor)、依法韦仑 (Sustiva)、奈韦拉平(Viramune)等)一起在组合治疗中施与。Gag免疫刺激剂可以与一个 或两个蛋白酶抑制剂(例如安普那韦(Agenerase)、硫酸茚地那韦胶囊(Crixivan)、沙奎那 韦软凝胶剂(Fortovase)、沙奎那韦(Invirase)、快利佳(Kaletra)、利托那韦(Norvir)、奈 非那韦(Viracept)等)一起在组合治疗中施与。Gag免疫刺激剂可以与蛋白酶抑制剂和核 苷逆转录酶抑制剂一起在组合治疗中使用。Gag免疫刺激剂可以与蛋白酶抑制剂、核苷逆转 录酶抑制剂和非核苷逆转录酶抑制剂一起在组合治疗中使用。Gag免疫刺激剂可以与蛋白 酶抑制剂和非核苷逆转录酶抑制剂一起在组合治疗中使用。考虑到所述抑制剂与一个或多 个蛋白酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂和非核苷逆转录酶抑制剂的其他组合。8.用于评估免疫调节的方法
可以使用任何合适的技术评估免疫的有效性。可以通过评估经预处理而对Gag 反应的那些细胞是否增加数目、活性和检测和破坏该抗原或呈递该抗原的细胞的能力而 确定个体对Gag反应的能力。通过标准的测试测量免疫反应的强度，所述测试包括通过 本领域中的已知方法直接测量外周血淋巴细胞(参见例如Provinciali M.等人(1992， J. Immunol. Meth. 155 19-24)、细胞增殖分析(参见例如 VolIenweider，I.和 Groseurth， P.J. (1992，J. Immunol. Meth. 149 133-135)、免疫细胞和亚型的免疫分析(参见例如 Loeffler,D. A.等人(1992,Cytom. 13 169-174) ；Rivoltini,L.，等人(1992,Can. Immunol. Immunother. 34 241-251)；或用于细胞介导的免疫性的皮肤测试(参见例如Chang， Α. Ε.等人(1993，CancerRes. 53 1043-1050)。或者，可以使用一个或多个技术监测免疫 的效率，所述技术包括但不限于新鲜的和经刺激的PBMC的HLA I类四聚体染色(参见例 如 Alien 等人，2000，J. Immunol. 164(9) :4968_4978)、增殖分析(Allen 等人，见上文)、 ELISP0T分析和细胞内细胞因子染色(Allen等人，见上文)、线性B细胞反应的ELISA分析 和表达合成多核苷酸的细胞样品的Western印迹。特别相关的是被抗原激活的T细胞的细 胞因子特征，更特别地是正^^、11^-2、11^-4、11^-5、11^-1036卩3和TNF α的产生和分泌。可以通过本领域技术人员已知的任何合适技术评估T淋巴细胞的细胞毒活性，特 别是需要通过抗原呈递细胞诱导的细胞毒T淋巴细胞的能力。例如，获得含有需要被分析 细胞毒活性的T淋巴细胞的样品，然后将T淋巴细胞暴露于抗原预处理的抗原呈递细胞 (已经使其呈递抗原)。在适当的时间后(其可以通过评估已知能够被诱导为细胞毒细胞 的T淋巴细胞的对照群体的细胞毒活性而确定)，在标准的细胞毒分析中测试需要评估的T 淋巴细胞的细胞毒活性。评估CTL活性的方法特别用于评估个体对表达肿瘤或病毒抗原的细胞产生细胞 毒反应的能力。因此，该方法用于评估个体对癌症或病毒产生免疫反应的能力。例如，通过 使用51Cr标记的靶细胞并通过使用在肽包被的或重组病毒感染的细胞上的经刺激的脾细 胞或外周血单核细胞(PBMC)而使用CTL裂解分析。可以使用例如灵长类、小鼠或人类细胞 进行这样的分析(Allen等人见上文)。另外，可以使用体内检测方法测定远亲繁殖的灵长 类中的CTL活性，上述方法包括用可视检测的标记(例如荧光、化学发光或磷光或可视标记 或染料)标记自体细胞(例如PMBC)并使其接触本文公开的一个或多个Gag肽。选择它们 以便它们对应于在受试者的测试下是CTL反应目标的抗原。将自体细胞注入受试者，在适 当的时间后收集来自受试者的淋巴细胞，以允许受试者的免疫系统有足够的时间对自体细 胞反应(例如注入后10分钟至24小时)。然后分析收集的淋巴细胞以鉴定含有或载有可 视检测标记的淋巴细胞的数目或比例，其代表对受试者中抗原的体内CTL反应的测量。为了容易地理解本发明并付诸实施，现在利用下列非限制性实施例描述特别优选 的具体实施方式
。实施例在用肽脉冲的血免疫治疗SIV感染的猕猴后病毒血症的控制在接受了 ART的STV感染的短尾猕猴中研究了 OPAL免疫治疗。与可选的恒 河猴(rhesus macaque)模型相比，短尾猕猴具有至少相等的SIV感染致病过程9a°。用 SIVfflac251感染36只猕猴，3周后开始用抗逆转录病毒药物替诺福韦(tenofovir)和恩曲他 滨(emtricitabine)治疗数周。动物被随机地分配至通过血浆SIV病毒载量峰值(VL)、
39Mane-A^lO状态(在SIV感染的短尾猕猴中增加VL的MHC I类基因“)、重量和性别分成的 3组。用单独10 μ g/mL/肽的125重叠的SIV Gag 15mer肽(OPAL-Gag)或跨越所有9个 SIV蛋白的823SIV 15mer肽(OPAL-All)离体混合1小时的自体新鲜PBMC，在抗逆转录病 毒治疗的覆盖下(第4、6、8、10周)免疫4次猕猴，或不免疫。在第10周停止ART后跟踪 猕猴26周。所有36只猕猴都在暴露于SIVmae251后被感染并具有7. Ilog10拷贝/mL的VL平均 峰值。在接种前，4只动物在急性SIV感染过程中死亡，具有腹泻、脱水、嗜睡、厌食和体重减 轻的症状。可以很好地耐受接种，相对于对照，OPAL免疫的动物的平均体重、血液学参数或 临床观察无差别。在接种的过程后，OPAL免疫的动物中具有显著的SIV特异性⑶4+和⑶8+T细胞免 疫原性。在OPAL-Gag组中最后免疫后2周的平均Gag特异性⑶4和⑶8T细胞反应分别是 所有⑶4和⑶8T细胞的3. 0%和1. 9%。在OPAL-All组中最后免疫后2周的平均Gag特 异性CD4和CD8T细胞反应是0. 84%和0. 37%，在对照中是0. 15%和0.29% (图la、b)。 OPAL-All免疫动物中的Gag特异性T细胞，而不是对照或单独OPAL-Gag免疫的动物，还具 有升高的对所有其它SIV蛋白的T细胞反应。相对于在对照和OPAL-Gag组中对非Gag抗 原的所有⑶4/8反应的彡0. 4%，在OPAL-All组中的平均Εην、Ρο1和组合的调控蛋白特异 性的 CD4/CD8 反应分别是 2. 5% /11. 8%,0. 8% /0. 3%和 1. 5% /2. 4% (图 lc、d 和图 3)。 较强的对非Gag蛋白的CD8+T细胞反应与对Gag的CD8+T细胞反应的减小相关(图Ie)。因 此，虽然大量的SIV蛋白在OPAL-ALL免疫动物中被识别，与只用Gag肽免疫相比，Gag反应 减少。虽然在SIV感染后所有的动物都血清转化，用OPAL接种未发生抗体反应的显著增强。截止到第10周，在剩余的32只动物中的26只中，7周时间的ART控制的VL在 3. IloglO拷贝/mL以下。在ART上未能控制病毒血症的6只动物在第2周有较高的VL峰 值(相对于在ART上控制了病毒血症的动物的6. 94士0.52，平均值士SD为7. 74士0. 33，ρ < 0. 001)，在撤除 ART 后有较高的 VL (5. 98士0. 53 对 4. 28士0. 90, ρ < 0. 001)。对 VL 的控 制似乎对于被感染的猕猴7、12的免疫治疗中获得最佳结果是重要的。在ART上控制了病毒 血症的动物上(26只动物)进行了预定义的(每个规程)灵长类VL的端点分析(endpoint analyses)，虽然本发明人还通过调整在ART上的VL控制分析了所有的32只剩余的动物。在撤除ART后的10周中，在组合的0PAL-A11与OPAL-Gag治疗组之间的VL初级 端点比较比对照低0. 51og10拷贝/mL(p = 0. 084，图2，表7)。每个接种的组(0PAL-A11和 OPAL-Gag)有非常相似的VL降低。与对照相比，对调整了 ART上控制VL和Mane-A*10状态 的控制的所有动物的分析证明了 OPAL免疫的动物中VL的显著降低(表7)。截至撤除ART 后的6个月，对照和OPAL免疫组之间的平均差异是0. 931og10拷贝/mL 6个月(ρ = 0. 02， 表7)。为了使用灵敏的独立VL分析确认病毒学发现，将第32周研究中的冷冻血浆(ImL) 运至美国马里兰的国家癌症研究所(NCI)。M Piatak和J Lifson博士使用具有1. 51og1(1 拷贝/mL定量限的分析方法友善地盲(blindly)分析了样品的SIVRNA。Melbourne大学和 NCI的分析紧密相关(r = 0. 97,ρ < 0. 001)，并且在这一时间相对于对照，在已接种疫苗者 中显示几乎相同的平均病毒血症减少(分别为0. 82对0. 881ogl0拷贝/mL)。为了进一步评估SIV控制的持久性并用OPAL免疫治疗预防疾病，我们在没有ART的覆盖下用相同的过程(在第36、39、42周)再次激发相同随机组中的所有32只动物3次， 并追踪动物另外6个月。在免疫的动物中增强了 SIV特异性的T细胞免疫，与最初接种相 似(图1)。在撤除ART的正好1年的追踪时间内病毒控制得到维持(图2，表7)。剩余32只动物中的12只发生了早期AIDS，在延长的追踪过程中被安乐死，包括所 有未在ART上控制病毒血症的6个动物。在ART上控制了病毒血症的6只被安乐死的动物 中，5只在对照组中，1只在OPAL-Gag组中(图2)。通过分析在ART上控制了病毒血症的 26只动物(p = 0. 053)或所有32只动物(调整Mane-A*10状态和在ART上病毒血症的控 制(p = 0. 02，Table 7))，OPAL免疫治疗产生存活益处。本发明人还比较了 Env和Gag CTL反应者中的VL和外周⑶40水平。在疫苗组 的动物上进行最初的分析，从而评估治疗性免疫增强Env或Gag特异性T细胞的效果。鉴 于Mane-A*10阳性的动物都具有有益的对KP9抗原决定部位的Gag特异性CTL反应，排除 这些动物。事实上，相对于Mane-A*10阴性对照的5. 49士0. 351og10拷贝/mL，在该试验中 的Mane-A*10阳性对照在感染后的12-64周内有4. 06士0. 421og1(1拷贝/mL的平均VL(P = 0. 024，时间权重的曲线下面积分析)。与排除了Mane_A*10+动物的只具有Gag CD8+T细胞反应的动物相比，只有Env CTL 反应者在感染后的12-64周之间维持了显著高的平均VL(分别为5. 05士0. 381og10拷贝/ mL对3. 65士0. 241og1(1拷贝/mL。P = 0. 039，图4)。在感染后12-64周之间的6个只是 Env的反应者与7个Mane-A*10阴性的未接种的对照动物之间的平均VL有差异(分别为 5. 05士0. 381ogl。拷贝 /mL 和 5. 49士0. 351og1(l 拷贝 /mL,；图 4)。为了论述广泛的多蛋白的反应将是有益的推测，然后在这一分析中包括了那些对 Env和Gag都有反应的⑶8+T细胞的动物。具有Env和Gag特异性反应二者的3只动物的 平均VL在感染后12-64周之间为5. 01 士0. 561og10拷贝/mL。这比只有Gag的反应者显著 高(P = 0. 049)，但不比只有Env的反应者好。在最后接种和撤除ART后的正好1年中追踪在这一试验中的动物。这使得能够 分析外周⑶4+T细胞的去除和只对Env或Gag反应的动物的存活，那些对Env和Gag都反 应的动物的存活和未接种的对照的存活。在感染后12-64周之间，相对于6只只有Env的 反应者，只有Gag的3只反应者没有显著高的平均外周CD4水平(分别为23. 42% 士4. 22 和27. 44% 士3. 92，P = 0. 547图4)。与未接种的对照相比，具有Env和Gag特异性二者的 CD8+T细胞反应的3只动物在相同的时间内有不显著的但较低的平均外周CD4水平(分别 为 18. 59% 士3. 23 和 21. 19% 士3. 01 ；图 4)。在追踪过程中，32只动物中具有早期AIDS，包括体重减轻、⑶4+T细胞耗竭和血小 板减少症的总共6只接种的动物和6只对照被安乐死。相对于具有只对Gag反应的CTL的 动物，只对Env CD8+T细胞抗原决定部位反应的动物发展为AIDS的频率更高(图4)。总之，相对于未接种的对照，使用重叠的Gag SIV肽或跨越整个SIV基因组的肽的 OPAL免疫治疗是高度免疫原性的并产生显著低的病毒载量和存活益处。OPAL免疫的猕猴 中的病毒学效应在ART停止后持续12个月。不考虑研究的毒性SIVma。251-短尾猕猴模型9， 观察到OPAL免疫治疗上的本发现，并提供这一免疫治疗技术前景的有力原理验证。0PAL免疫治疗方法比许多其它细胞免疫治疗，特别是使用树突状细胞更简单。使 用DNA、CTLA-4封闭和基于病毒载体的方法现在还显示出在猕猴研究中的某些前景14,15，虽
41然这样的方法还未进入人类研究。这一研究向PBMC中加入肽，但是本发明人显示了甚至更 简单的技术将肽加入全血也是高度免疫原性的，这个技术将有更广的应用7。病毒特异性的CD4+T细胞通常在HIV感染的人类或SIV感染的猕猴中是非常弱的； 这些细胞的明显增加是通过OPAL免疫治疗诱导的，这可以成为其效率的基础16。虽然本发 明人最初在本研究中测量了产生IFN- γ的T细胞，近期的多功能ICS分析揭示OPAL免疫 治疗还可诱导还能够表达细胞因子TNF-α和11^-2、趋化因子肌？10和脱粒标记⑶107a的 T细胞。早期(感染后3周)用ART治疗对照和接种的猕猴，单独ART治疗与人类中短暂改 善的结果相关。尽管如此，在感染2周内的肠道中有大量的CD4+T细胞丢失17，并且，虽然在 感染后这样早的时间鉴定人类可能是挑战性的，这是HIV-I受试者出现急性感染的大约时 间。如果这些发现在人类试验中被确认，VL的 LOlogltl的降低将引起人类进行性HIV疾 病的重大延迟并允许合理的无需再引入ART的时间18。接种动物显示的对病毒血症的持续 控制是有趣的，并与其它近期的猕猴研究一致14，这揭示再免疫的需要可能是不重要的。OPAL-Gag和0PAL-A11组的对病毒血症的控制是相似的。虽然Gag重叠肽的剂量 相同，OPAL-Gag动物中的Gag特异性⑶4和CD8+T细胞反应比0PAL-A11动物中的高5. 1和 3.5倍。这揭示来自Gag和其它SIV蛋白的肽之间的抗原竞争。鉴定的Env特异性⑶8T细 胞反应不能显著影响病毒复制或疾病的进展。Env (或其它非Gag的蛋白)反应可能潜在地 抑制更有效的CD8+T细胞反应。与控制病毒血症相关的Gag特异性CTL反应的观察突出显 示了这一现象，然而具有Env和Gag特异性CD8+T细胞反应二者的动物在控制病毒血症和预 防疾病中不比只有Env的反应者或未接种的对照进行得更好。通过多蛋白HIV疫苗诱导免 疫显性非Gag T细胞反应可以限制Gag特异性T细胞反应的发展19。大量的人类研究证明 Gag特异性T细胞反在控制HIV病毒血症中是最有效的2°。总之，这些研究揭示治疗性HIV 疫苗可以不需要以最宽的多蛋白HIV特异性免疫为目的。用Gag肽的OPAL免疫治疗正在 进入被HIV感染的人类的初期试验中。材料和方法在动物伦理委员会批准的规程中研究没有猴逆转录病毒D型的年轻短尾猕猴 (Macaca nemestrina)，并根据澳大利亚国家健康和医学研究理事会的指导方针照顾它们。 通过参考链介导的构象分析和通过如所述的序列特异性引物PCR证实的Mane-A*10的存 在21’22 36用MHC I类等位基因对所有的短尾猕猴进行分类，用40个组织培养感染剂量的 SIVmac251 (由 R. Pal ,Advanced Biosciences，Kensington，MD 惠赠)静脉内注射猕猴，方法如 前面所述9’11，并在3周后随机分成12只动物的3组(0PAL-Gag、0PAL-All、对照)。对第2 周的SIV病毒载量峰值、体重、性别和MHC I基因Mane-A*10(已知其可以增强对SIV的免 疫控制)进行随机分类“。从第3周起的7周内动物接受用替诺福韦(tenofovir)和恩曲 他滨(emtricitibine)(由 Gilead，Foster City, CA 惠赠；两者都为 30mg/kg/ 动物)进行 的双抗逆转录病毒治疗的皮下注射从感染后的3-5周每日注射，从6-10周每周注射三次。 这一双ART控制了大多数被SIV感染的猕猴中的病毒血症12’15’23_25。 使用如前所述的PBMC用OPAL免疫治疗免疫两组动物(OPAL-Gag和0PAL-A11)7。 简单地说，从18mL血利用淋巴细胞分类液(FicolΙ-paque)分离外周血单核细胞(PBMC)
42(用肝素钠抗凝)。将所有分离的PBMC(平均2400万个细胞)悬浮于0. 5mL的正常盐水 中，其中以每个肽的在集合中为10iig/mL的浓度向正常盐水中加入125个SIVma。239Gag肽 的集合或 823 个跨越所有 SIVmac239 蛋白(Gag、Pol、Env、Nef、Vif、Tat、Rev、Vpr、Vpx)的 肽。15-mer的有11个氨基酸重叠的肽(纯度为> 80% )由NIHAIDS试剂储藏项目友善提 供(目录号为 6204、6443、6883、6448-50、6407、8762、6205)。为了集合肽，将每 lmg 管的冻 干的15mer肽溶于10-50 u L纯的DMS0并加在一起。SIV Gag和所有肽的集合的浓度分别 为629和72 u g/mL/肽。将肽脉冲的PBMC在37°C水浴中维持1小时，每15分钟轻柔振荡， 然后无需洗涤，再静脉内注入自体动物中。对照的猕猴不接受疫苗的治疗。免疫分析如前所述，通过表达细胞内IFN-Y分析SIV特异性⑶4和⑶8T细胞免疫反应19。简 单地说，将200 ii L全血与1 ii g/mL/肽重叠的15mer SIV肽集合(如上所述)或单独和DMS0 和共刺激的抗体抗CD28和抗CD49d (BDBiosciences/Pharmingen San Diego CA)和布雷菲 尔得菌素(Brefeldin)A(lOii g/mL，Sigma)在 37°C 孵育 6 小时。加入抗 CD3-PE、抗 CD4-FITC 和抗CD8-PerCP (BD,分别为克隆SP34、M_T477和SK1)抗体30分钟。裂解红血细胞(FACS裂 解溶液，BD)，透化处理剩余的白细胞(FACS透化溶液2，BD)并在固定和采集(LSRII，BD)前 用抗人 IFN-y-APC 抗体(BD，克隆 B27)孵育。使用 Flow jo 版本 6. 3. 2 (TreeStar, Ashland, OR)分析采集数据。在⑶3+⑶4+和⑶3+CD8+淋巴细胞亚型二者中评估表达IFNy的抗原特 异性门控淋巴细胞的百分比。如所述，通过Mane-A* 10/KP9四聚体评估Mane-A* 10+动物中 的对免疫显性SIV Gag⑶8T细胞抗原决定部位KP9的反应22。通过新鲜血的流式细胞术 测量总的外周CD4T细胞占淋巴细胞的比例。病毒分析在墨尔本大学使用前述的TaqMan 探针19’26在所有的时间点上通过140 u L血浆 的实时PCR定量血浆SIV RNA(较低的定量限为3. llog10拷贝/mL)，为了用更灵敏的分析 方法证实这些结果，如前所述，在来自国立癌症研究所的1. OmL血浆中的沉积的病毒体上 进行实时PCR定量血浆SIV RNA(较低定量限为1.51og1(l拷贝/mL)13。为了鉴定突变逃逸 是否发生在KP9抗原决定部位上，我们进行了 RT-PCR克隆，并对Gag中覆盖KP9的抽提的 血浆病毒cDNA进行测序，所述步骤如前所述21。端点/统计学分析去除ART后10周(即从12至20周的样品)，通过时间权重的曲线下面积(TWAUC)， 与对照相比，最初端点为0PAL免疫的动物的血浆SIV RNA中的减少。这一总结的统计学方 法被推荐用于研究，例如包括一系列测定的这些研究28。本发明人分别和一起将活性治疗组 (OPAL-Gag和0PAL-A11)与对照进行了比较。最初分析限定为在第10周在ART上控制了病 毒血症的动物(VL < 3. lloglO拷贝/mL)，因为对VL的控制是动物对免疫治疗反应能力的 重要预测因素7’29。在所有活的在ART后期(第10周)调整了 VL和Mane-A*10状态的动 物中研究了预先计划的第二病毒学端点。对于连续的数据使用两样本t检验(two-sample t-tests)进行组比较，对于二进制数据(binary data)使用Fisher确切检验(Fisher，s exact test)。存活分析使用Cox回归分析。功效计算本发明人估计治疗中断后回复VL的标准误差将是0. SloglO拷贝的SIVRNA/mL血浆5’12’15’23—25。在这一彻底的研究中，估计组中12只猴中的2只可能遇到一些问题，如对 ART的不完全反应或死于急性SIV感染。10只对照对10只活性治疗的比较产生80%的效 力(P = 0. 05)，以在第一个10周的过程在TWAUC VL中检测1. OloglO的差异。10只对照 对所有20只活性治疗的动物(OPAL-Gag加OPAL-Al 1)的估计比较给出80%的效力，以检测 0. 871ogl0拷贝/mLVL减少的差异。研究指导本研究根据预先写好的规程使用来自澳大利亚治疗物品管理局 (theAustralianTherapeutic Goods Administration) W ^M^^tM ff M fe M (Good Laboratory PracticeStandards)作为指导进行。规程的偏离很小，不影响研究的结果。在 研究过程中的部分数据审查没有引起任何关于研究指导的关注。对本文引用的每个专利、专利申请和公布的公开在此通过参考以其全部并入本文。本文对任何参考的引用不应该被解释为承认这样的参考可以作为本申请的“已有 技术”而获得。贯穿本说明书，目的是公开本发明的优选具体实施方式
而不将本发明限制为任何 一个具体实施方式
或特征的特定收集。因此，本领域技术人员理解，根据本公开，可以在示 例的特定具体实施方式
中作出各种修改和变化而不脱离本发明的范围。所有这样的修改和 变化都包括在随附的权利要求的范围内。表格魁保守的氨基酸置换
权利要求
一种治疗或预防受试者中慢病毒感染的方法，所述方法包括增加受试者中Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体的数目，所述Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体在其表面呈递包含对应于Gag多肽一部分的氨基酸序列的至少一个肽，其中以足以使抗原呈递细胞或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件将抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体与基本上由多个肽组成的组合物接触一段时间而产生Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特异性抗原呈递细胞前体，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中向受试者施与Gag特异性抗原呈递细胞或Gag特 异性抗原呈递细胞前体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中向受试者施与组合物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中颗粒含有肽或肽与颗粒结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中颗粒选自脂质体、微粒、脂质颗粒、陶瓷/无机颗粒 或聚合物颗粒。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括向受试者施与(1)包含对应于非 Gag慢病毒多肽的一部分的氨基酸序列的肽，或(2)已经与根据(1)所述的肽接触的抗原呈 递细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中抗原呈递细胞选自树突状细胞、巨噬细胞或朗格 汉斯细胞。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其中抗原呈递细胞或组合物与药学上可接受的载 体和/或稀释剂一起施与。
9.根据权利要求2或3所述的方法，其中抗原呈递细胞或组合物与佐剂一起施与。
10.根据权利要求3所述的方法，其中组合物与稳定稳定肽的化合物一起施与。
11.根据权利要求1所述的方法，其中慢病毒选自人免疫缺陷病毒(HIV)或猿猴免疫缺 陷病毒(SIV)。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在单个肽的一端或两端含有部分序列同一性或 相似性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中至少4个连续的氨基酸残基存在于这些末端的 一个或两个之中，其序列与至少一个其它肽内含有的氨基酸序列是相同的或相似的。
14.根据权利要求12所述的方法，其中肽的长度为至少6个氨基酸残基。
15.根据权利要求12所述的方法，其中肽的长度不超过约500个氨基酸残基。
16.根据权利要求12所述的方法，其中选择肽的长度以增加细胞毒T淋巴细胞反应的 产生。
17.根据权利要求16所述的方法，其中肽的长度为约8至约10个氨基酸。
18.根据权利要求12所述的方法，其中选择肽的长度以增加T辅助淋巴细胞反应的产生。
19.根据权利要求18所述的方法，其中肽的长度为约12至约20个氨基酸。
20.根据权利要求12所述的方法，其中肽序列源自对应于Gag多肽的至少约30%的序列。
21.根据权利要求12所述的方法，其中多个肽包含来自2个或多个不同Gag多肽的肽。
22.—种产生用于治疗或预防慢病毒感染的抗原呈递细胞的过程，所述过程包括以足 以使抗原呈递细胞或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件将抗原呈递细胞或抗 原呈递细胞前体与基本上由多个肽组成的组合物接触一段时间，其中组合物的各个肽包含 对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分 序列同一性或相似性。
23.根据权利要求22所述的过程，其中以足以从前体分化抗原呈递细胞的条件培养前 体一段时间。
24.根据权利要求22所述的过程，其中将肽与基本上纯化的抗原呈递细胞或其前体的 群体接触。
25.根据权利要求22所述的过程，其中将肽与抗原呈递细胞或其前体的异种群体接触。
26.根据权利要求25所述的过程，其中细胞的异种群体选自血或外周血单核细胞。
27.根据权利要求22所述的过程，其中抗原呈递细胞或其前体选自单核细胞、巨噬细 胞、骨髓系的细胞、B细胞、树突状细胞或朗格汉斯细胞。
28.根据权利要求22所述的过程，其中将肽与抗原呈递细胞或其前体的非培养群体接触。
29.根据权利要求28所述的过程，其中群体是同种的。
30.根据权利要求28所述的过程，其中群体是异种的。
31.根据权利要求28所述的过程，其中群体选自全血、新鲜血或其组分、外周血单核细 胞、全血的棕黄层组分、沉积的红细胞、经辐射的血、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性 粒细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞。
32.根据权利要求28所述的过程，其中群体未经历激活条件。
33.一种产生Gag预处理的淋巴细胞的方法，其中所述方法包括以足以起始淋巴细胞 对Gag多肽反应的条件将淋巴细胞或其前体的群体与通过权利要求22所述的过程产生的 Gag特异性抗原呈递细胞接触一段时间。
34.一种治疗或预防受试者中慢病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施与选自下 列物质的免疫调节剂(1)抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体，其已经以足以使抗原呈递 细胞或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件与基本上由多个肽组成的组合物接 触一段时间，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选 地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上由多个肽组 成的组合物，其中各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，与多个 肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴细胞或其前体的群体，其 已经以足以起始淋巴细胞对Gag多肽反应的条件与根据(1)所述的抗原呈递细胞接触一段 时间，其中以有效治疗或预防慢病毒感染的量施与免疫调节剂。
35.根据权利要求34所述的方法，其中全身施与免疫调节剂。
36.根据权利要求34所述的方法，其中通过注射施与免疫调节剂。
37.一种用于治疗或预防受试者中获得性免疫缺陷疾病的方法，所述方法包括向受试者施与选自下列物质的免疫调节剂(1)抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体，其已经以足 以使抗原呈递细胞或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件与基本上由多个肽组 成的组合物接触一段时间，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同 部分和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上 由多个肽组成的组合物，其中各个肽包含对应于对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分 和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴细胞或 其前体的群体，其已经以足以起始淋巴细胞对Gag多肽反应的条件与根据(1)所述的抗原 呈递细胞接触一段时间，其中以有效治疗或预防疾病的量施与免疫调节剂。
38.选自下列物质的免疫调节剂用于治疗或预防选自慢病毒感染或获得性免疫缺陷疾 病的状况的用途(1)抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体，其已经以足以使抗原呈递细胞 或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件与基本上由多个肽组成的组合物接触一 段时间，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，与 多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(2)基本上由多个肽组成的组 合物，其中各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分和可选地，与多个肽的至 少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性；或(3)淋巴细胞或其前体的群体，其已经以 足以起始淋巴细胞对Gag多肽反应的条件与根据(1)所述的抗原呈递细胞接触一段时间。
39.一种基本上由抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体组成的组合物，其已经以足以使 抗原呈递细胞或前体在其表面呈递肽或肽的经处理形式的条件与基本上由多个肽组成的 组合物接触一段时间，其中组合物的各个肽包含对应于Gag多肽的氨基酸序列的不同部分 和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体是基本上 纯化的抗原呈递细胞或前体的群体的形式。
41.根据权利要求39所述的组合物，其中抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体是抗原呈 递细胞或前体的异种群体的形式。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中抗原呈递细胞或其前体的异种群体选自血或 外周血单核细胞。
43.根据权利要求39所述的组合物，其中抗原呈递细胞或其前体选自单核细胞、巨噬 细胞、骨髓系的细胞、B细胞、树突状或朗格汉斯细胞。
44.根据权利要求39所述的组合物，其中抗原呈递细胞或其前体是抗原呈递细胞或其 前体的非培养群体的形式。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中群体是同种的。
46.根据权利要求44所述的组合物，其中群体是异种的。
47.根据权利要求44所述的组合物，其中群体选自全血、新鲜血或其组分、外周血单核 细胞、全血的棕黄层组分、沉积的红细胞、经辐射的血、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中 性粒细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞。
48.根据权利要求44所述的组合物，其中群体未经历激活条件。
49.根据权利要求39所述的组合物，不包括在其表面呈递包含对应于非Gag多肽部分 的氨基酸序列的肽的抗原呈递细胞。
50.一种基本上由多个肽组成的组合物，其中各个肽包含对应Gag多肽的氨基酸序列 的不同部分和可选地，与多个肽的至少一个其它肽显示部分序列同一性或相似性。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中颗粒含有肽或肽与颗粒结合。
52.根据权利要求51所述组合物，其中颗粒选自脂质体、微粒、脂质颗粒、陶瓷/无机颗 粒或聚合物颗粒。
53.根据权利要求50所述的组合物，进一步包含抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体是基本上 纯化的抗原呈递细胞或前体的群体的形式。
55.根据权利要求53所述的组合物，其中抗原呈递细胞或抗原呈递细胞前体是抗原呈 递细胞或其前体的异种群体的形式。
56.根据权利要求55所述的组合物，其中抗原呈递细胞或前体的异种群体选自血或外 周血单核细胞。
57.根据权利要求53所述的组合物，其中抗原呈递细胞或其前体选自单核细胞、巨噬 细胞、骨髓系的细胞、B细胞、树突状细胞或朗格汉斯细胞。
58.根据权利要求53所述的组合物，其中抗原呈递细胞或其前体是抗原呈递细胞或其 前体的非培养群体的形式。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中群体是同种的。
60.根据权利要求58所述的组合物，其中群体是异种的。
61.根据权利要求60所述的组合物，其中群体选自全血、新鲜血或其组分、外周血单核 细胞、全血的棕黄层组分、沉积的红细胞、经辐射的血、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、中 性粒细胞、淋巴细胞、天然杀伤细胞或天然杀伤T细胞。
62.根据权利要求58所述的组合物，其中群体未经历激活条件。
63.根据权利要求51所述的组合物，不包括在其表面呈递包含对应于非Gag多肽部分 的氨基酸序列的肽的抗原呈递细胞。
64.根据权利要求50所述的组合物，不包括包含对应于非Gag慢病毒多肽一部分的氨 基酸序列的肽。
65.根据权利要求39或权利要求50所述的组合物在治疗或预防选自慢病毒感染或获 得性免疫缺陷疾病的状况中的用途。
66.根据权利要求39或权利要求50所述的组合物在制备用于治疗或预防选自慢病毒 感染或获得性免疫缺陷疾病的状况的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了基本上由Gag多肽或其至少一部分，和可选的抗原呈递细胞或其前体组成的组合物，用于治疗或预防慢性病毒感染，包括治疗或预防相关的获得性免疫缺陷疾病。在一些具体实施方式
中，所述组合物基本上由源自单一Gag多肽或源自不同Gag多肽的多个重叠的和/或不重叠的肽组成。
文档编号A61P37/00GK101951931SQ200880125009
公开日2011年1月19日 申请日期2008年1月16日 优先权日2008年1月16日
发明者R·德罗斯, S·肯特, V·伯特 申请人:欧宝治疗私人有限公司