免疫调节的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一般地设及预防性或治疗性疫苗领域。具体地，本发明设及通过抑制对花 生过敏的变态反应来治疗花生过敏的疫苗。
【背景技术】
[0002] 原理上，过敏疾病是与TJ和町2淋己细胞亚群失调相关的免疫系统病症（de 化iesetal. 1999,Parronchietal. 1999,Sin曲etal. 1999)。据推测，由于接种疫苗、 使用抗生素和其他公共卫生实施导致感染性疾病的发病率下降，TJ免疫激发的主要来源 已经失去，结果是针对环境变应原的町2偏向的免疫应答增加出olgate1999,化址eenet al. 1996]〇
[0003] 影响普通人群的各种过敏性疾病中，花生诱导的过敏反应是特别严重的并代表急 诊入院治疗的过敏反应的最常见因素。
[0004] 对花生的过敏源自针对其他无害环境抗原的异常免疫应答。花生过敏和变态反应 都围绕2型免疫应答，其特征在于产生Th2T细胞和分泌I姐抗体的B细胞。与此相反，1型 免疫应答特征在于IgG(在小鼠中为IgG2a同种型）为主的抗体、NK细胞和吞隧细胞的活 化、W及细胞毒性T淋己细胞（CTL)的进展。1型和2型应答都由辅助T细胞进行协调，辅 助T细胞分化为几个功能上不同的亚群，包括TJ和町2淋己细胞。运些亚群通过其细胞因 子分泌谱进行表征[Mosmann等人，1989]，其中TJ细胞产生IFN- 丫W及町2细胞通常分泌 比-4、比-5和比-13。
[0005] 口服摄入花生变应原首先遇到肠道粘膜免疫系统。微權（M)细胞是专口的滤 泡相关细胞，其排列在胃肠道的上皮并位于非常靠近淋己集结处。它们负责诱导致耐受 (tolerising)和/或保护性肠道相关的免疫应答。当M细胞摄取外源食物抗原然后递呈到 巨隧细胞和树突细胞值C)时，对食物变应原的过敏发生巧eLongetal. 2011]。一旦抗原 被巨隧细胞和DC内在化，所述抗原被内吞，然后变性和降解为约12-20氨基酸长的肤。运些 小肤段的小部分随后被输送至细胞内并递呈在细胞表面MHCII类分子上W与CD4+T细胞特 异性相互作用。运些活化的CD4叮细胞随后在数量上扩增并释放Th2细胞因子。町2细胞、 IL-4和IL-5促进B细胞分化，其承载化ear)与表面免疫球蛋白（Ig)受体结合的变应原， 进入分泌变应原特异的I姐抗体的细胞[Turcanu等，2010]。运些产生I姐的B细胞然后 在数量上扩增并成为持续分泌变应原特异的I姐抗体的浆细胞。暴露至花生环境导致花生 变应原与在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上包衣（coating)的特异I姐结合。随后，Fc受体交 联提供了导致嗜碱细胞和肥大细胞脱粒的有力活化刺激，其迅速释放多种预制的促炎性和 血管活性化合物，例如前列腺素、白=締、丝氨酸蛋白酶、组胺和细胞因子进入细胞外液W 产生炎性应答[Sichereretal. 2010]，所有运些最终导致急性过敏反应的临床表现[Long 2002]〇
[0006] 花生过敏的局部症状包括腹痛、呕吐、腹部绞痛和腹泻，甚至轻度花生过敏的情况 下也很常见。运种急性非危及生命的反应引起肠通透性的短暂增加，其随后允许大分子如 整个花生变应原全身分布，运加剧针对随后暴露至花生变应原的过敏反应，会导致危及生 命的过敏反应[Sandersonetal. 1993]。
[0007] 与针对草花粉、尘蛾和蜜蜂整毒液的过敏反应的传统免疫治疗不同，皮下脱敏注 射花生提取物具有不可接受的风险收益阳ppenheimeretal. 1992]。因此，目前避免花生 为预防进一步反应的唯一可行方法。然而，严格避免对许多个体而言通常是不现实的策略， 特别是考虑到意外暴露到花生，运经常发生于摄入与含有花生的地方相同的地点（例如， 饭店、学校、食品店和工作食堂）所制备的加工食物或食物。因此，仍然需要一种有效的治 疗性策略治疗和预防花生过敏。
【发明内容】
[0008] 在本发明的一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融合 蛋白包含（：0 选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6 和arah7W 及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，W及（ii) 增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0009] 在本发明的一个方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（i)选自曰r曰h1、曰r曰h2、曰r曰h3、曰r曰h4、曰r曰h5、曰r曰h6、曰r曰h7、曰r曰 h8、arah9、arah10和arah11W及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部 分的至少两个花生变应原，W及（ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0010] 在本发明的又一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（：0 选自arahKarah2、arah3、arah4、arah5、arah6 和arah7W 及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部分的至少=个花生变应原，W及（ii) 增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0011] 在本发明的再一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（i)选自曰r曰h1、曰r曰h2、曰r曰h3、曰r曰h4、曰r曰h5、曰r曰h6、曰r曰h7、曰r曰 h8、arah9、arah10和arah11W及与其具有至少70%序列同一'性的其衍生物或部分 的至少=个花生变应原，W及（ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0012] 在本发明的另一方面，提供了本文公开的痘病毒载体在治疗花生过敏症中的用 途、或在制备用于治疗花生过敏症的药物中的用途。
[0013] 在本发明的又一个方面，提供诱导受试者或患者中耐受或抑制受试者或患者中过 敏反应的方法，所述方法包括持续一段时间并且在足W引发抑制/耐受的条件下，向受试 者或患者施用有效量的本文所公开的痘病毒载体。
[0014] 在本发明的另一方面，提供向受试者接种疫苗W诱导对花生变应原耐受的方法， 包括施用本文所公开的痘病毒载体。
[0015] 在本发明的另一方面，提供包含本文所公开的痘病毒载体的试剂盒。
[0016]W上概述不是或不应W任何方式视为穷举本发明的所有实施方式。
【附图说明】
[0017]图1显示根据本发明的实施方式的包括蛋白酶体降解标签和多个花生变应原的 PHAV抗原排列（arrangement)(图1A和B)，W及根据本发明的实施方式没有蛋白酶体降解 标签的PHAV抗原排列（图1C)。
[001引图2显示UBc.PHAV表达盒的核酸序列。
[0019] 图3显示没有泛素序列的PHAVag构建体表达盒的核酸序列。
[0020] 图4是PHAV表达盒通过同源重组插入到牛痘病毒哥本哈根（Copenhagen)株A39R 0RF的不意图。
[0021] 图5列出在图4中示意表示的同源重组盒的特征。
[002引图6显示UBc.PHAV同源重组盒的核酸序列。
[0023] 图7显示PHAV同源重组盒的核酸序列。
[0024] 图8是pTCll(UBc.PHAV)和pTC12(PHAV)的示意图。质粒示于图8。
[0025] 图9是在细胞内蛋白酶体降解通路的示意图。
[0026] 图10显示在使用空载体（SCV000)或UBc.PHAV载体（SCV201C)接种疫苗之前和 之后（接种疫苗后17天），花生蛋白特异性血清I姐抗体的水平（图10A)和IgG2a抗体的 水平（图 10B) P<0. 05。
[0027] 图11显示通过从SCV000和SCV201C接种疫苗小鼠的脾脏获得的培养的淋己细胞 分泌的IFN-丫（IFN-g;V细胞因子；图11A)、比-4化2细胞因子；图11B)和比5〇；2细胞 因子；图11C)的水平。
【具体实施方式】
[0028] 在本说明书中参考的任何现有技术不是、W及不应当视为承认或W任何形式说明 运种现有技术形成任何国家中公知常识的一部分。
[0029] 在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语"包括"、"包含"和"含有"将被理 解为表示包括所述步骤或者要素（element)或者步骤或要素的组，但不排除任何其它步骤 或者要素或者步骤或要素的组。因此，使用术语"包括"之类表示所列要素是必须的或强制 性（mandato巧）的，但其它要素是任选的并且可有可无的。"由...组成"是指包括并限于 短语"由...组成"之后的。因此，短语"由......组成"表示所列要素是必须的或强制性 的，并且没有任何其他要素可存在。"基本上由...组成"是指包括短语后列出的任何要素， 并且限于不干扰或促进在本公开的所列要素中指定的活性或作用的其它元件。因此，"基本 上由...组成"一语表示所列要素是必须的或强制性的，但其它要素是任选的，W及取决于 其是否影响所列要素的活性或作用而可有可无。
[0030] 除非上下文另有明确说明，本文所使用的单数形式"一"、"一个"和"该"包括复数 方面。因此，例如，提及"一种组合物"包括单一组合物，W及两种或两种W上的组合物；提 及"一种试剂"包括一种试剂，W及两种或更多种剂；提及"本发明"包括本发明的单个或多 个方面；等等。
[0031] 除非另有限制，本文使用的所有技术和科学术语具有对本发明所属领域普通技术 人员通常理解的相同的含义。与本文所描述的那些类似或等同的任何的材料和方法可用于 实践或测试本发明。
[0032] 本说明书使得疫苗方法能够开发用于治疗或预防花生过敏症的治疗剂。具体地， 本说明书使得试剂能够在主要花生变应原的情况下提供治疗，例如，最普遍的或麻烦的花 生变应原的至少一个、至少两个、至少=个，等等。
[0033] 本发明基于本发明人出人意料发现：一种DM疫苗，其包含可操作编码融合蛋白 的核酸构建体，所述融合蛋白包含连接蛋白酶体降解标签（如泛素）的花生变应原（如ara h1)，该DM疫苗能够在偏向TJ表型的受试者中诱导免疫应答，从而导致分泌花生变应原 特异的IgG抗体，而不是花生变应原特异的I姐抗体，该I姐抗体将有利于暴露至花生变应 原时的过敏反应。
[0034] 因此，在本发明的一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述 融合蛋白包含（：0 选自arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6 和arah 7、W及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，W及 (ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0035] 在本发明的另一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（i)选自曰r曰h1、曰r曰h2、曰r曰h3、曰r曰h4、曰r曰h5、曰r曰h6、曰r曰h7、曰r曰 h8、arah9、arah10和arah11W及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部 分的至少两个花生变应原，W及（ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0036] 在本发明的又一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（：0 选自arahKarah2、arah3、arah4、arah5、arah6 和arah7W 及与其具有至少70%的序列同一性的其衍生物或部分的至少=个花生变应原，W及（ii) 增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0037] 在本发明的再一方面，提供含有编码融合蛋白的核酸序列的痘病毒载体，所述融 合蛋白包含（i)选自曰r曰h1、曰r曰h2、曰r曰h3、曰r曰h4、曰r曰h5、曰r曰h6、曰r曰h7、曰r曰 h8、arah9、arah10和arah11W及与其具有至少70%序列同一性的其衍生物或部分 的至少=个花生变应原，W及（ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0038] 在本发明的又一方面，提供在受试者的细胞表达融合蛋白的痘病毒载体，所述融 合蛋白包括（i)选自W下的花生变应原：（a)来自arah 1、arah 2、arah 3、arah 4、 arah 5、arah 6和arah 7,或者与其具有至少70%序列同一'性的其衍生物或部分的至 少两个花生变应原，或者化）来自arah Karah 2、arah 3、arah 4、arah 5、arah 6 和arah 7,或者与其具有至少70%序列同一性的其衍生物或部分的至少=个花生变应原； W及（ii)增强融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0039] 在本发明的又一方面，提供在受试者的细胞表达融合蛋白的痘病毒载体，所述融 合蛋白包括（i)选自W下的花生变应原：（曰）来自ara hKara h2、ara h3、ara h4、ara h5、ara h6、ara h7、ara h8、ara h9、ara h10 和ara h11，或者与其具有至少 70% 序列同一'性的其衍生物或部分的至少两个花生变应原，或者化）来自ara hKara h2、ara h 3、曰r曰h 4、曰r曰h 5、曰r曰h 6、曰r曰h 7、曰r曰h 8、曰r曰h 9、曰r曰h 10和曰r曰h 11，或者 与其具有至少70%序列同一性的其衍生物或部分的至少=个花生变应原；W及（ii)增强 融合蛋白的细胞内降解的蛋白酶体降解标签。
[0040] 花生变应原
[0041] 花生变应原是本领域技术人员已知的，其包括花生（Arachishypogaea)物种的任 何肤，受试者可能通过例如，接触、吸入、摄入、注射等暴露至所述花生（ArachiShypogaea) 物种。在一个实施方式中，至少两个花生变应原选自arahKarah2、arah3、arah4、 arah5、arah6和arah7。在另一个实施方式中，至少两个花生变应原选自arah1、 arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10 孝口arahll〇
[0042] 所述融合蛋白可包括任何两种或更多种花生变应原arah1至arah11。例 如，所述融合蛋白可包括下花生变应原：
[0043] ( i )过r过h h h h h h h h 8、 arah9、arah10 和arah11 ;
[0044]ii)过r过h1、过r过h2、过r过h3、过r过h4、过r过h5、过r过h6、过r过h7、过r过h8、 arah9 和arah10 ;
[0045] 过r过h1、过r过h2、过r过h3、过r过h4、过r过h5、过r过h6、过r过h7、过r过h8 和arah9 ;
[0046]Uv)过r过h1、过r过h2、过r过h3、过r过h4、过r过h5、过r过h6、过r过h7孝口过r过h 8 ；
[0047] (^v)过r过h1、过r过h2、过r过h3、过r过h4、过r过h5、过r过h6孝口过r过h7;
[004引（vi)arah1、arah2、arah3、arah4、arah5 和arah6 ;
[0049] (vii)arah1、arah2、arah3、arah4 和arah5 ;
[0050] (viii)arah1、arah2、arah 3 和 arah 4 ;
[0051] (ix)arah1、arah2、arah 3 和 arah 6 ;
[0052] (X)arah1、arah2 和arah3 ;
[0053](x;L) arah 1和arah 2;
[0054] (xi;L)arah1 和arah3 ;
[0055] (xiii)arah1 和arah4 ;
[0056] (xiv)arah1 和arah5 ;
[0057] (XV)arah1 和arah6 ;
[0058] (xv;L)arah 1和arah 7;
[0059] (xvi;L)arah1 和arah8 ;
[0060] (xvii;L)arah 1和arah 9;
[0061] (xix) arah 1和arah 10;
[006引（XX)arah 1和arah 11;
[006引（xx;L)arah2 和arah3 ;
[0064](xxi;L)arah2 和arah4 ;等等D
[0065] 通过采用蛋白酶体降解标签（例如，泛素）为融合蛋白的组份，合成的融合蛋白靴 向蛋白酶体降解，导致产生小版片段，所述小版片段进入内质网巧R)在那里其与MHCI类 蛋白复合然后转运到细胞表面递呈给T淋己细胞。结果是，具有MHCI类的蛋白片段的递 呈增强。因此，本领域技术人员将明白，当核酸序列编码包含两个或更多个花生变应原的融 合蛋白，所述两个或更多个花生变应原可任何特定顺序出现在融合蛋白中，因为所表 达的融合蛋白将经蛋白酶体降解。
[0066] 本领域的技术人员将理解，在花生变应原的选择可能取决于特定的治疗性和/或 预防性应用。例如，当疫苗用于在对花生变应原Arahi过敏的受试者中诱导耐受时，则融 合蛋白将需要包含Arahi;当疫苗用于在对花生变应原arah2过敏的受试者中诱导耐受 时，则融合蛋白将需要包含arah2;当疫苗用于在对花生变应原arah1和arah2过敏 的受试者中诱导耐受时，则融合蛋白将需要包含arah1和arah2;等等。
[0067] 在一个实施方式中，花生变应原选自：ar址1克隆P41B(GenBank登录号L34402 或Swiss-Prot:P43238. 1);arah1 克隆P17(GenBank登录号L38853);arah2 cDNA(GenBank登录号L7797或UniProt邸/hEMBL:Q8GV20);arah3cDNA(GenBank登录号 AF093541 或AC册 1862);arah4cDNA(GenBank登录号AF086821);arah5cDNA(GenBank 登录号AF059616);arah6cDNA(GenBank登录号AF092846 或UniProt邸/TrEMBL: Q647G9)，arah7cDNA(GenBank登录号AF091737)、arah8(GenBank登录号AY328088， EF436550)、arah9(GenBank登录号抓159429，EU161278)、arahl0(AY722694，AY722695) 和arah11 09097716)。
[0068] 在一个实施方式中，融合蛋白包括至少四种花生变应原，更优选影响花生过敏个 体的最常见花生变应原中的至少四种。在一个实施方式中，融合蛋白包括花生变应原arah 1、arah2、arah3 和arah6。
[0069] 如本文所用，术语"花生变应原"，其包括特异性实例例如arah1、arah2等等， 可W理解为还包括其同源物或变体。术语"同源物"，如本文所用的指本文所述的核酸序列 或多肤的同源物（包括，例如，SEQIDNO: 1-12中的任一项），应理解为包括，例如，本文所