专利名称：具有免疫调节作用的发酵组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有经乳酸菌发酵后的海带并具有免疫调节作用的组合物，更具体地说，涉及具有免疫赋活作用的组合物及/或具有抗变态反应作用的组合物。此外，本发明还涉及含有经乳酸菌发酵后的海带、经乳酸菌发酵后的芝麻和经乳酸菌发酵后的大豆并具有免疫调节作用的组合物。
背景技术：
近年来，与变态反应相关的问题正急剧地显现出来。变态反应有各种各样的疾病，众所周知，以花粉症为首，异位性皮炎、食物过敏症、过敏性鼻炎、过敏性哮喘等的患者人数尤其多，并且有报道花粉症患者的人数正飞跃地上升。面临这样的现状，以医药品制造商为中心，人们进行了以克服变态反应为目的的研究，研制出了许多产品。其代表性的产品有抗变态反应制剂、抗组胺制剂等，但这些药物制剂以作用于变态反应发生机制末端被称作肥大细胞的粒细胞的炎症性物质的释放和受体等为特征，暂时缓和症状，但对变态反应发生的根源没有影响。此外，对于症状特别严重的患者有时给予类固醇制剂等，但此类药物制剂的副作用成为问题。在这样的情况下，人们热切希望根本上治疗及预防变态反应的方法。另一方面，日本正迎来老龄化社会，以年龄增加导致免疫力低下为起因的高龄者感染症的死亡人数正在增加。此外，众所周知，在忙碌的现代社会以及在紧张和充满压力的环境中生活，免疫力会下降，人们渴望有相应的对策。
为了解决上述问题，急需研制一种安全的经口摄取组合物，该组合物作为通过提高免疫调节功能来增强免疫力从而可以防止感染症或可以预防或治疗变态反应的手段，其由身边的食品材料制造得到，长期发挥平稳的免疫调节作用，可以维持生活在紧张和充满压力环境中人们的健康。
在日本，自古以来就有食用海藻的习惯，特别是海带，被认为是增强体质和增进健康的食品、长寿食品，而且是素斋中也含有的传统食物材料。海藻富含人们容易缺乏的钙、钠、镁、磷、铁、碘等矿物质、各种维生素、褐藻多糖(fucoidan)等食物纤维，而且证实海藻具有免疫调节作用。此外，关于乳酸发酵食品，随着科学知识的积累，食用乳酸发酵食品有益健康的认识越来越高，多种乳酸菌及乳酸发酵食品的免疫调节作用也日趋明了。可是，无论是海藻还是乳酸发酵食品，单独来说均不具备充分的免疫调节作用。因此，同时具有上述两个要素的海藻乳酸发酵材料被认为是一种能提高健康机能的富有魅力的材料。但是，在海带等海藻中缺少发酵菌株植入、生长所必需的营养成分。而且，其培养需要花费许多时间、劳力和费用。因此，对海藻发酵食品及其生理活性的研究不是很充分。
关于海藻发酵物，专利文献1公开了一种海藻发酵食品，该食品通过以下的方法得到为使海藻糖化即提供作为发酵底物的糖类，用纤维素酶等分解处理海藻类，单细胞化，然后用乳酸菌及/或酵母进行发酵。根据上述文献的记载，用该方法发酵了真海带及裙带菜，而且用该方法制造的海藻发酵食品具体为在裙带菜中加入纤维素酶及接种三种菌种(一种乳酸菌Lactobacillus brevis NRIFS B5201株和两种酵母Debaryomyces hansenii NRIFSY5201株及Candida zeylanoides NRIFSY5206株)进行发酵后制得的食品具有降低血中中性脂肪的作用及降低肝脏脂肪的作用。
此外，专利文献2公开了一种摄取简便、营养好、吸收好、美味的食品，该食品是通过在大豆及海带的混合物中加入根霉属菌类进行发酵后再与未发酵芝麻混合而制得的发酵食品。
日本特开2003-201号公报 日本特许第2846547号发明内容本发明的目的在于利用身边的食品材料，通过赋予身边的食品材料免疫调节功能或提高该材料的免疫调节功能，从而提供安全性高且具有良好的免疫调节作用的组合物。
本发明人等利用植物性乳酸菌对通常被认为很难发酵的海带进行发酵，并成功地获得了海带的乳酸菌发酵物。接着，本发明人等对该海带乳酸菌发酵物经口摄取后的生理活性进行了反复研究，结果发现与摄取海带单体及/或乳酸菌单体相比，该发酵物的免疫调节作用(免疫赋活作用、调整免疫平衡的作用)显著提高。此外，本发明人等在开发能更高效地发挥该海带乳酸菌发酵物免疫调节功能的且营养价值高的食品材料上进行了潜心研究，结果惊奇地发现当含有经乳酸菌发酵后的海带和经乳酸菌发酵后的芝麻及经乳酸菌发酵后的大豆的组合的组合物经口摄取后，显示出了预料之外的高免疫赋活作用、抗变态反应作用等免疫调节作用。还证实了与单独摄取乳酸菌、单独摄取未发酵的发酵原料时的作用相比，该免疫调节作用更显著。而且，本发明的组合物加热灭菌后，该免疫调节作用仍然维持。
基于这些另人惊奇的发现，完成了本发明。
本发明为1.含有经乳酸菌发酵后的海带并具有免疫调节作用的组合物；2.在1中所述的组合物，其中，免疫调节作用是免疫赋活作用及/或抗变态反应作用；3.在1或2中所述的组合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌；4.在1～3任意一项中所述的组合物，作为一次摄取量，其含有5mg或5mg以上的经乳酸菌发酵后的海带；5.含有经乳酸菌发酵后的海带和经乳酸菌发酵后的芝麻和经乳酸菌发酵后的大豆的组合物；
6.在5中所述的组合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌；7.在5或6中所述的组合物，其具有免疫调节作用；8.在7中所述的组合物，其中，免疫调节作用是免疫赋活作用及/或抗变态反应作用；9.在5～9任意一项中所述的组合物，作为一次摄取量，其含有的经乳酸菌发酵后的海带和经乳酸菌发酵后的芝麻和经乳酸菌发酵后的大豆合计为1～10000mg，优选10～10000mg；10.在1～9任意一项中所述的组合物，其是饮食物、食品添加物、健康食品或医药组合物；11.在1～10任意一项中所述的组合物，其形态为丸剂；12.标示了含有经乳酸菌发酵后的海带作为有效成分且具有免疫调节作用的饮食物。
具体实施例方式
乳酸菌发酵海带本发明中所述的海带指的是褐藻类海带科海带属(Laminaria spp.)及其近缘种的总称，例如包括真海带(L.japonica)、利尻海带(L.japonica var.ochotensis)、狭叶海带(L.angustata)、长海带(L.angustata var.longissima)、皱海带(L.religiosa)、双裂海带(Arthrothamnus bifidus)、圆切氏海带(Kjellmaniella gyrata)、萱藻(Kjellmaniella crassifolia)，但不限于这些。
作为本发明经乳酸菌发酵后的海带(乳酸菌发酵海带)的海带原料，采用的是上述海带的原藻或其去除了沙子等异物后的干燥品。从容易发酵的角度出发，优选使用切断或粉末化后的海带，也可以使用用盐、糖、氨基酸、有机酸、核酸等调味的海带。上述海带一般在市场上有售，例如商品名“海带粉”(日本烧津水产化学工业株式会社)、商品名“海带粉”(日本有限会社惣万水产)等。
对用来发酵海带原料的乳酸菌没有特殊限制，只要是能使海带发酵的乳酸菌即可，可以使用按照通常的方法冷冻干燥制备的乳酸菌或冷藏保存的乳酸菌。作为乳酸菌，可以列举如乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptcoccus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、明串球菌属(Leuconostoc)等，从中选择一种或两种或两种以上的乳酸菌，可以同时使用或逐次使用。其中，优选分离得到的利用植物成分生存的乳酸菌(植物性乳酸菌)，因为该乳酸菌在海带等营养不丰富的植物性原料中也可以发酵，且耐酸、耐碱、在高浓度食盐的存在下也可以生存繁殖因而易于在食品中利用，而且该乳酸菌在对人有用的肠道系统中有耐性等。作为上述植物性乳酸菌，可列举植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜盐片球菌(Tetragenococcushalophilus)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。另外，本申请人从紫苏腌茄子中分离出具有免疫调节作用的多种植物性乳酸菌(参照日本特开2005-333919号公报)。在本发明中，也可以优选使用这些乳酸菌。
此外，本发明的乳酸菌可以使用同型乳酸发酵和异型乳酸发酵中任何一种发酵类型的乳酸菌，还可以利用在异型乳酸发酵中产生的醋酸、二氧化碳、乙醇等来赋予香味，但当二氧化碳大量产生时，使用发酵罐等的制造工序的操作性有时会变差。另一方面，同型乳酸发酵因为生成大量乳酸，所以在发酵过程中因来自海带的腐败菌等的影响而腐败的危险性小，适合在本发明中使用。
本发明的乳酸菌发酵海带，通常在海带原料中加水，接种上述乳酸菌进行发酵，然后加热或照射(优选加热)，对发酵物进行杀菌。对上述杀菌后的发酵物进行过滤或离心分离(优选过滤)，除去大部分已死灭的菌类，从而可以得到乳酸菌发酵海带。
将要进行发酵时，优选预先进行灭菌处理。只要设定适宜的灭菌处理温度及时间即可，例如，保持在90℃下灭菌处理10分钟。此外，海带发酵时，有时海带的多糖类会使发酵液粘度明显增加，因此加入藻酸裂解酶等酶，可以提高操作性。
通过在上述灭菌处理物中加入包含乳酸菌的起子(starter)进行发酵处理。此时，作为发酵促进添加物，优选添加葡萄糖之类的糖类、大豆蛋白之类的氮源等。根据所使用的乳酸菌的性质，设定适宜的发酵处理温度及时间即可。通过测定发酵处理物的pH值，可以判断发酵程度，本发明的乳酸菌发酵海带的发酵，最好进行到pH值变为5.0或5.0以下为止。
按上述方法得到的乳酸菌发酵海带，可以是以液体状原状使用，但从操作性和保存性的角度出发，优选通过喷雾干燥或冷冻干燥将其粉末化。
乳酸菌发酵芝麻大豆海带(经乳酸菌发酵后的海带、芝麻及大豆)本发明的特征在于通过在上述乳酸菌发酵海带中再配合经乳酸菌发酵后的芝麻和经乳酸菌发酵后的大豆，从而增强免疫调节作用。
本发明中所述的芝麻指的是Sesamun indicum的植物的种子，例如包含白芝麻、黑芝麻、黄芝麻、茶色芝麻等，但不限于这些。此外，这些芝麻可以单独使用，也可以多种混合使用。作为本发明的经乳酸菌发酵后的芝麻(乳酸菌发酵芝麻)的芝麻原料，其形态不受限制，可以是粒状、粉碎物、糊状物(paste)等任何一种形态，但从容易发酵的角度出发，优选使用芝麻的粉碎物或糊状物。市场上销售许多芝麻的糊状物，例如商品名“纯黑芝麻酱”(日本竹本油脂株式会社)等。另外，以得到脂肪含量少的乳酸菌发酵芝麻为目的时，可以使用脱脂芝麻作为原料，但从芝麻所具有的营养价值和功能上考虑，优选使用未脱脂的含有油分的芝麻。
本发明中所述的大豆指的是Glycine max的植物的种子，其根据生长期、产地的不同，包含多种不同的品种。在本发明中没有特殊限制，可以使用任何一种品种。作为本发明的经乳酸菌发酵后的大豆(乳酸菌发酵大豆)的大豆原料，可以使用固形大豆、大豆粉、大豆饼(soybeanoil cake)、脱脂大豆、熟豆粉以及它们的水解产物等任何一种，没有特殊限制，但从容易发酵的角度出发，优选使用粉末化后的大豆。上述大豆粉在市场上有售，例如商品名“熟黑豆粉”(日本小林桂株式会社)、商品名“プロライフJ”(日本理研农产化工株式会社)等。另外，以得到脂肪含量少的乳酸菌发酵大豆为目的时，可以使用脱脂大豆。
本发明涉及含有乳酸菌发酵海带和乳酸菌发酵芝麻和乳酸菌发酵大豆的组合物(在本说明书中，也称为“乳酸菌发酵芝麻大豆海带”、“发酵芝麻大豆海带”)。该组合物可以通过先对海带、芝麻及大豆原料分别进行乳酸菌发酵再混合制得，也可以通过先混合原料海带、芝麻及大豆再接种乳酸菌来制备。
另行发酵后再混合来制备时，即混合乳酸菌发酵海带、乳酸菌发酵芝麻及乳酸菌发酵大豆时，作为乳酸菌发酵海带，可以优选使用通过上述制造方法等制备的乳酸菌发酵海带。作为乳酸菌发酵芝麻，可以使用与上述乳酸菌发酵海带同样制备的乳酸菌发酵芝麻、日本特开2004-173692号公报中记载的乳酸菌发酵芝麻等。作为乳酸菌发酵大豆，可以使用与上述乳酸菌发酵海带同样制备的乳酸菌发酵大豆、日本特开2003-335695号公报中记载的乳酸菌发酵大豆等。
以下述方法为例，可以说明原料海带、芝麻及大豆混合后再接种乳酸菌来制备的方法，但不限于此。
首先，准备作为发酵原料的海带、大豆、芝麻。根据情况将这些原料加工成粉末或糊状。或者，也可以购买市售的粉末或糊状材料作为发酵原料使用。接着，将原料海带(例如，海带粉)、大豆(例如，大豆粉)、芝麻(例如芝麻酱)按规定的比例混合，加水，进行灭菌处理。设定适宜的灭菌处理温度及时间即可，例如，在90℃下灭菌处理10分钟。然后，在得到的灭菌处理物中加入乳酸菌(例如，加入包含乳酸菌的起子等)，进行发酵处理。进行发酵处理时，作为发酵促进添加物，优选添加葡萄糖之类的糖类、大豆蛋白之类的氮源等。根据所使用的乳酸菌的性质，设定适宜的发酵处理温度及时间即可。通过测定发酵处理物的pH值，可以判断发酵程度。本发明的组合物的发酵，最好进行到pH值变为5.0或5.0以下为止。另外，在灭菌处理工序及/或发酵处理工序中，当原料混合加水物或灭菌处理物的粘度很高时，通过添加藻酸裂解酶等酶，可以降低混合物的粘度和提高操作性。
发酵结束后，进行加热杀菌，冷却，必要时进行过滤。加热杀菌的温度只要适宜地设定即可。按上述方法得到的液体状发酵组合物可以直接使用，但从操作性和保存性上考虑，优选将上述液体状发酵组合物进行喷雾干燥，制成粉末体。该粉末为茶褐色极细的粉体，其具有原料的芳香和乳酸菌的酸味。
另外，在任何一种制造方法中，所使用的乳酸菌的选择可以与乳酸菌发酵海带时一样，优选使用植物性乳酸菌。本发明人等通过采用了从紫苏腌茄子中分离的乳酸菌的预备试验发现戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)可以很好地对海带、大豆及芝麻中的任何一种进行发酵。因此，即使在植物性乳酸菌中也可以优选使用这些乳酸菌(戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)及植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))。在先混合海带、芝麻及大豆再接种乳酸菌的制造方法中，作为乳酸菌，可以使用上述戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)及植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)之类可以对海带、芝麻和大豆中的任何一种进行发酵的乳酸菌，或者，同时使用多种可以对各原料进行发酵的乳酸菌。
免疫调节作用本发明的组合物即乳酸菌发酵海带或乳酸菌发酵芝麻大豆海带的特征在于具有免疫调节作用。
免疫是指通过抵抗无数病原体、各种有害物质等来保护机体从而预防各种疾病的功能，即保持生物体稳定性的功能，当免疫功能过盛或破坏时，会引起变态反应性疾病、自身免疫性疾病等。本发明中所述的免疫调节作用指的是，当因年龄增加、紧张和压力、疲劳、睡眠不足等引起部分免疫功能破坏或免疫功能低下时激活免疫应答的作用(免疫赋活作用)，或，当免疫功能过盛时抑制免疫应答的作用(免疫抑制作用)。本发明组合物通过适宜地发挥上述免疫赋活作用和免疫抑制作用来谋求达到免疫平衡的最佳状态。
在生物体内的免疫系统中，存在识别抗原的淋巴细胞T细胞，根据所产生的细胞因子可分为Th1细胞和Th2细胞。该Th1和Th2的平衡(Th1/Th2平衡)对生物体内的免疫应答产生影响，例如，众所周知在变态反应中，当Th1占优势时，引起迟发型过敏症(如脏器移植时发生的排斥反应等IV型变态反应)，当Th2占优势时，产生抗原特异性IgE抗体，引起速发型过敏症(如哮喘、过敏性鼻炎、花粉症、异位性皮炎等I型变态反应)。因为Th1细胞产生IFN-γ，Th2细胞产生IL-4，所以可以用上述IL-4和IFN-γ的比(IFN-γ/IL-4)作为免疫平衡的指标。
本发明的组合物(乳酸菌发酵海带以及乳酸菌发酵芝麻大豆海带)的特征在于，其将生物体的Th1/Th2平衡引向Th1占优势的状态。如上所述，已知在哮喘、花粉症、异位性皮炎等I型变态反应中，Th2占优势。而且有报道在HIV感染中也是Th2占优势。还已知当Th1占优势时，促进巨噬细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞(CTL)的活性，提高抗癌能力。因此，直接摄取本发明的组合物或以食品、医药品等形态摄取，使Th1占优势，不单可以治疗和预防I型变态反应，还可以提高对HIV、癌、细菌感染等的抵抗能力，从而进行预防和治疗。
本发明组合物的特征还在于，其提高肠道免疫力。所谓的肠道免疫指的是存在于肠道黏膜面的防御系统，该防御系统将侵入肠道的病原因子从鼻子、咽喉等排除或与饮食物等一起排除。已知分布在小肠黏膜的派伊尔结发挥指挥中心的作用，派伊尔结产生的抗体(IgA)攻击以病原菌、病毒等为代表的异物。
如上所述，本发明的组合物(乳酸菌发酵海带或乳酸菌发酵芝麻大豆海带)可作为免疫调节用、免疫赋活用、免疫抑制用、或抗变态反应用的组合物，非常有用。
饮食物·医药品等本发明涉及的组合物可以作为饮食物、医药品等来使用，该组合物是通过赋予身边的营养价值高的食品材料免疫调节功能或提高其免疫调节功能而制得的组合物，其安全性高，因此优选作为可日常摄取的饮食物。用作饮食物时，适合作为具有免疫调节作用的健康食品。这里所述的健康食品包括在容器、说明书等中标示了具有免疫功能调节作用、免疫赋活作用及/或抗变态反应作用的饮食物(例如，特定保健用食品、一定条件下的特定保健用食品等功能性食品)。对于标示位置(容器或其附有的说明书等)、容器形态(瓶、罐、聚乙烯塑料瓶、塑料瓶、纸包装等)以及标示方法(印刷、刻印、封印等)没有任何限制。另外，作为食品使用的形态，还包括将本发明的组合物作为食品添加剂使用的形态。
本发明的组合物作为饮食物使用时可以直接使用，也可以与公知的主剂、辅助剂、甜味调料、酸味调料、维生素等各种成分混合后制成符合消费者口味的产品，例如，本发明的组合物可以以片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、糖衣剂(candy)、滴剂(drop)、锭剂(troch)、口香糖、果汁粉、保健营养液、调味料、加工食品、甜点类或点心类等形态提供。此外，本发明的乳酸菌发酵海带或乳酸菌发酵芝麻大豆海带具有淡淡的味道，因此可以咀嚼品尝饮食物的形态成为优选形态之一。具体来说，例如丸剂、饼干这样的形态。丸剂的油分通常调节到1％或1％以下。这是为了防止因保存中产生的油分的渗出而引起丸剂氧化劣化、丸剂间粘着等。在本发明的乳酸菌发酵芝麻大豆海带中，若使用脱脂大豆、脱脂芝麻，则丸剂的油分可以调节到1％或1％以下，但考虑到材料(特别是芝麻)的营养价值，使用脱脂材料不一定合适。不使用脱脂材料时，组合物含有4～15％左右的油分，可能会发生上述油分的渗出。本发明人等研究了可以防止该油分渗出的丸剂的制造方法，结果发现在以外形美观为目的而通常实施的素丸抛光工序中(素丸表面的抛光处理)，油分明显渗出；不进行上述素丸抛光工序，而用虫胶或糖对素丸进行包衣，可以防止油分的渗出。
本发明的饮食物以免疫功能的调节(免疫赋活、抗变态反应等)为目的也可以在人以外的动物身上使用。作为使用对象的动物，可列举狗、猫等宠物类、猪、牛等家畜类、鸡等家禽类、小鼠、豚鼠等实验动物之外，还可以是水产养殖动物等。作为饮食物的形态，可以使用其原形，也可以添加到动物或鱼贝类用的饲料(宠物食品)中来供给，或以补充料(supplement)这样的形态供给。
用作医药品时，可列举如免疫赋活制剂、抗变态反应制剂等免疫调节制剂。此外，本发明的组合物可以在主药中使用赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、包衣剂等医药制剂技术领域中通常使用的公知辅助剂，制成制剂。剂型可以是丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、坐剂、注射剂等，但并不限于这些。对给予期间没有特殊限制，可以1周～10天以上连续给予，优选长期稳定地连续给予。
本发明的组合物(乳酸菌发酵海带或乳酸菌发酵芝麻大豆海带)在本发明的饮食物或医药品中的含量没有特殊限制，一般为0.1～100重量％，优选1～90重量％，更优选1～50重量％。
由本发明的组合物形成的或者是含有本发明的组合物的食品或医药品，其一次给予量中乳酸菌发酵海带或乳酸菌发酵芝麻大豆海带的含量以干燥重量换算一般为1～10000mg，优选10～10000mg，但本发明组合物的安全性高，因此其含量实际上不存在上限。
本发明的组合物由食品材料制造，因此安全性高，可以短期或长期地日常摄取或间隔适当天数后继续摄取。因此，作为饮食物或健康食品摄取时，通过长期调节免疫功能，可以防止各种原因引起的免疫功能低下。而且，通过调节免疫功能的平衡，还可以防止对生物体产生不良影响的免疫功能的过度亢进。
此外，本发明的组合物作为医药品投与后，能够以温和的效力缓和或治愈因免疫功能低下或免疫功能过度亢进引起的各种症状。
进而，本发明的组合物还可以高效地利用海带、大豆及芝麻所具有的良好的营养价值和功能。
图1表示用S-PT84株、未发酵海带、发酵海带、发酵芝麻大豆海带处理后的小鼠的巨噬细胞IL-12产生量的测定结果。
图2表示摄取未发酵海带、发酵海带、未发酵芝麻大豆海带、发酵芝麻大豆海带后的小鼠的巨噬细胞IL-12产生量。
图3表示摄取S-PT84、未发酵海带、发酵海带后的小鼠的脾淋巴细胞NK活性。
图4表示摄取S-PT84、未发酵海带、发酵海带后的小鼠的脾淋巴细胞IFN-γ、IL-4产生量。
图5表示摄取S-PT84、未发酵海带、发酵海带后的小鼠的脾淋巴细胞Th1/Th2平衡。
图6表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾淋巴细胞NK活性的测定结果。
图7表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾细胞IL-4产生情况的测定结果。
图8表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾细胞IFN-γ产生情况的测定结果。
图9表示在应激下分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾细胞NK活性的测定结果。
图10表示在应激下分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾细胞IL-4产生情况的测定结果。
图11表示在应激下分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的脾细胞IFN-γ产生情况的测定结果。
图12表示分别经口摄取S-PT84、未发酵组合物、S-PT84+未发酵组合物、发酵组合物后的OVA致敏小鼠的总IgE浓度的测定结果。
图13表示分别经口摄取S-PT84+未发酵组合物、发酵组合物后的OVA致敏小鼠的脾细胞IL-4产生情况的测定结果。
图14表示分别经口摄取S-PT84+未发酵组合物、发酵组合物后的OVA致敏小鼠的脾细胞IFN-γ产生情况的测定结果。
图15表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的肠道腔中总IgA量的测定结果。
图16表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的派伊尔结细胞IL-4产生情况的测定结果。
图17表示分别经口摄取S-PT84、发酵组合物后的小鼠的派伊尔结细胞IFN-γ产生情况的测定结果。
图18表示分别经口摄取未发酵海带或发酵海带后的小鼠的Salcoma180肿瘤大小的测定结果。
图19表示摄取发酵粒后的人的NK活性的测定结果。
图20表示摄取发酵粒后的人的NK活性变化量。
图21表示摄取发酵粒后的人的Th1/Th2比的变化量。
实施例下面，通过列举实施例，详细地说明本发明的组合物。但是，本发明不限于实施例。
试验例1 乳酸菌发酵试验(1)研究了利用乳酸菌发酵海带的可能性。海带采用的是粉末状海带(日本烧津水产化学工业株式会社生产、商品名“海带粉”)。在粉末状海带中添加蒸馏水混合成海带∶水＝5∶95(重量比)的混合液，将该混合液在110℃下灭菌1分钟，然后用表1所示的八种乳酸菌(A～F)(参照日本特开2005-333919号公报)中的一种作为起子(starter)，以0.5％植菌。得到的混合物在37℃下发酵48小时，测定发酵前的pH值和发酵后的pH值，并测定了乳酸菌A～D发酵后的菌数。另外，表中的乳酸菌A(S-PT84)作为FERM ABP-10028被寄存在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄存中心。
发酵后的菌数以及发酵前的pH值和发酵后的pH值的结果见表2。利用八种乳酸菌中的任何一种，均可发现乳酸菌数增加及/或pH值的下降，表明乳酸菌能发酵海带。
实验例2乳酸菌发酵试验(2)研究了利用试验例1中使用的乳酸菌来发酵芝麻及大豆的可能性。芝麻采用的是竹本油脂株式会社生产的糊状芝麻(商品名“纯芝麻酱·黑”)，大豆采用的是小林桂株式会社生产的粉末状大豆(商品名“熟黑大豆粉”)。添加蒸馏水混合制成芝麻∶水＝25∶75(重量比)、大豆∶水＝15∶85(重量比)，与试验例1同样，进行灭菌、发酵处理，测定发酵前的pH值和发酵后的pH值，测定发酵后的菌数。另外，在测定发酵后的菌数时，芝麻测定了八种乳酸菌发酵后的菌数，而大豆测定了乳酸菌A～D发酵后的菌数。
发酵后的菌数以及发酵前的pH值和发酵后的pH值的结果见表3。使用八种乳酸菌中的任何一种，均可发现乳酸菌数增加及/或pH值的下降，表明乳酸菌能发酵芝麻及大豆。
实施例1海带的乳酸菌发酵物的制备海带采用的是烧津水产化学工业株式会社生产的粉末状海带(商品名“海带粉”)(以下称为“未发酵海带”)。在未发酵海带中添加分散了藻酸裂解酶(Nagasechemtex公司生产)的灭菌水，在90℃下加热灭菌20分钟。作为起子(starter)，采用的是将乳酸菌(Lactobacillus.Pentosus S-PT84株)在2％葡萄糖、1％酵母提取物(日本三菱化学食品株式会社)、1％大豆蛋白(日本不二制油株式会社生产)的营养条件下培养20小时而得到的生产用起子(bulk starter)。将该起子添加到进行了灭菌处理的海带混合液中，在温度约为37℃下，进行了约14小时的发酵。发酵结束后，将发酵液在90℃下加热杀菌10分钟，冷却，用20目过滤网过滤，得到的滤液用喷雾干燥机(日本Buchi株式会社制造，Minispray Dryer B-290型)进行干燥，得到海带的乳酸菌发酵组合物(以下将其称为“发酵海带”)。
实施例2芝麻·大豆·海带混合物(芝麻大豆海带)的乳酸菌发酵物的制备芝麻采用的是竹本油脂株式会社生产的“纯芝麻酱·黑”，大豆采用的是小林桂株式会社的“熟黑大豆粉”，海带采用的是与实施例1同样的经藻酸裂解酶(Nagasechemtex公司生产)处理的烧津水产化学工业株式会社生产的“海带粉”。将芝麻、大豆及海带混合成芝麻∶大豆∶海带为1∶3∶1(重量比)的混合物(以下称为“未发酵芝麻大豆海带”或“未发酵组合物”)，作为发酵促进添加物，在该混合物中添加黑砂糖(与芝麻的重量比为1/3)、大豆蛋白(与芝麻的重量比为1/15)。该芝麻·大豆·海带混合物与实施例1同样地发酵后，将发酵物在90℃下加热杀菌10分钟，冷却，用20目过滤网过滤，得到的滤液用喷雾干燥机(日本Buchi株式会社制造，Minispray Dryer B-290型)进行干燥，制得芝麻·大豆·海带混合物的乳酸菌发酵组合物(以下称为“发酵芝麻大豆海带”或“发酵组合物”)。
实施例3对巨噬细胞产生IL-12的促进作用(In vitro试验)给C57BL/6小鼠(7周龄、雄性、10只、清水实验材料)的腹腔内以每只5mL给予PBS(Phosphate-Buffer Salines)，无菌回收腹腔内细胞。将回收的细胞用细胞培养用培养基洗涤(含有10％FBS(胎牛血清)的RPMI1640培养基(日本日水制药株式会社))，用溶血缓冲液溶血除去红细胞。即，在回收的细胞中加入1mL溶血缓冲液(155mM NH4Cl、10mMKHCO3、0.1mM EDTA)，在室温下，静置2～3分钟，加入9mL细胞培养用培养基。搅拌后，离心分离(20℃、1500rpm、3分钟)，沉淀物用细胞培养用培养基洗涤一次。用血细胞计算板计测细胞数，用细胞培养用培养基将浓度调制成1×106cells/mL，以每孔500μL种入48孔培养板内(组织培养板)。将其在5％CO2、37℃下培养3小时后，通过除去培养基除去非贴壁细胞，再次添加细胞培养用培养基。
称取一定量实施例1及2中得到的未发酵海带、发酵海带以及发酵芝麻大豆海带，在乳钵中粉碎，悬浮在细胞培养用培养基中(未发酵海带悬浮液、发酵海带悬浮液、发酵芝麻大豆海带悬浮液)，作为样品。将这些样品以最终浓度分别为1μg/mL及10μg/mL添加到上述细胞板上，在5％CO2、37℃下培养18小时。作为比较，将S-PT84(干燥死菌)悬浮在细胞培养用培养基中制成的悬浮液，以最终浓度为1.5ng/mL及15ng/mL添加，在5％CO2、37℃下培养18小时。另外，S-PT84株的最终浓度是与1μg/mL及10μg/mL发酵芝麻大豆海带悬浮液中S-PT84株的量相当的浓度。培养上清中含有的细胞因子的量(白细胞介素12；IL-12)用ELISA试剂盒(OptEIA、BD Pharmingen公司)测定。此外，以没有添加任何物质的培养液作为对照(Cont)，按同样的方法进行测定。
培养上清中IL-12浓度的试验结果(N＝2的平均值)见图1。结果发现未发酵海带、发酵海带、发酵芝麻大豆海带的高浓度添加使培养液中IL-12浓度上升。还提示添加发酵海带比添加未发酵海带时，IL-12浓度增加，而且添加发酵芝麻大豆海带比添加发酵海带时，IL-12浓度增加。以上的结果表明，发酵海带的免疫赋活作用比未发酵海带强，而发酵芝麻大豆海带的免疫赋活作用比发酵海带强。
实施例4对巨噬细胞产生IL-12的促进作用(Ex vivo试验)将C57BL/6小鼠(7周龄、雄性、15只)分成平均体重大致相同的5组，每组3只。组的构成为无处置组(Control)、未发酵海带给予组(10mg/小鼠)、发酵海带给予组(10mg/小鼠)、未发酵芝麻大豆海带给予组(10mg/小鼠)、发酵芝麻大豆海带给予组(10mg/小鼠)。除Control外，各给予组分别以0.5mL每只的量腹腔内给予悬浮液，上述悬浮液为在实施例1及2中得到的未发酵海带、发酵海带、未发酵芝麻大豆海带及发酵芝麻大豆海带中添加PBS而制成的浓度为20mg/mL的悬浮液。给予18小时后，腹腔内给予5mL的PBS，无菌回收腹腔内细胞。回收的细胞用细胞培养用培养基洗涤，按照实施例3的方法，用溶血缓冲液除去红细胞。用血细胞计算板计测细胞数，用细胞培养用培养基将浓度调制成2×106cells/mL，以每孔500μL种入48孔培养板(组织培养板)内。将其在5％CO2、37℃下培养3小时后，除去非贴壁细胞，添加LPS(Lipopolysaccharide)使最终浓度成为100ng/mL，在5％CO2、37℃下培养24小时。培养上清中含有的IL-12量用ELISA试剂盒(OptEIA、BDPharmingen公司)测定。
培养上清中IL-12浓度的测定结果(N＝2～3的平均值)见图2。此结果表明，在未发酵海带给予组及未发酵芝麻大豆海带给予组中没有发现IL-12浓度增加，而在发酵海带给予组及发酵芝麻大豆海带给予组中IL-12的产生大大增加，尤其在发酵芝麻大豆海带给予组中IL-12的产生量显著上升。以上的结果表明，未发酵海带、未发酵芝麻大豆海带没有增强LPS刺激引起的巨嗜细胞活化的效应，而发酵海带、发酵芝麻大豆海带具有上述效应，而且发酵芝麻大豆海带的该效应比发酵海带更强。
实施例3及4的结果显示，本发明的组合物具有从其发酵原料中预测不到的良好的免疫调节作用。
实施例5海带发酵物对NK活性及Th1细胞和Th2细胞的平衡(Th1/Th2比)的影响将12只C57BL/6小鼠(6周龄、雄性)分成平均体重大致相同的4组，每组3只。组的构成为无添加组(Control)、S-PT84给予组、未发酵海带给予组及发酵海带给予组。除无添加组外，在各给予组中，以每只0.75mg/kg给予S-PT84(干燥死菌)(S-PT84给予组)、以每只500mg/kg给予实施例1的未发酵海带(未发酵海带给予组)及发酵海带(发酵海带给予组)，连日强制经口投与。另外，S-PT84给予组中S-PT84的量相当与发酵芝麻大豆海带中S-PT84的量。在投与开始第七天，无菌取出脾脏，在细胞培养用培养基中(含10％胎牛血清、0.2％抗生素-抗真菌制剂混合溶液(Nacalai Tesque公司生产)的RPMI 1640培养基)通过在细胞过滤器(70μm、BD Falcon公司生产)上轻轻压迫取得细胞。用pipetting分散细胞后，离心分离(1500rpm、3分钟、4℃)。按照实施例3的方法，溶血除去红细胞后，制备脾淋巴细胞。该脾淋巴细胞的NK活性通过PINK法测定(所谓PINK法，即用疏水性膜系荧光色素3，3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(Dio)标记靶细胞Yac-1，再用膜不透过性核酸嵌入型荧光色素propidium iodide(PI)对死细胞的核进行双重染色，没受伤害的Yac-1为Dio单染色，受到伤害的Yac-1为双重染色，通过流式细胞仪检出，从而算出小鼠脾细胞的细胞毒活性)。此外，在刀豆素A(2.5μg/mL)的刺激下培养24小时，培养上清中产生的IFN-γ及IL-4的量通过使用了OptEIA(BD Pharmingen公司)的ELISA法测定。
NK活性的结果见图3。在图3中，NK activity(％)表示对小鼠脾淋巴细胞Yac-1(是小鼠淋巴瘤细胞，标准上用作小鼠NK细胞的敏感细胞。结果显示小鼠脾淋巴细胞∶Yac-1＝20∶1以及10∶1的数据。)的细胞毒性。图3表明，与对照组比较，NK活性以S-PT84给予组、未发酵海带给予组、海带发酵物给予组的顺序依次增加。
IFN-γ浓度及IL-4浓度、平衡指标Th1/Th2(IFN-γ/IL-4)的结果分别见图4、5。图4、5表明，与对照组比较，IFN-γ浓度在S-PT84给予组中没有变化，而在未发酵海带给予组中增加，在发酵海带给予组中显著增加。另一方面，与对照组比较，IL-4浓度在任何一组给予组中均有少许增加，但增加停留在40～70％。Th1/Th2在S-PT84给予组、未发酵海带给予组中没有变化，只有在发酵海带给予组中Th1占优势。以上的结果表明，发酵海带具有增强稳定状态时的免疫功能的作用，还具有将Th1/Th2平衡向Th1调节的作用。
该实施例的结果表明，发酵海带具有免疫赋活作用，还具有很强的将Th1/Th2平衡向Th1占优势的状态调节的作用。
实施例6发酵芝麻大豆海带对NK活性及Th1细胞和Th2细胞的平衡(Th1/Th2比)的影响将18只C57BL/6小鼠(6周龄、雄性)分成平均体重大致相同的3组，每组6只。组的构成为无添加组(Control)、S-PT84摄入组(S-PT84)以及实施例2中得到的发酵芝麻大豆海带摄入组(发酵组合物)。让各摄入组分别摄取添加了S-PT84(干燥死菌)并使其占0.0075重量％的固体饲料、添加了发酵芝麻大豆海带并使其占5重量％的固体饲料，自由摄食一周。另外，S-PT84摄入组中S-PT84的量相当于发酵芝麻大豆海带中S-PT84的量。在摄取开始第八天，取出脾脏，按照与实施例5相同的方法制备脾淋巴细胞。按照与实施例5相同的方法，测定得到的脾淋巴细胞的NK活性(PINK法)及刀豆素A(2.5μg/mL、24小时)刺激后的IL-4及IFN-γ浓度。
NK活性的结果见图6。在图6中，NK activity(％)表示对小鼠脾淋巴细胞的Yac-1(是小鼠淋巴瘤细胞，标准上用作小鼠NK细胞的敏感细胞。结果显示小鼠脾淋巴细胞∶Yac-1＝80∶1的数据。)的细胞毒性。图6表明，与无添加组比较，在S-PT84摄入组中NK活性提高，在发酵芝麻大豆海带摄入组中NK活性的提高更加显著。因此提示本发明组合物具有免疫赋活作用。
IL-4浓度、IFN-γ浓度的结果分别见图7、8。图7表明，IL-4浓度没有因摄取S-PT84及摄取发酵芝麻大豆海带而发生变化。另一方面，由图8可知，与无添加组比较，IFN-γ浓度在S-PT84摄入组中上升，在发酵芝麻大豆海带摄入组中显著上升。
即，该实施例表明本发明组合物将Th1/Th2平衡向Th1占优势的状态调节。
实施例7发酵芝麻大豆海带对应激所致的免疫低下以及Th1细胞和Th2细胞的平衡(Th1/Th2比)的影响将24只C57BL/6小鼠(6周龄、雄性)分成平均体重大致相同的4组，每组6只。组的构成为无处置组(Control)、应激组(Stress)、应激+S-PT84摄入组(S-PT84)以及应激+实施例2中得到的发酵芝麻大豆海带摄入组(发酵组合物)。让各摄入组摄取添加了S-PT84(干燥死菌)并使其占0.0075重量％的固体饲料、添加了发酵芝麻大豆海带并使其占5重量％的固体饲料，自由摄食一周。另外，S-PT84摄入组中S-PT84的量相当于发酵芝麻大豆海带中S-PT84的量。在摄取开始第八天，将应激组的18只小鼠水浸(submerge)一次后，放入顶端开有空气孔的50mL聚乙烯管中，束缚24小时。无处置组进行24小时绝水绝食。然后，按照与实施例5同样的方法，取出脾脏，制备脾淋巴细胞，测定NK活性(PINK法)。还测定了刀豆素A(2.5μg/mL、24小时)刺激后的IL-4及IFN-γ浓度。
NK活性的结果见图9。在图9中，NK activity(％)表示对小鼠脾淋巴细胞的Yac-1的细胞毒性。图9表明，与无处置组比较，NK活性在应激组(Stress)中下降。在S-PT84摄入组中，由应激所致的NK活性下降得到了抑制，在发酵芝麻大豆海带摄入组中，NK活性维持在无处置组的水平。IL-4浓度及IFN-γ浓度的结果见图10、11。图10、11表明，应激使IL-4及IFN-γ浓度均显著下降(Stress)。该组中IFN-γ浓度的下降比IL-4浓度的下降更加显著，因此认为Th1/Th2平衡中Th2占优势。应激下的IL-4浓度没有因摄取S-PT84及摄取发酵芝麻大豆海带而发生变化。但另一方面，与应激组比较，IFN-γ浓度在S-PT84摄入组中上升，在发酵芝麻大豆海带摄入组中显著上升。
以上的结果表明，芝麻·大豆·海带的乳酸菌发酵物(发酵芝麻大豆海带)不仅能增强稳定状态时的免疫功能，还能抑制由应激所致的免疫低下。还发现不是在单独摄取乳酸菌时而是在发酵芝麻大豆海带中，该效果显著。
实施例8发酵芝麻大豆海带的抗变态反应作用将BALB/C小鼠(7周龄、雄性)分成6组。组的构成为i)无处置组(Normal)(3只)、ii)对照组(Control)(9只)、iii)S-PT84(干燥死菌0.0075％混饵)摄入组(12只)、iv)实施例2得到的未发酵芝麻大豆海带(5％混饵)摄入组(未发酵组合物)(9只)、v)S-PT84(0.0075％混饵)+未发酵芝麻大豆海带(5％混饵)摄入组(10只)、vi)实施例2得到的发酵芝麻大豆海带(5％混饵)摄入组(发酵组合物)(8只)。另外，在S-PT84组和S-PT84+未发酵芝麻大豆海带摄入组中，饲料中添加了与发酵芝麻大豆海带中含有的菌数相当菌数的S-PT84。分别让无处置组、对照组自由摄食AIN-93M(日本Oriental Bio-service株式会社生产)普通饲料，让其余组自由摄食AIN-93M中混合了上述特定成分而制成的特殊饲料。在摄取开始的一周后及两周后，混合20μg卵白蛋白(OVA)和2mg氢氧化铝凝胶，给无处置组外的其余五组的小鼠腹腔内投与。摄取开始4周后，进行心脏采血，制备血清饲料，测定血清中总IgE浓度。此时还分离、培养脾细胞，在刀豆素A(2.5μg/mL)刺激下培养24小时，测定培养上清中产生的IFN-γ及IL-4的量。通过使用了OptEIA(BDPharmingen公司生产)的ELISA法测定总IgE、IFN-γ、IL-4。另外，各组的饲料总摄取量均约为3.0g。
总IgE浓度的试验结果见图12。图12表明，只有发酵芝麻大豆海带摄入组显著地抑制了IgE的上升。
各组脾细胞经刀豆素A刺激后的IL-4产生量见图13。与无处置组比较，投与OVA使IL-4的产生量降低(对照组)。在S-PT84+未发酵芝麻大豆海带摄入组中，IL-4的产生量更低。但是，与对照组比较，在发酵芝麻大豆海带摄入组中，IL-4的产生量上升。
各组脾细胞经刀豆素A刺激后的IFN-γ产生量见图14。与无处置组比较，投与OVA使IFN-γ的产生量降低(对照组)。但是，与对照组比较，在S-PT84+未发酵芝麻大豆海带摄入组、发酵芝麻大豆海带摄入组中，IFN-γ的产生量上升。该效应在发酵芝麻大豆海带摄入组中尤其显著。
此实施例的结果表明，本发明的发酵芝麻大豆海带具有抗变态反应作用。此外，摄取未发酵芝麻大豆海带、未发酵芝麻大豆海带+乳酸菌没有抗变态反应作用。因此表明为了发挥抗变态反应作用，对芝麻·大豆·海带进行乳酸菌发酵是很重要的。
实施例9由发酵芝麻大豆海带经口摄取引起的IgA分泌增强作用将C57BL/6小鼠(7周龄、雄性)分成平均体重大致相同的3组。组的构成为对照组(Control)(7只)、S-PT84(干燥死菌0.0075％混饵)摄入组(9只)以及实施例2得到的发酵芝麻大豆海带(5％混饵)摄入组(发酵组合物)(9只)。另外，S-PT84组使用与发酵芝麻大豆海带中含有的菌数相当的菌数的S-PT84。分别让对照组自由摄食AIN-93M普通饲料，让其余组自由摄食AIN-93M普通饲料中混合了上述特定成分而制成的特殊饲料。在摄取开始1周后，取出小肠，用PBS将内部洗净后，添加4倍量含有0.05％Tween20的PBS，用POLYTRON匀浆器匀质化。离心分离后，回收上清，得到小肠壁提取物。小肠壁提取物中IgA的量用ELISA法测定(Purified IgA Antibody作为一抗，Biotin Conjugate IgAAntibody作为二抗(均由Southern Biotech公司生产)，用Avidin-Horseradish peroxidase Conjugate显色)。
IgA的量见图15。图15表明，与对照组比较，在发酵芝麻大豆海带摄入组中，小肠壁提取物中IgA的量显著上升。本发明发酵芝麻大豆海带的该作用比单独摄取S-PT84时更强。
实施例10经口摄取发酵芝麻大豆海带对肠道免疫活性细胞产生细胞因子的促进作用将C57BL/6小鼠(7周龄、雄性)分成平均体重大致相同的3组。组的构成为对照组(7只)、S-PT84摄入组(干燥死菌0.0075％混饵)(9只)以及实施例2得到的发酵芝麻大豆海带(5％混饵)摄入组(9只发酵组合物)。分别让对照组自由摄食AIN-93M普通饲料，让其余组自由摄食AIN-93M普通饲料中混合了上述特定成分而制成的特殊饲料。一周后，取出派伊尔结，在细胞培养用培养基中(含10％胎牛血清、0.2％抗生素-抗真菌制剂混合溶液(Nacalai Tesque公司生产)的RPMI1640培养基)通过在细胞过滤器(70μm、BD Falcon公司生产)上轻轻压迫从而取得细胞，制备派伊尔结细胞样品。在添加了10％FBS的RPMI培养基中，用刀豆素A 2.5μg/mL对5×106个细胞作用24小时，上清中产生的IL-4以及IFN-γ的量通过使用了OptEIA(BD Pharmingen公司)的ELISA法测定。IL-4产生量的试验结果见图16，IFN-γ产生量的试验结果见图17。
图16及图17表明，与对照组比较，来自摄取发酵芝麻大豆海带小鼠的派伊尔结细胞的IFN-γ以及IL-4的产生量显著上升。而另一方面，在乳酸菌摄入组(S-PT84)中没有发现上述作用。
实施例9以及实施例10的结果表明，不是单独摄取乳酸菌而是只有当经口摄取发酵芝麻大豆海带时才有肠道免疫赋活作用。本发明的发酵组合物的上述效应是无法从发酵原料的作用中预测得到的。
实施例11海带发酵物的抗肿瘤作用将ddy小鼠(日本SLC(株))分成3组(每组10只)，连日强制经口给予水(0.6mL)、50mg/kg未发酵海带(500mg/kg)、发酵海带(500mg/kg)。强制经口投与开始的第二天，于小鼠胸部以每只1×106cells皮下接种Sarcoma180肉瘤细胞，制备Sarcoma180致癌小鼠。对Sarcoma180致癌小鼠继续经口投与18天。试验期间，测量肿瘤径，按照(I)式求得肿瘤大小(图18)。其结果为，未发酵海带给予组和发酵海带给予组的肿瘤大小分别与给予水的对照组比较，肿瘤变小，在发酵海带给予组中，肿瘤接种11天、15天以及19天后的肿瘤大小显著变小。由此可知，发酵海带具有更好的抗肿瘤作用。
(I)肿瘤大小(mm2)＝最大径(mm)×最小径×3.14实施例12采用实施例2中制备的芝麻、大豆以及海带的乳酸菌发酵组合物(发酵芝麻大豆海带)，按表4所示的配方，制造含有发酵芝麻大豆海带的丸剂(以下称发酵粒)(1粒的重量350mg)。具体为，在发酵芝麻大豆海带中混合赋形剂、用于调味的甜味剂等原料，在捏合机中捏合后，于制丸机中成型，制成丸剂。适度干燥后，用虫胶对颗粒表面进行包衣。另外，对发酵芝麻大豆海带没有实施在丸剂制造中通常进行的素丸表面抛光工序。同时还制造了不含发酵芝麻大豆海带的丸剂(形状与发酵粒相同)，作为安慰剂。各配方见表4。
将上述丸剂给公司内部40名健康志愿者服用，每天30粒(发酵芝麻大豆海带为4.7g/天)，对免疫调节作用进行了研究。摄取试验采用交叉试验来进行。即，将受试者分成以NK活性、年龄、性别为基准且在统计学上没有差异的两组，作为摄取样品，让各组摄取发酵粒或形状相同的安慰剂，摄取4周(摄取期间I)，洗脱期设为6周。然后，更换各组的摄取样品，再摄取1个月的安慰剂或发酵粒(摄取期间II)。在摄取期间的前后进行采血，用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法(Nycomed Pharma公司)制备白细胞，测定NK活性。关于NK活性，以白细胞∶K562＝20∶1，用PINK法测定以K562为靶细胞的细胞毒活性。此外，白细胞在PHA(phytohemagglutinin)存在下培养22小时，测定培养上清中IFN-γ、IL-4的产生量，分析了Th1/Th2平衡。
NK活性的试验结果见图19。摄取发酵粒使摄取期间I、II的NK活性显著提高。求出图19中摄取期间I、II的NK活性变化量(摄取前后的差ΔNK活性)，算出其平均值。结果见图20。与安慰剂摄入组比较，发酵粒摄入组的NK活性变化量显著。
接着，测定PHA刺激后白细胞产生的IFN-γ和IL-4的量，求出摄取期间I、II中Th1/Th2比(IFN-γ的产生量/IL-4的产生量)的变化量(摄取前后的差ΔTh1/Th2)，算出其平均值。结果见图21。与安慰剂摄入组比较，发酵粒摄入组中Th1/Th2比的变化量显著，提示了通过摄取发酵粒使Th1占优势。
本发明不限于上述各实施方式，可以在权利要求范围内进行种种变形，且通过适宜地组合不同实施方式中公开的各种技术手段而形成的实施方式也包括在本发明的技术范围内。
权利要求
1.组合物，其含有经乳酸菌发酵后的海带并具有免疫调节作用。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，免疫调节作用是免疫赋活作用及/或抗变态反应作用。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌。
4.组合物，其含有经乳酸菌发酵后的海带、经乳酸菌发酵后的芝麻和经乳酸菌发酵后的大豆。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中，乳酸菌是植物性乳酸菌。
6.根据权利要求4或5所述的组合物，其具有免疫调节作用。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，免疫调节作用是免疫赋活作用及/或抗变态反应作用。
8.根据权利要求1～7任意一项所述的组合物，其是饮食物、食品添加物、健康食品或医药组合物。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的组合物，其形态是丸剂。
全文摘要
本发明提供发挥免疫赋活作用、抗变态反应作用等免疫调节作用的新型组合物。本发明提供单独含有经乳酸菌发酵后的海带的组合物或含有该海带与经乳酸菌发酵后的芝麻、大豆的组合的组合物。该组合物能使营养成分均衡地被吸收，安全性高，且具有良好的免疫调节作用。
文档编号A61P37/00GK1853656SQ20061005878
公开日2006年11月1日 申请日期2006年3月3日 优先权日2005年3月4日
发明者野中裕司, 泉扶实, 出云贵幸 申请人:三得利株式会社