Mmtv抗原的免疫调节组合物及其使用方法

专利名称：Mmtv抗原的免疫调节组合物及其使用方法
1．引言本发明涉及对有此需要的人体给药一种免疫调节组合物的方法，该免疫调节组合物至少包含一种小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)抗原，用来诱导针对这种抗原的免疫应答。本发明还涉及由MMTV核酸编码的重组MMTV抗原和含有这种重组MMTV抗原的免疫调节组合物，以及有效制备这种抗原的方法。本发明还涉及用于被动免疫治疗的、含有针对MMTV抗原的抗体的组合物。
2．发明背景乳腺癌本身多种多样，妇女中乳腺癌的发病在世界范围内各不相同，Parkin等，1992,Ⅵ IARC Scientific Publications No.120,国际癌症研究机构。例如，极地附近的因纽特与丹麦、加拿大和康涅狄格相比，只有大约一半的发病率，Miller等，1996,ActaOncologica,35:577-580。膳食中辅因子或促进因子的改变曾被认为是人乳腺癌发病率不同的原因，这包括植物雌激素，Wu等，1996，《癌症流行病学、生物标记和预防》，5卷，901-906页；和异雌激素，Davis等，1995，《科学美国人》，10月刊，166-172页。但是，高脂肪膳食和环境异雌激素引起人乳腺癌增加的证据是不令人信服的，Modan等，1975，《癌症研究》，35卷，3503-3506页；Hunter等，1996，《新英格兰医学杂志》，334卷，356-361页；Krieger等，1994,J.Nat.Cancer Inst.86卷，590-599页。
一个已知的乳腺癌诱导试剂是小鼠乳腺瘤病毒，尽管是在小鼠中。小鼠乳腺瘤病毒是一种B型逆转录病毒，它通过插入诱变在易感小鼠中诱导乳腺瘤(乳腺癌)。与其他逆转录病毒相似，MMTV基因组编码三种类型的结构蛋白非糖基化的病毒核心蛋白(gag)、病毒逆转录酶(pol)以及病毒包膜糖蛋白(env)。主要的结构蛋白根据它们的分子量进行命名，包括糖蛋白(gp)55、gp34、蛋白(p)28、p18、p14和p12。病毒基因组的3’和5’末端由被称为病毒长末端重复(LTR)的重复序列组成，LTR的大小约为1300碱基对(bp)。LTR的3’区域内是一个约为1000bp的开放阅读框(orf)，其蛋白产物被称为超抗原(SAg)，它对宿主T细胞群体介导深远的影响。
不像其他致癌逆转录病毒，MMTV不携带独特的癌基因。而是通过感染乳腺上皮细胞，将MMTV前病毒插入宿主基因组的int-1或int-2或其他未鉴定的基因区域，通过MMTV LTR中的糖皮质激素应答元件的增强子活性，导致这些基因的活化。
已经证明，不携带MMTV的小鼠通常能方便地用MMTV抗原进行免疫，从而对MMTV感染的乳腺瘤组织的移植物攻击具有较低的易感性或具有完全的抗性，B1air,1971，《以色列医学科学杂志》7卷，161-186页；Wei等，1993，《癌症生物学》，4卷，205-213页。
通过寻找病毒颗粒、免疫交叉反应或序列同源性以证明病毒在人乳腺癌中存在的努力已得到了相互矛盾的结果。已在以下样品中发现了可检测到的MMTV env基因相关的抗原反应乳腺癌组织切片，Mesa-Tejada等，1978，《美国科学院院刊》75卷，1529-1533页；Levine等，1980《美国癌症研究协会进展》21卷，170页；Lloyd等，1983，《癌症》51卷，654-661页；培养的乳腺癌细胞，Litvinov和Golovkina,1989,Acta Virologica,33卷，137-142页；人奶，Zotter等，1980，《欧洲癌症杂志》16卷，455-467页；病人血清，Day等，1981，《美国科学院院刊》78卷，2483-2487页；囊肿液，Witkin等，1981，《临床探索杂志》67卷，216-222页；人乳腺癌细胞系产生的颗粒，Keydar等，1984，《美国科学院院刊》81卷，4188-4192页。已经发现人DNA在低严谨条件下与MMTV具有序列同源性，Callahan等，1992，《美国科学院院刊》79卷，5503-5507页，并且已经在人乳腺癌细胞中检测到与MMTV有关的RNA,Axel等，1972，《自然》235卷，32-36页。MMTV相关序列在患有乳腺癌病人的淋巴细胞中存在以及在他们的单核细胞中检测到逆转录酶(RT)活性已由Crepin等人报道，1984，《生物化学生物物理研究通讯》118卷，324-331页。Al-Sumidaie等，1988，《癌症研究》49卷3879-3883报道了按串联重复方式排列的MMTV样序列仅在来自乳腺癌细胞的DNA中存在。
但是，以相对近一些时候发现的人内源逆转录序列(“HERs”)的观点来看，Westley等，1986，《病毒学杂志》60卷，743-749页，Ono等，1986，《病毒学杂志》60卷，589-598页，Faff等，1992，《普通病毒学杂志》73卷，1087-1097页，国际专利出版物WO97/17470，这些结果很难解释。可以解释为证明MMTV相关序列存在的数据更容易用人内源逆转录序列进行解释，Pogo和Holland,1997，《生物痕量元素研究》56卷，131-142页。更为增加混乱的是，在人蛋白的表位中检测到了env基因相关的抗原性，Hareuveni等，1990，《国际癌症杂志》46卷，1134-1135页。因此，对于乳腺癌的原因，已经有多种相互矛盾的解释。
在这里或本申请的任何其他章节引用的参考文献不应理解为这些参考文献是本发明的现有技术。
3．发明简述本发明的方法涉及对人给药一种免疫调节组合物，该组合物至少包含一种MMTV抗原，用来诱导针对MMTV的细胞或体液免疫应答的增加，预防或治疗人体因MMTV感染而引起的疾病或紊乱。本发明部分基于以下发现，MMTV人兽互传给人的发生以及MMTV感染能在人中引起疾病和紊乱，包括乳腺癌和非霍奇金氏淋巴瘤。本发明的发明者已经确定，乳腺癌在全世界的不同发病率与不同地理区域中小鼠的MMTV流行和病毒载量有关。
本发明的方法还可用于预防或治疗人体中由一种能与抗MMTV抗原的抗体反应的生物或化学试剂引起的疾病或紊乱。这种免疫调节组合物至少包含一种MMTV抗原和一种可药用的载剂。
在本发明的另一个实施方案中，该组合物至少包含一种针对MMTV抗原的抗体，这种组合物可用于被动免疫治疗，预防或治疗人体中因MMTV感染引起的疾病或紊乱，或者预防或治疗人体中由一种能与抗MMTV抗原的抗体反应的生物或化学试剂引起的疾病或紊乱。
本发明还通过测定一种试验MMTV抗原是否能与一种获自对MMTV抗原已经显示免疫应答的个体(即个体如已经接触或感染MMTV的人或小鼠)的抗体或免疫细胞反应，或者通过测定试验抗原是否能与一种获自用MMTV抗原免疫的个体的抗体或免疫细胞反应，来提供选择能诱导免疫应答的MMTV抗原的方法，以及这种所选抗原在本发明的免疫调节组合物中的应用。
本发明还通过用获自对MMTV抗原已经显示免疫应答的个体的抗体或免疫细胞对文库(例如，包括但不限于组合肽库、随机肽库或噬菌体表达文库)进行筛选，或者用获自MMTV抗原免疫的个体的抗体或免疫细胞(例如一种中和性的鼠多克隆或单克隆抗体)进行筛选，来提供获得一种MMTV的肽模拟物的方法。文库的反应阳性成员(模拟物)可用于本发明的免疫调节组合物。这种模拟物可代表MMTV抗原的连续或不连续表位。
3.1定义以下词在这里使用时将含有后面指明的意思。
“MMTV抗原”是指一种肽，它包含一种MMTV编码肽的全长天然氨基酸序列或其一个部分，例如，包括但不限于包膜肽、逆转录酶、核心蛋白或编码的超抗原。该词还指肽的类似物，这种类似物是功能上例如抗原性上的等价肽，例如一种肽模拟物。优选的类似物为基本上与相应的天然氨基酸同源的类似物，并且至少包含一种天然MMTV表位，例如一种中和表位。“MMTV抗原”一词还指编码一种肽的核酸分子，该肽包含一种MMTV编码蛋白的全长天然氨基酸序列或其一个部分。该词还指核酸分子的类似物，这种类似物在功能上是等价的，例如编码一种MMTV肽的分子。类似物可以是基本上与相应天然核苷酸序列同源的和编码至少含有一种天然MMTV表位如中和表位的肽的类似物。“MMTV抗原”一词还指一种肽，这种肽至少含有MMTV的不连续表位，或者是这种肽的类似物。该词还指编码一种肽的核酸分子，其中肽至少含有一种MMTV的不连续表位，或者是这种核酸分子的类似物。
“不连续表位”是指这样一种表位，它含有源自肽原始氨基酸序列中不同位置但在肽的三维结构中彼此相邻的氨基酸序列。这种不连续表位也被称为构象表位，它可由包含编码这些三维上相邻的氨基酸序列的核酸分子编码。它与连续表位相对，连续表位被定义为这样一种表位，其中抗原性残基存在于一个短的氨基酸序列中，即相互连续。
“有效数量”是指足以在被给药的受体中诱导可检测的免疫应答的抗原数量。免疫应答可包括能与抗原反应性抗体产生的诱导或细胞或体液免疫的诱导，但这不是限制。
“免疫调节组合物”是指含有一种MMTV抗原和一种可药用载剂的组合物，当这种组合物被给药于受体时能在受体的免疫系统功能中引起一种可检测的改变，例如免疫特异性抗体的产生或能引发细胞介导的免疫应答的抗体的产生。
“可药用载剂”是指一种不干扰活性成分的生物活性有效性的载体基质，它在化学特性上是惰性的，并且对给予了给药数量的病人没有毒性。
“治疗或预防由MMTV引起的疾病或紊乱”是指抑制MMTV病毒的复制，抑制MMTV的转移，或防止MMTV在其宿主中组装，或减轻或缓解MMTV感染引起的疾病的症状，包括但不限于乳腺癌和非霍奇金氏淋巴瘤。该词还包括减轻或缓解由一种能与抗MMTV抗原的抗体反应的生物或化学试剂引起的疾病的症状。如果存在病毒载量例如血液中病毒的拷贝数减少、致死性和/或致病性降低的情况，该处理就被认为是治疗性的。
4．附图简述

图1显示了一株鼠乳腺瘤病毒的完整前病毒基因组的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2显示了gag-pol-pro多肽的编码氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3显示了gag-pro多肽的编码氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。
图4显示了gag多肽的编码氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
图5显示了env多肽的编码氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
图6显示了超抗原(SAg)多肽的编码氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。
5．发明详述本发明的方法涉及对人给药一种免疫调节组合物，该组合物至少含有一种MMTV抗原，用于诱导抗MMTV的细胞或体液免疫应答的增加，来预防或治疗人体中因MMTV感染引起的疾病或紊乱。本发明的方法还可用于预防或治疗人体中由一种能与抗MMTV抗原的抗体反应的生物或化学试剂引起的疾病或紊乱。该免疫调节组合物至少含有一种MMTV抗原和一种可药用的载剂。如同上文所定义的，MMTV抗原可特别地是一种肽、肽类似物或编码这种肽或肽类似物的核酸分子。这种肽可包括MMTV的gag、pol和包膜蛋白及其部分。本发明进一步涉及表达MMTV抗原的方法，包括表达载体和细胞系(真核、原核以及病毒表达载体)，以及这种表达抗原在本发明的免疫调节组合物中的应用。
在本发明的另一个实施方案中，组合物至少含有一种针对MMTV抗原的抗体，该组合物可用于被动免疫治疗，用来预防或治疗人体中因MMTV感染引起的疾病或紊乱，或者用来预防或治疗人体中由一种能与抗MMTV抗原的抗体反应的生物或化学试剂引起的疾病或紊乱。
本发明还通过测定一种试验MMTV抗原是否能与一种获自对MMTV抗原已经显示免疫应答的个体(即个体例如已经接触或感染MMTV的人或小鼠)的抗体或免疫细胞反应，或者通过测定试验抗原是否能与一种获自用本发明的免疫调节组合物免疫的个体的抗体或免疫细胞反应，来提供选择能诱导免疫应答的MMTV抗原的方法，以及这种所选抗原在本发明的免疫调节组合物中的应用。例如，抗体可以是一种中和性的鼠多克隆或单克隆抗体。
本发明还通过用获自对MMTV抗原已经显示免疫应答的个体的抗体或免疫细胞对文库(例如，包括但不限于组合肽库、随机肽库或噬菌体表达文库)进行筛选，或者用获自用本发明的免疫调节组合物免疫的个体的抗体或免疫细胞(例如一种中和性的鼠多克隆或单克隆抗体)进行筛选，来提供获得一种MMTV抗原的肽模拟物的方法。文库的反应阳性成员(模拟物)可用于本发明的免疫调节组合物。
在本发明的一个实施方案中，至少一种抗原性或免疫原性的MMTV肽被用于本发明的免疫调节组合物中。在本发明的另一个实施方案中，至少有一种MMTV核苷酸序列被用于本发明的免疫调节组合物中，该核苷酸序列在表达于一种合适的宿主细胞时，至少产生一种抗原性或免疫原性的MMTV肽。一种抗原性的肽能被针对该肽的抗体免疫特异性地结合。一种免疫原性的肽能够激发针对该肽的免疫应答，例如产生能免疫特异性地结合该肽的抗体或引发针对该肽的细胞介导的免疫应答。
这种免疫调节组合物可单独以预防的方式用于那些没有接触MMTV或者MMTV抗体反应性生物或化学试剂的受体，或在受体已经感染或接触了MMTV或接触了MMTV抗体反应性生物或化学试剂或者同时接触了上述两种物质后用于治疗程序。本发明的MMTV抗原还可用于诊断免疫试验、被动免疫治疗和产生抗独特型抗体。
5.1．MMTV肽本发明包括MMTV肽及其免疫原性或抗原性部分，以及这种肽或部分的类似物，具有至少代表一种MMTV的不连续表位的氨基酸序列的肽，和它们在本发明的免疫调节组合物中的应用。本发明的肽包括以下(1)任何具有一个能与抗MMTV抗体免疫反应的氨基酸序列的肽；(2)任何具有一个包含如图2-6中所示的任一氨基酸序列(SEQ IDNO:2-6)或其至少6个连续氨基酸的免疫原性或抗原性部分的氨基酸序列的肽；以及(3)任何具有一个代表MMTV抗原的不连续表位的氨基酸序列并能与一种MMTV肽反应性抗体反应的肽。例如，图2中所示的、可用于本发明的组合物的、一种肽的抗原性部分具有选自大约aax至大约aay的氨基酸序列，其中aax表示大约从SEQ ID NO:2的1号氨基酸至大约1746号氨基酸，aay是SEQ ID NO:2的约x+9号氨基酸，即一个选自含有如下氨基酸序列的氨基酸序列从SEQ ID NO:2的大约aa1至大约aa10，大约aa2至大约 aa11，大约aa3至大约 aa12，大约 aa4至大约aa13， 大约 aa5至大约aa14， 大约aa6至大约aa15，大约aa7至大约 aa16，大约aa8至大约 aa17，大约 aa9至大约aa18， 大约 aa10至大约aa19， 大约aa11至大约aa20，大约aa12至大约 aa21，大约aa13至大约 aa22，大约 aa14至大约aa23， 大约 aa15至大约aa24， 大约aa16至大约aa25，大约aa17至大约 aa26，大约aa18至大约 aa27，大约 aa19至大约aa28， 大约 aa20至大约aa29， 大约aa21至大约aa30，大约aa22至大约 aa11，大约aa23至大约 aa32，大约 aa24至大约aa33， 大约 aa25至大约aa34， 大约aa26至大约aa35，大约aa27至大约 aa36，大约aa28至大约 aa37，大约 aa29至大约aa38， 大约 aa30至大约aa39， 大约aa31至大约aa40，大约aa32至大约 aa41，大约aa33至大约 aa42，大约 aa34至大约aa43， 大约 aa35至大约aa44， 大约aa36至大约aa45， 大约aa37至大约aa46，大约aa38至大约aa47，大约 aa39至大约aa48，大约 aa40至大约aa49，大约 aa41至大约aa50， 大约aa42至大约aa51，大约aa43至大约aa52，大约 aa44至大约aa53，大约 aa45至大约aa54，大约 aa46至大约aa55， 大约aa47至大约aa56，大约aa48至大约aa57，大约 aa49至大约aa58，大约 aa50至大约aa59，大约 aa51至大约aa60， 大约aa52至大约aa61，大约aa53至大约aa62，大约 aa54至大约aa63，大约 aa55至大约aa64，大约 aa56至大约aa65， 大约aa57至大约aa66，大约aa58至大约aa67，大约 aa59至大约aa68，大约 aa60至大约aa69，大约 aa61至大约aa70， 大约aa62至大约aa71，大约aa63至大约aa72，大约 aa64至大约aa73，大约 aa65至大约aa74，大约 aa66至大约aa75， 大约aa67至大约aa76，大约aa68至大约aa77，大约 aa69至大约aa78，大约 aa70至大约aa79，大约 aa71至大约aa80， 大约aa72至大约aa81，大约aa73至大约aa82，大约 aa74至大约aa83，大约 aa75至大约aa84，大约 aa76至大约aa85， 大约aa77至大约aa86，大约aa78至大约aa87，大约 aa79至大约aa88，大约 aa80至大约aa89，大约 aa81至大约aa90， 大约aa82至大约aa91，大约aa83至大约aa92，大约 aa64至大约aa93，大约 aa85至大约aa94，大约 aa86至大约aa95， 大约aa87至大约aa96，大约aa88至大约aa97，大约 aa89至大约aa98，大约 aa90至大约aa99，大约 aa91至大约aa100，大约aa92至大约aa101，大约 aa93至大约aa102，大约 aa94至大约aa103，大约 aa95至大约aa104，大约 aa96至大约aa105，大约 aa97至大约aa106，大约 aa98至大约aa107，大约 aa99至大约aa108，大约 aa100至大约aa109，大约aa101至大约aa110，大约 aa102至大约aa111，大约 aa103至大约aa112，大约 aa104至大约aa113，大约 aa105至大约aa114，大约 aa106至大约aa115，大约 aa107至大约aa116，大约 aa108至大约aa117，大约 aa109至大约aa118，大约 aa110至大约aa119，大约 aa111至大约aa120，大约 aa111至大约aa121，大约 aa113至大约aa122，大约 aa114至大约aa123，大约 aa115至大约aa124，大约 aa116至大约aa125，大约 aa117至大约aa126，大约 aa118至大约aa127，大约 aa119至大约aa128，大约 aa120至大约aa129，大约 aa121至大约aa130，大约 aa122至大约aa131，大约 aa123至大约aa132，大约 aa124至大约aa133，大约 aa125至大约aa134，大约 aa126至大约aa135，大约 aa127至大约aa136，大约 aa128至大约aa137，大约 aa129至大约aa138，大约 aa130至大约aa139，大约 aa131至大约aa140，大约 aa132至大约aa141，大约 aa133至大约aa142，大约 aa134至大约aa143，大约 aa135至大约aa144，大约 aa136至大约aa145，大约 aa137至大约aa146，大约 aa138至大约aa147，大约 aa139至大约aa148，大约 aa140至大约aa149，大约 aa141至大约aa150，大约 aa142至大约aa151，大约 aa143至大约aa152，大约 aa144至大约aa153，大约 aa145至大约aa154，大约 aa146至大约aa155，大约 aa147至大约aa156，大约 aa148至大约aa157，大约 aa149至大约aa158，大约 aa150至大约aa159，大约 aa151至大约aa160，大约 aa152至大约aa161，大约 aa153至大约aa162，大约 aa154至大约aa163，大约 aa155至大约aa164，大约 aa156至大约aa165，大约 aa157至大约aa166，大约 aa158至大约aa167，大约 aa159至大约aa168，大约 aa160至大约aa169，大约 aa161至大约aa170，大约 aa162至大约aa171，大约 aa163至大约aa172，大约 aa164至大约aa173，大约 aa165至大约aa174，大约 aa166至大约aa175，大约 aa167至大约aa176，大约 aa168至大约aa177，大约 aa169至大约aa178，大约 aa170至大约aa179，大约 aa171至大约aa180，大约 aa172至大约aa181，大约 aa173至大约aa182，大约 aa174至大约aa183，大约 aa175至大约aa184，大约 aa176至大约aa185，大约 aa177至大约aa186，大约 aa178至大约aa187，大约 aa179至大约aa188，大约 aa180至大约aa189，大约 aa181至大约aa190，大约 aa182至大约aa191，大约 aa183至大约aa192，大约 aa184至大约aa193，大约 aa185至大约aa194，大约 aa186至大约aa195，大约 aa187至大约aa196，大约 aa188至大约aa197，大约 aa189至大约aa198，大约 aa190至大约aa199，大约 aa191至大约aa200，大约 aa192至大约aa201，大约 aa193至大约aa202，大约 aa194至大约aa203，大约 aa195至大约aa204，大约 aa196至大约aa205，大约 aa197至大约aa206，大约 aa198至大约aa207，大约 aa199至大约aa208，大约 aa200至大约aa209，大约 aa201至大约aa210，大约 aa202至大约aa211，大约 aa203至大约aa212，大约 aa204至大约aa213，大约 aa205至大约aa214，大约 aa206至大约aa215，大约 aa207至大约aa216，大约 aa208至大约aa217，大约 aa209至大约aa218，大约 aa210至大约aa219，大约 aa211至大约aa220，大约 aa212至大约aa221，大约 aa213至大约aa222，大约 aa214至大约aa223，大约 aa215至大约aa224，大约 aa216至大约aa225，大约 aa217至大约aa226，大约 aa218至大约aa227，大约 aa219至大约aa228，大约 aa220至大约aa229，大约 aa221至大约aa230，大约 aa222至大约aa231，大约 aa223至大约aa232，大约 aa224至大约aa233，大约 aa225至大约aa234，大约 aa226至大约aa235，大约 aa227至大约aa236，大约 aa228至大约aa237，大约aa229至大约aa238，大约 aa230至大约aa239，大约 aa231至大约aa240，大约 aa232至大约aa241，大约 aa233至大约aa242，大约 aa234至大约aa243，大约 aa235至大约aa244，大约 aa236至大约aa245，大约 aa237至大约aa246，大约 aa238至大约aa247，大约 aa239至大约aa248，大约 aa240至大约aa249，大约 aa241至大约aa250，大约 aa242至大约aa251，大约 aa243至大约aa252，大约 aa244至大约aa253，大约 aa245至大约aa254，大约 aa246至大约aa255，大约 aa247至大约aa256，大约 aa248至大约aa257，大约 aa249至大约aa258，大约 aa250至大约aa259，大约 aa251至大约aa260，大约 aa252至大约aa261，大约 aa253至大约aa262，大约 aa254至大约aa263，大约 aa255至大约aa264，大约 aa256至大约aa265，大约 aa257至大约aa266，大约 aa258至大约aa267，大约 aa259至大约aa268，大约 aa260至大约aa269，大约 aa261至大约aa270，大约 aa262至大约aa271，大约 aa263至大约aa272，大约 aa264至大约aa273，大约 aa265至大约aa274，大约 aa266至大约aa275，大约 aa267至大约aa276，大约 aa268至大约aa277，大约 aa269至大约aa278，大约 aa270至大约aa279，大约 aa271至大约aa280，大约 aa272至大约aa281，大约 aa273至大约aa282，大约 aa274至大约aa283，大约 aa275至大约aa284，大约 aa276至大约aa285，大约 aa277至大约aa286，大约 aa278
至大约aa287，大约 aa279至大约aa288，大约 aa280至大约aa289，大约 aa281至大约aa290，大约 aa282至大约aa291，大约 aa283至大约aa292，大约 aa284至大约aa293，大约 aa285至大约aa294，大约 aa286至大约aa295，大约 aa287至大约aa296，大约 aa288至大约aa297，大约 aa289至大约aa298，大约 aa290至大约aa299，大约 aa291至大约aa300，大约 aa292至大约aa301，大约 aa293至大约aa302，大约 aa294至大约aa303，大约 aa295至大约aa304，大约 aa296至大约aa305，大约 aa297至大约aa306，大约 aa298至大约aa307，大约aa299至大约aa308，大约 aa300至大约aa309，大约 aa301至大约aa310，大约 aa302至大约aa311，大约 aa303至大约aa312，大约 aa304至大约aa313，大约 aa305至大约aa314，大约 aa306至大约aa315，大约 aa307至大约aa316，大约 aa308至大约aa317，大约 aa309至大约aa318，大约 aa310至大约aa319，大约 aa311至大约aa320，大约 aa312至大约aa321，大约 aa313至大约aa322，大约 aa314至大约aa323，大约aa315至大约aa324，大约 aa316至大约aa325，大约 aa317至大约aa326，大约 aa318至大约aa327，大约 aa319至大约aa328，大约 aa320至大约aa329，大约 aa321至大约aa330，大约 aa322至大约aa331，大约aa323至大约aa332，大约 aa324至大约aa333，大约 aa325至大约aa334，大约 aa325至大约aa335，大约 aa327至大约aa336，大约 aa328至大约aa337，大约 aa329至大约aa338，大约 aa330至大约aa339，大约 aa331至大约aa340，大约 aa332至大约aa341，大约 aa333至大约aa342，大约 aa334至大约aa343，大约 aa335至大约aa344，大约 aa336至大约aa345，大约 aa337至大约aa346，大约 aa338至大约aa347，大约 aa339至大约aa348，大约 aa340至大约aa349，大约 aa341至大约aa350，大约 aa342至大约aa351，大约 aa343至大约aa352，大约 aa344至大约aa353，大约 aa345至大约aa354，大约 aa346至大约aa355，大约 aa347至大约aa356，大约 aa348至大约aa357，大约 aa349至大约aa358，大约 aa350至大约aa359，大约 aa351至大约aa360，大约 aa352至大约aa361，大约 aa353至大约aa362，大约 aa354至大约aa363，大约 aa355至大约aa364，大约 aa356至大约aa365，大约 aa357至大约aa366，大约 aa358至大约aa367，大约 aa359至大约aa368，大约 aa360至大约aa369，大约 aa361至大约 aa370，大约 aa362至大约aa371，大约 aa363至大约aa372，大约 aa364至大约aa373，大约 aa365至大约aa374，大约 aa366至大约aa375，大约 aa367至大约aa376，大约 aa368至大约aa377，大约 aa369至大约aa378，大约 aa370至大约aa379，大约 aa371至大约aa380，大约 aa372至大约aa381，大约 aa373至大约aa382，大约 aa374至大约aa383，大约 aa375至大约aa384，大约 aa376至大约aa385，大约 aa377至大约aa386，大约 aa378至大约aa387，大约 aa379至大约aa388，大约 aa380至大约aa389，大约 aa381至大约aa390，大约 aa382至大约aa391，大约 aa383至大约aa392，大约 aa384至大约aa393，大约 aa385至大约aa394，大约 aa386至大约aa395，大约 aa387至大约aa396，大约 aa388至大约aa397，大约 aa389至大约aa398，大约 aa390至大约aa399，大约 aa391至大约aa400，大约 aa392至大约aa401，大约aa393至大约aa402，大约 aa394至大约aa403，大约 aa395至大约aa404，大约aa396至大约aa405，大约 aa397至大约aa406，大约 aa398至大约aa407，大约 aa399至大约aa408，大约 aa400至大约aa409，大约 aa401至大约aa410，大约 aa402至大约aa411，大约 aa403至大约aa412，大约 aa404至大约aa413，大约 aa405至大约aa414，大约 aa406至大约aa415，大约 aa407至大约aa416，大约 aa408至大约aa417，大约 aa409至大约aa418，大约 aa410至大约aa419，大约 aa411至大约aa420，大约aa412至大约aa421，大约 aa413至大约aa422，大约 aa414至大约aa423，大约 aa415至大约aa424，大约 aa416至大约aa425，大约 aa417至大约aa426，大约 aa418至大约aa427，大约 aa419至大约aa428，大约 aa420至大约aa429，大约 aa421至大约aa430，大约 aa422至大约aa431，大约 aa423至大约aa432，大约 aa424至大约aa433，大约 aa425至大约aa434，大约 aa426至大约aa435，大约 aa427至大约aa436，大约 aa428至大约aa437，大约 aa429至大约aa438，大约 aa430至大约aa439，大约 aa431至大约aa440，大约 aa432至大约aa441，大约 aa433至大约aa442，大约 aa434至大约aa443，大约 aa435至大约aa444，大约 aa436至大约aa445，大约 aa437至大约aa446，大约 aa438至大约aa447，大约 aa439至大约aa448，大约 aa440至大约aa449，大约 aa441至大约aa450，大约 aa442至大约aa451，大约 aa443至大约aa452，大约 aa444至大约aa453，大约 aa445至大约aa454，大约 aa446至大约aa455，大约 aa447至大约aa456，大约 aa448至大约aa457，大约 aa449至大约aa458，大约 aa450至大约aa459，大约 aa451至大约aa460，大约 aa452至大约aa461，大约 aa453至大约aa462，大约 aa454至大约aa463，大约 aa455至大约aa464，大约 aa456至大约aa465，大约 aa457至大约aa466，大约 aa468至大约aa467，大约 aa459至大约aa468，大约 aa460至大约aa469，大约 aa461至大约aa470，大约 aa462至大约aa471，大约 aa463至大约aa472，大约 aa464至大约aa473，大约 aa465至大约aa474，大约 aa466至大约aa475，大约 aa467至大约aa476，大约 aa468至大约aa477，大约 aa469至大约aa478，大约 aa470至大约aa479，大约 aa471至大约aa480，大约 aa472至大约aa481，大约 aa473至大约aa482，大约 aa474至大约aa483，大约 aa475至大约aa484，大约 aa476至大约aa485，大约 aa477至大约aa486，大约 aa478至大约aa487，大约 aa479至大约aa488，大约 aa480至大约aa489，大约 aa481至大约aa490，大约 aa482至大约aa491，大约 aa483至大约aa492，大约 aa484至大约aa493，大约 aa485至大约aa494，大约 aa486至大约aa495，大约 aa487至大约aa496，大约 aa488至大约aa497，大约 aa489至大约aa498，大约 aa490至大约aa499，大约 aa491至大约aa500，大约 aa492至大约aa501，大约 aa493至大约aa502，大约 aa494至大约aa503，大约 aa495至大约aa504，大约 aa496至大约aa505，大约 aa497至大约aa506，大约 aa498至大约aa507，大约 aa499至大约aa508，大约 aa500至大约aa509，大约 aa501至大约aa510，大约 aa502至大约aa511，大约 aa503至大约aa512，大约 aa504至大约aa513，大约 aa505至大约aa514，大约 aa506至大约aa515，大约 aa507至大约aa516，大约 aa508至大约aa517，大约 aa509至大约aa518，大约 aa510至大约aa519，大约 aa511至大约aa520，大约 aa512至大约aa521，大约 aa513至大约aa522，大约 aa514至大约aa523，大约 aa515至大约aa524，大约 aa516
至大约aa525，大约 aa517至大约aa526，大约 aa518至大约aa527，大约 aa519至大约aa528，大约 aa520至大约aa529，大约 aa521至大约aa530，大约 aa522至大约aa531，大约 aa523至大约aa532，大约 aa524至大约aa533，大约 aa525至大约aa534，大约 aa526至大约aa535，大约 aa527至大约aa536，大约 aa528至大约aa537，大约 aa529至大约aa538，大约 aa530至大约aa539，大约 aa531至大约aa540，大约 aa532至大约aa541，大约 aa533至大约aa542，大约 aa534至大约aa543，大约 aa535至大约aa544，大约 aa536至大约aa545，大约 aa537至大约aa546，大约 aa538至大约aa547，大约 aa539至大约aa548，大约 aaa540至大约aa549，大约 aa541至大约aa550，大约 aa542至大约aa551，大约 aa543至大约aa552，大约 aa544至大约aa553，大约 aa545至大约aa554，大约 aa546至大约aa555，大约 aa547至大约aa556，大约 aa548至大约aa557，大约 aa549至大约aa558，大约 aa550至大约aa559，大约 aa551至大约aa560，大约 aa552至大约aa561，大约 aa553至大约aa562，大约 aa554至大约aa563，大约 aa555至大约aa564，大约 aa556至大约aa565，大约 aa557至大约aa566，大约 aa558至大约aa567，大约 aa559至大约aa568，大约 aa560至大约aa569，大约 aa561至大约aa570，大约 aa562至大约aa571，大约 aa563至大约aa572，大约 aa564至大约aa573，大约 aa565至大约aa574，大约 aa566至大约aa575，大约 aa567至大约aa576，大约 aa568至大约aa577，大约 aa569至大约aa578，大约 aa570至大约aa579，大约 aa571至大约aa580，大约 aa572至大约aa581，大约 aa573至大约aa582，大约 aa574至大约aa583，大约 aa575至大约aa584，大约 aa576至大约aa585，大约aa577至大约aa586，大约 aa578至大约aa587，大约 aa579至大约aa588，大约 aa580至大约aa589，大约 aa581至大约aa590，大约 aa582至大约aa591，大约 aa583至大约aa592，大约 aa584至大约aa593， 大约 aa585至大约aa594，大约 aa586至大约aa595，大约 aa587至大约aa596，大约 aa588至大约aa597，大约 aa589至大约aa598，大约 aa590至大约aa599，大约aa591至大约aa600，大约 aa592至大约aa601，大约 aa593至大约aa602，大约 aa594至大约aa603，大约 aa595至大约aa604，大约 aa596至大约aa605，大约 aa597至大约aa606，大约 aa598至大约aa607，大约 aa599至大约aa608，大约 aa600至大约aa609，大约 aa601至大约aa610，大约 aa602至大约aa611，大约 aa603至大约aa612，大约 aa604至大约aa613，大约 aa605至大约aa614，大约 aa606至大约aa615，大约 aa607至大约aa616，大约 aa608至大约aa617，大约 aa609至大约aa618，大约 aa610至大约aa619，大约 aa611至大约aa620，大约 aa612至大约aa621，大约 aa613至大约aa622，大约 aa614至大约aa623，大约 aa615至大约aa624，大约 aa616至大约aa625，大约 aa617至大约aa626，大约 aa618至大约aa627，大约 aa619至大约aa628，大约 aa620至大约aa629，大约 aa621至大约aa630，大约 aa622至大约aa631，大约 aa623至大约aa632，大约 aa624至大约aa633，大约 aa625至大约aa634，大约 aa626至大约aa635，大约 aa627至大约aa636，大约 aa628至大约aa637，大约 aa629至大约aa638，大约 aa630至大约aa639，大约 aa631至大约aa640，大约 aa632至大约aa641，大约 aa633至大约aa642，大约 aa634至大约aa643，大约 aa635至大约aa644，大约 aa636至大约aa645，大约 aa637至大约aa646，大约 aa638至大约aa647，大约 aa639至大约aa648，大约 aa640至大约aa649，大约 aa641至大约aa650，大约 aa642至大约aa651，大约 aa643至大约aa652，大约 aa644至大约aa653，大约 aa645至大约aa654，大约 aa646至大约aa655，大约 aa647至大约aa656，大约 aa648至大约aa657，大约 aa649至大约aa658，大约 aa650至大约aa659，大约 aa651至大约aa660，大约 aa652至大约aa661，大约 aa653至大约aa662，大约 aa654至大约aa663，大约 aa655至大约aa664，大约 aa656至大约aa665，大约 aa657至大约aa666，大约 aa658至大约aa667，大约 aa659至大约aa668，大约 aa660至大约aa669，大约 aa661至大约aa670，大约 aa662至大约aa671，大约 aa663至大约aa642，大约 aa664至大约aa673，大约 aa665至大约aa674，大约 aa666至大约aa675，大约 aa667至大约aa676，大约 aa668至大约aa677，大约 aa669至大约aa678，大约 aa670至大约aa679，大约 aa671至大约aa680，大约 aa672至大约aa681，大约 aa673至大约aa682，大约 aa674至大约aa683，大约 aa675至大约aa684，大约 aa676至大约aa685，大约 aa677至大约aa686，大约 aa678至大约aa687，大约 aa679至大约aa688，大约 aa680至大约aa689，大约 aa681至大约aa690，大约 aa682至大约aa691，大约 aa683至大约aa692，大约 aa684至大约aa693，大约 aa685至大约aa694，大约 aa686至大约aa695，大约 aa687至大约aa696，大约 aa688至大约aa697，大约 aa689至大约aa698，大约 aa690至大约aa699，大约 aa691至大约aa700，大约 aa692至大约aa701，大约 aa693至大约aa702，大约 aa694至大约aa703，大约 aa695至大约aa704，大约 aa696至大约aa705，大约 aa697至大约aa706，大约 aa698至大约aa707，大约 aa699至大约aa708，大约 aa700至大约aa709，大约 aa701至大约aa710，大约 aa702至大约aa711，大约 aa703至大约aa712，大约 aa704至大约aa713，大约 aa705至大约aa714，大约 aa706至大约aa715，大约 aa707至大约aa716，大约 aa708至大约aa717，大约 aa709至大约aa718，大约 aa710至大约aa719，大约 aa711至大约aa720，大约 aa712至大约aa721，大约 aa713至大约aa722，大约 aa714至大约aa723，大约 aa715至大约aa724，大约 aa716至大约aa725，大约 aa717至大约aa726，大约 aa718至大约aa727，大约 aa719至大约aa728，大约 aa720至大约aa729，大约 aa721至大约aa730，大约 aa722至大约aa731，大约 aa723至大约aa732，大约 aa724至大约aa733，大约 aa725至大约aa734，大约 aa726至大约aa735，大约 aa727至大约aa736，大约 aa728至大约aa737，大约 aa729至大约aa738，大约 aa730至大约aa739，大约 aa731至大约aa740，大约 aa732至大约aa741，大约 aa733至大约aa742，大约 aa734至大约aa743，大约 aa735至大约aa744，大约 aa736至大约aa745，大约 aa737至大约aa746，大约 aa738至大约aa747，大约 aa739至大约aa748，大约 aa740至大约aa749，大约 aa741至大约aa750，大约 aa742至大约aa751，大约 aa743至大约aa752，大约 aa744至大约aa753，大约 aa745至大约aa754，大约 aa746至大约aa755，大约 aa747至大约aa756，大约 aa748至大约aa757，大约 aa749至大约aa758，大约 aa750至大约aa759，大约 aa751至大约aa760，大约 aa752至大约aa761，大约 aa753至大约aa762，大约 aa754
至大约aa763，大约 aa755至大约aa764，大约 aa756至大约aa765，大约 aa757至大约aa766，大约 aa758至大约aa767，大约 aa759至大约aa768，大约 aa760至大约aa769，大约 aa761至大约aa770，大约 aa762至大约aa771，大约 aa763至大约aa472，大约 aa764至大约aa773，大约 aa765至大约aa774，大约 aa766至大约aa775，大约 aa767至大约aa776，大约 aa768至大约aa777，大约 aa769至大约aa778，大约 aa770至大约aa779，大约 aa772至大约aa780，大约 aa772至大约aa781，大约 aa773至大约aa782，大约 aa774至大约aa783，大约 aa775至大约 aa784，大约 aa776至大约aa785，大约 aa777至大约aa786，大约 aa778至大约aa787，大约 aa779至大约aa788，大约 aa780至大约aa789，大约 aa781至大约aa790，大约 aa782至大约aa791，大约 aa783至大约aa792，大约 aa784至大约aa793，大约 aa785至大约aa794，大约 aa786至大约aa795，大约 aa787至大约aa796，大约 aa788至大约aa797，大约 aa789至大约aa798，大约 aa790至大约aa799，大约 aa791至大约aa800，大约 aa792至大约aa802，大约 aa793至大约aa802，大约 aa794至大约aa803，大约 aa795至大约aa804，大约 aa796至大约aa805，大约 aa797至大约aa806，大约 aa798至大约aa807，大约 aa799至大约aa808，大约 aa800至大约aa809，大约 aa801至大约aa810，大约 aa802至大约aa811，大约 aa803至大约aa812，大约aa804至大约aa813，大约 aa805至大约aa814，大约 aa806至大约aa815，大约 aa807至大约aa816，大约 aa808至大约aa817，大约 aa809至大约aa818，大约 aa810至大约aa819，大约 aa811至大约aa820，大约 aa612至大约aa821，大约 aa813至大约aa822，大约aa814至大约aa823，大约 aa815至大约aa824，大约 aa816至大约aa825，大约 aa817至大约aa826，大约 aa818至大约aa827，大约 aa819至大约aa828，大约 aa820至大约aa829，大约 aa821至大约aa830，大约 aa822至大约aa831，大约 aa823至大约aa832，大约 aa824至大约aa833，大约 aa825至大约aa834，大约 aa826至大约aa835，大约 aa827至大约aa836，大约 aa828至大约aa837，大约 aa829至大约aa838，大约 aa830至大约aa839，大约 aa831至大约aa840，大约 aa832至大约aa841，大约 aa833至大约aa842，大约 aa834至大约aa843，大约 aa835至大约aa844，大约 aa836至大约aa845，大约 aa837至大约aa846，大约 aa838至大约aa847，大约 aa839至大约aa848，大约 aa840至大约aa849，大约 aa841至大约aa850，大约 aa842至大约aa851，大约 aa843至大约aa852，大约 aa844至大约aa853，大约 aa845至大约aa854，大约 aa846至大约aa855，大约 aa847至大约aa856，大约 aa848至大约aa854，大约 aa849至大约aa858，大约 aa850至大约aa859，大约 aa851至大约aa860，大约 aa852至大约aa861，大约 aa853至大约aa862，大约 aa854至大约aa863，大约 aa855至大约aa864，大约 aa856至大约aa865，大约 aa857至大约aa866，大约 aa858至大约aa867，大约 aa859至大约aa868，大约 aa860至大约aa869，大约 aa861至大约aa870，大约 aa862至大约aa871，大约 aa863至大约aa872，大约 aa864至大约aa873，大约 aa865至大约aa874，大约 aa866至大约aa875，大约 aa867至大约aa876，大约 aa868至大约aa877，大约 aa869至大约aa878，大约 aa870至大约aa879，大约 aa871至大约aa880，大约 aa872至大约aa881，大约 aa873至大约aa882，大约 aa874至大约aa883，大约 aa875至大约aa884，大约 aa876至大约aa885，大约 aa877至大约aa886，大约 aa878至大约aa887，大约 aa879至大约aa888，大约 aa880至大约aa889，大约 aa881至大约aa890，大约 aa882至大约aa891，大约 aa883至大约aa892，大约 aa884至大约aa893，大约 aa885至大约aa894，大约 aa886至大约aa895，大约 aa887至大约aa896，大约 aa888至大约aa897，大约 aa889至大约aa898，大约 aa890至大约aa899，大约 aa891至大约aa900，大约 aa892至大约aa901，大约 aa893至大约aa902，大约 aa894至大约aa903，大约 aa895至大约aa904，大约 aa896至大约aa905，大约 aa897至大约aa906，大约 aa898至大约aa907，大约 aa899至大约aa908，大约 aa900至大约aa909，大约 aa901至大约aa910，大约 aa902至大约aa911，大约 aa903至大约aa912，大约 aa904至大约aa913，大约 aa905至大约aa914，大约 aa906至大约aa915，大约 aa907至大约aa916，大约 aa908至大约aa917，大约 aa909至大约aa916，大约 aa910至大约aa919，大约 aa911至大约aa920，大约 aa912至大约aa921，大约 aa913至大约aa922，大约 aa914至大约aa923，大约 aa915至大约aa924，大约 aa916至大约aa925，大约 aa917至大约aa926，大约 aa918至大约aa927，大约 aa919至大约aa928，大约 aa920至大约aa929，大约 aa921至大约aa930，大约 aa922至大约aa931，大约 aa923至大约aa932，大约 aa924至大约aa933，大约 aa925至大约aa934，大约 aa926至大约aa935，大约 aa927至大约aa936，大约 aa928至大约aa937，大约 aa929至大约aa938，大约 aa930至大约aa939，大约 aa931至大约aa940，大约 aa932至大约aa941，大约 aa933至大约aa942，大约 aa934至大约aa943，大约 aa935至大约aa944，大约 aa936至大约aa945，大约 aa937至大约aa946，大约 aa938至大约aa947，大约 aa939至大约aa948，大约 aa940至大约aa949，大约 aa941至大约aa950，大约 aa942至大约aa951，大约 aa943至大约aa952，大约 aa944至大约aa953，大约 aa945至大约aa954，大约 aa946至大约aa955，大约 aa947至大约aa956，大约 aa948至大约aa957，大约 aa949至大约aa958，大约 aa950至大约aa959，大约 aa951至大约aa960，大约 aa952至大约aa961，大约 aa953至大约aa962，大约 aa954至大约aa963，大约 aa955至大约aa964，大约 aa956至大约aa965，大约 aa957至大约aa966，大约 aa958至大约aa967，大约 aa959至大约aa968，大约 aa960至大约aa969，大约 aa961至大约aa970，大约 aa962至大约aa971，大约 aa963至大约aa972，大约 aa964至大约aa973，大约 aa965至大约aa974，大约 aa966至大约aa975，大约 aa967至大约aa976，大约 aa968至大约aa977，大约 aa969至大约aa978，大约 aa970至大约aa979，大约 aa971至大约aa980，大约 aa972至大约aa981，大约 aa973至大约aa982，大约 aa974至大约aa983，大约 aa975至大约aa984，大约 aa976至大约aa985，大约 aa977至大约aa986，大约 aa978至大约aa987，大约 aa949至大约aa988，大约 aa980至大约aa989，大约 aa981至大约aa990，大约 aa982至大约aa991，大约 aa983至大约aa992，大约 aa984至大约aa993，大约 aa985至大约aa994，大约 aa986至大约aa995，大约 aa987至大约aa996，大约 aa988至大约aa997，大约 aa989至大约aa998，大约 aa990至大约aa999，大约 aa991至大约aa1000，大约aa992至大约aa1001，大约 aa998至大约 aa1002，大约 aa994至大约aa1003，大约 aa995至大约aa1004，大约 aa996至大约aa1005，大约 aa997至大约aa1006，大约 aa998至大约aa1007，大约 aa999至大约aa1008，大约 aa1000至大约aa1009，大约aa1001至大约aa1010，大约 aa1002至大约aa1011，大约 aa1003至大约aa1012，大约 aa1004至大约aa1013，大约 aa1005至大约aa1014，大约 aa1006至大约aa1015，大约 aa1007至大约 aa1016，大约 aa1008至大约aa1017，大约 aa1009至大约aa1018，大约aa1010至大约 aa1019，大约 aa1011至大约aa1020，大约 aa1012至大约aa1021，大约 aa1013至大约aa1022，大约 aa1014至大约aa1023，大约 aa1015至大约aa1024，大约 aa1016至大约 aa1025，大约 aa1017至大约aa1026，大约 aa1018至大约aa1027，大约aa1019至大约aa1028，大约 aa1020至大约aa1029，大约 aa1021至大约aa1030，大约 aa1022至大约aa1031，大约 aa1023至大约aa1032，大约 aa1024至大约aa1033，大约 aa1025至大约 aa1034，大约 aa1026至大约aa1035，大约 aa1027至大约aa1036，大约aa1028至大约aa1037，大约 aa1029至大约aa1038，大约 aa1030至大约aa1039，大约 aa1031至大约aa1040，大约 aa1032至大约aa1041，大约 aa1033至大约aa1042，大约 aa1034至大约 aa1043，大约 aa1035至大约aa1044，大约 aa1036至大约aa1045，大约aa1037至大约 aa1046，大约 aa1038至大约aa1047，大约 aa1039至大约aa1048，大约 aa1040至大约aa1049，大约 aa1041至大约aa1050，大约 aa1042至大约aa1051，大约 aa1043至大约 aa1052，大约 aa1044至大约aa1053，大约 aa1045至大约aa1054，大约aa1046至大约aa1055，大约 aa1047至大约 aa1056，大约 aa1048至大约aa1057，大约 aa1049至大约aa1058，大约 aa1050至大约aa1059，大约 aa1051至大约aa1060，大约 aa1052至大约aa1061，大约 aa1053至大约aa1062，大约 aa1054至大约aa1063，大约aa1055至大约aa1064，大约 aa1056至大约aa1065，大约 aa1057至大约aa1046，大约 aa1058至大约aa1067，大约 aa1059至大约aa1068，大约 aa1060至大约aa1069，大约 aa1061至大约aa1070，大约 aa1062至大约aa1071，大约 aa1063至大约aa1072，大约aa1064至大约aa1073，大约 aa1065至大约aa1074，大约 aa1066至大约aa1075，大约 aa1067至大约aa1076，大约 aa1068至大约aa1077，大约 aa1069至大约aa1078，大约 aa1070至大约aa1079，大约 aa1071至大约aa1080，大约 aa1072至大约aa1081，大约aa1073至大约aa1082，大约 aa1074至大约aa1083，大约 aa1075至大约aa1084，大约 aa1076至大约aa1085，大约 aa1077至大约aa1086，大约 aa1078至大约aa1087，大约 aa1079至大约 aa1088，大约 aa1080至大约aa1089，大约 aa1081至大约aa1090，大约aa1082至大约aa1091，大约 aa1083至大约aa1092，大约 aa1084至大约aa1093，大约 aa1085至大约aa1094，大约 aa1086至大约aa1095，大约 aa1087至大约aa1096，大约 aa1088至大约aa1097，大约 aa1089至大约aa1098，大约 aa1090至大约aa1099，大约aa1091至大约aa1100，大约 aa1092至大约aa1101，大约 aa1093至大约aa1102，大约 aa1094至大约aa1103，大约 aa1095至大约aa1104，大约 aa1096至大约aa1105，大约 aa1097至大约 aa1106，大约 aa1098至大约aa1107，大约 aa1099至大约aa1108，大约aa1100至大约aa1109，大约 aa1101至大约aa1110，大约 aa1102至大约aa1111，大约 aa1103至大约aa1112，大约 aa1104至大约aa1113，大约 aa1105至大约aa1114，大约 aa1106至大约 aa1115，大约 aa1107至大约aa1116，大约 aa1108至大约aa1117，大约aa1109至大约aa1118，大约 aa1110至大约aa1119，大约 aa1111至大约aa1120，大约 aa1112至大约aa1121，大约 aa1113至大约aa1122，大约 aa1114至大约aa1123，大约 aa1115至大约 aa1124，大约 aa1116至大约aa1125，大约 aa1117至大约aa1126，大约aa1118至大约aa1127，大约 aa1119至大约aa1128，大约 aa1120至大约aa1129，大约 aa1121至大约aa1130，大约 aa1122至大约aa1131，大约 aa1123至大约aa1132，大约 aa1124至大约 aa133，大约 aa1125至大约aa1134，大约 aa1126至大约aa1135，大约aa1127至大约aa1136，大约 aa1128至大约aa1137，大约 aa1129至大约aa1138，大约 aa1130至大约aa1139，大约 aa1131至大约aa1140，大约 aa1132至大约aa1141，大约 aa1133至大约 aa1142，大约 aa1134至大约aa1143，大约 aa1135至大约aa1144，大约aa1136至大约aa1145，大约 aa1137至大约aa1146，大约 aa1138至大约aa1147，大约 aa1139至大约aa1148，大约 aa1140至大约aa1149，大约 aa1141至大约aa1150，大约 aa1142至大约 aa1151，大约 aa1143至大约aa1152，大约 aa1144至大约aa1153，大约aa1145至大约aa1154，大约 aa1146至大约aa1155，大约 aa1147至大约aa1156，大约 aa1148至大约aa1157，大约 aa1149至大约aa1158，大约 aa1150至大约aa1159，大约 aa1151至大约aa1160，大约aa1152至大约aa1161，大约 aa1153至大约aa1162，大约aa1154至大约aa1163，大约 aa1155至大约aa1164，大约 aa1156至大约aa1165，大约 aa1157至大约aa1166，大约 aa1158至大约aa1167，大约 aa1159至大约aa1168，大约 aa1160至大约aa1169，大约 aa1161至大约aa1170，大约 aa1162至大约aa1171，大约aa1163至大约aa1172，大约 aa1164至大约aa1173，大约 aa1165至大约aa1174，大约 aa1166至大约aa1175，大约 aa1167至大约aa1176，大约 aa1168至大约aa1177，大约 aa1169至大约aa1178，大约 aa1170至大约aa1179，大约 aa1171至大约aa1180，大约aa1172至大约aa1181，大约 aa1173至大约aa1182，大约 aa1174至大约aa1183，大约 aa1175至大约aa1184，大约 aa1176至大约aa1185，大约 aa1177至大约aa1186，大约 aa1148至大约aa1187，大约 aa1179至大约aa1188，大约 aa1180至大约aa1189，大约aa1181至大约aa1190，大约 aa1182至大约aa1191，大约 aa1183至大约aa1192，大约 aa1184至大约aa1193，大约 aa1185至大约aa1194，大约 aa1186至大约aa1195，大约 aa1187至大约aa1196，大约 aa1188至大约aa1197，大约 aa1189至大约aa1198，大约aa1190至大约aa1199，大约 aa1191至大约aa1200，大约 aa1192至大约aa1201，大约 aa1193至大约aa1202，大约 aa1194至大约aa1203，大约 aa1195至大约aa1204，大约 aa1196至大约aa1205，大约 aa1197至大约aa1206，大约 aa1198至大约aa1207，大约aa1199至大约aa1208，大约 aa1200至大约aa1209，大约 aa1201至大约aa1210，大约 aa1202至大约aa1211，大约 aa1203至大约aa1212，大约 aa1204至大约aa1213，大约 aa1205至大约aa1214，大约 aa1206至大约aa1215，大约 aa1207至大约aa1216，大约aa1208至大约aa1217，大约aa1209至大约aa1218，大约 aa1210至大约aa1219，大约 aa1211至大约aa1220，大约 aa1212至大约aa1221，大约 aa1213至大约aa1222，大约 aa1214至大约aa1223，大约 aa1215至大约aa1224，大约 aa1216至大约aa1225，大约aa1217至大约aa1226，大约 aa1218至大约aa1227，大约 aa1219至大约aa1228，大约 aa1220至大约 aa1229，大约 aa1221至大约aa1230，大约 aa1222至大约aa1231，大约 aa1223至大约aa1232，大约 aa1224至大约aa1233，大约 aa1225至大约aa1234，大约aa1226至大约aa1235，大约 aa1227至大约aa1236，大约 aa1228至大约aa1237，大约 aa1229至大约aa1238，大约aa1230至大约aa1239，大约 aa1231至大约aa1240，大约 aa1232至大约aa1241，大约 aa1233至大约aa1242，大约 aa1234至大约aa1243，大约aa1235至大约aa1244，大约 aa1236至大约aa1245，大约 aa1237至大约aa1246，大约 aa1238至大约aa1247，大约 aa1239至大约aa1248，大约 aa1240至大约aa1249，大约 aa1241至大约aa1250，大约 aa1242至大约aa1251，大约 aa1243至大约aa1252，大约aa1244至大约aa1253，大约 aa1245至大约aa1254，大约 aa1246至大约aa1255，大约 aa1247至大约aa1256，大约 aa1248至大约aa1257，大约 aa1249至大约aa1258，大约 aa1250至大约aa1259，大约 aa1251至大约aa1260，大约 aa1252至大约aa1261，大约aa1253至大约aa1262，大约 aa1254至大约aa1263，大约 aa1255至大约aa1264，大约 aa1256至大约aa1265，大约 aa1257至大约aa1266，大约 aa1258至大约aa1267，大约 aa1259至大约aa1268，大约 aa1260至大约aa1269，大约 aa1261至大约aa1270，大约aa1262至大约aa1271，大约 aa1263至大约aa1272，大约 aa1264至大约aa1273，大约 aa1265至大约aa1274，大约 aa1256至大约aa1245，大约 aa1267至大约aa1276，大约 aa1268至大约aa1277，大约 aa1269至大约aa1278，大约 aa1270至大约aa1279，大约aa1271至大约aa1280，大约 aa1272至大约aa1281，大约 aa1273至大约aa1282，大约 aa1274至大约aa1283，大约 aa1275至大约aa1284，大约 aa1276至大约aa1285，大约 aa1277至大约aa1286，大约 aa1278至大约aa1287，大约 aa1279至大约aa1288，大约aa1280至大约aa1289，大约 aa1281至大约aa1290，大约 aa1282至大约aa1291，大约 aa1283至大约aa1292，大约 aa1284至大约aa1293，大约 aa1285至大约aa1294，大约 aa1286至大约aa1295，大约 aa1287至大约aa1296，大约 aa1288至大约aa1297，大约aa1289至大约aa1298，大约 aa1290至大约aa1299，大约 aa1291至大约aa1300，大约 aa1292至大约aa1301，大约 aa1293至大约aa1302，大约 aa1294至大约aa1303，大约 aa1295至大约aa1304，大约 aa1296至大约aa1305，大约 aa1297至大约aa1306，大约aa1298至大约aa1307，大约 aa1299至大约aa1308，大约 aa1300至大约aa1309，大约 aa1301至大约aa1310，大约 aa1302至大约aa1311，大约 aa1303至大约aa1312，大约 aa1304至大约aa1313，大约 aa1305至大约aa1314，大约 aa1306至大约aa1315，大约aa1307至大约aa1316，大约 aa1308至大约aa1317，大约 aa1309至大约aa1318，大约 aa1310至大约aa1319，大约aa1311至大约aa1320，大约 aa1312至大约aa1321，大约 aa1313至大约aa1322，大约aa1314至大约aa1323，大约 aa1315至大约aa1324，大约aa1316至大约aa1325，大约 aa1317至大约aa1326，大约 aa1318至大约aa1327，大约 aa1319至大约aa1328，大约 aa1320至大约aa1329，大约aa1321至大约aa1330，大约 aa1322至大约aa1331，大约aa1323至大约aa1332，大约 aa1324至大约aa1333，大约aa1325至大约aa1334，大约 aa1326至大约aa1335，大约 aa1327至大约aa1336，大约 aa1328至大约aa1337，大约aa1329至大约aa1338，大约aa1330至大约aa1339，大约 aa1331至大约aa1340，大约 aa1332至大约aa1341，大约 aa1333至大约aa1342，大约aa1334至大约aa1343，大约 aa1335至大约aa1344，大约 aa1336至大约aa1345，大约 aa1337至大约aa1346，大约 aa1338至大约aa1347，大约 aa1339至大约aa1348，大约 aa1340至大约aa1349，大约 aa1341至大约aa1350，大约 aa1342至大约aa1351，大约aa1343至大约aa1352，大约 aa1344至大约aa1353，大约 aa1345至大约aa1354，大约 aa1346至大约aa1355，大约 aa1347至大约aa1356，大约 aa1348至大约aa1357，大约 aa1349至大约aa1358，大约 aa1350至大约aa1359，大约 aa1351至大约aa1360，大约aa1352至大约aa1361，大约 aa1353至大约aa1362，大约 aa1354至大约aa1363，大约 aa1355至大约aa1364，大约 aa1356至大约aa1365，大约 aa1357至大约aa1366，大约 aa1358至大约aa1367，大约 aa1359至大约aa1368，大约 aa1360至大约aa1369，大约aa1361至大约aa1370，大约 aa1362至大约aa1341，大约 aa1363至大约aa1372，大约 aa1364至大约aa1373，大约 aa1365至大约aa1374，大约 aa1366至大约aa1375，大约 aa1367至大约aa1376，大约 aa1368至大约aa1377，大约 aa1369至大约aa1378，大约aa1370至大约aa1379，大约 aa1371至大约aa1380，大约 aa1372至大约aa1381，大约 aa1343至大约aa1382， 大约 aa1374至大约aa1383，大约 aa1375至大约aa1384，大约 aa1376至大约aa1385，大约 aa1377至大约aa1386，大约 aa1378至大约aa1387，大约aa1379至大约aa1388，大约 aa1380至大约aa1389，大约 aa1381至大约aa1390，大约 aa1382至大约aa1391，大约 aa1383至大约aa1392，大约 aa1384至大约aa1393，大约 aa1385至大约aa1394，大约 aa1386至大约aa1395，大约 aa1387至大约aa1396，大约aa1388至大约aa1397，大约 aa1389至大约aa1398，大约 aa1390至大约aa1399，大约 aa1391至大约aa1400，大约 aa1392至大约aa1401，大约 aa1393至大约aa1402，大约 aa1394至大约aa1402，大约 aa1395至大约aa1404，大约 aa1396至大约aa1405，大约aa1397至大约aa1406，大约 aa1398至大约aa1407，大约 aa1399至大约aa1408，大约 aa1400至大约aa1409，大约 aa1401至大约aa1410，大约 aa1402至大约aa1411，大约 aa1403至大约aa1412，大约 aa1404至大约aa1413，大约 aa1405至大约aa1414，大约aa1406至大约aa1415，大约 aa1407至大约aa1416，大约 aa1408至大约aa1417，大约 aa1409至大约aa1418，大约 aa1410至大约aa1418，大约 aa1411至大约aa1420，大约 aa1412至大约aa1421，大约 aa1413至大约aa1422，大约 aa1414至大约aa1423，大约aa1415至大约aa1424，大约 aa1416至大约aa1425，大约 aa1417至大约aa1426，大约 aa1418至大约aa1427，大约 aa1419至大约aa1428，大约 aa1420至大约aa1429，大约 aa1421至大约aa1430，大约 aa1422至大约aa1431，大约 aa1423至大约aa1432，大约aa1424至大约aa1433，大约 aa1425至大约aa1434，大约 aa1426至大约aa1435，大约 aa1427至大约aa1436，大约 aa1428至大约aa1437，大约 aa1429至大约aa1438，大约 aa1430至大约aa1439，大约 aa1431至大约aa1440，大约 aa1432至大约aa1441，大约aa1433至大约aa1442，大约 aa1434至大约aa1443，大约 aa1435至大约aa1444，大约 aa1436至大约aa1445，大约 aa1437至大约aa1446，大约 aa1438至大约aa1447，大约 aa1439至大约aa1448，大约 aa1440至大约aa1449，大约 aa1441至大约aa1450，大约aa1442至大约aa1451，大约 aa1443至大约aa1452，大约 aa1444至大约aa1453，大约 aa1445至大约aa1454，大约 aa1446至大约aa1455，大约 aa1447至大约aa1456，大约 aa1446至大约aa1457，大约 aa1449至大约aa1458，大约 aa1450至大约aa1459，大约aa1451至大约aa1460，大约 aa1452至大约aa1461，大约 aa1453至大约aa1462，大约 aa1454至大约aa1463，大约 aa1455至大约aa1464，大约 aa1456至大约aa1465，大约 aa1457至大约aa1466，大约 aa1458至大约aa1467，大约 aa1459至大约aa1468，大约aa1460至大约aa1469，大约 aa1461至大约aa1470，大约 aa1462至大约aa1471，大约 aa1463至大约aa1472，大约 aa1464至大约aa1473，大约 aa1465至大约aa1474，大约 aa1466至大约aa1475，大约 aa1467至大约aa1476，大约 aa1468至大约aa1477，大约aa1469至大约aa1478，大约 aa1470至大约aa1479，大约 aa1471至大约aa1480，大约 aa1472至大约aa1481，大约 aa1473至大约aa1482，大约 aa1474至大约aa1483，大约 aa1475至大约aa1484，大约 aa1476至大约aa1485，大约 aa1477至大约aa1486，大约aa1478至大约aa1487，大约 aa1479至大约aa1488，大约 aa1480至大约aa1489，大约 aa1481至大约aa1490，大约 aa1482至大约aa1491，大约 aa1483至大约aa1492，大约 aa1484至大约aa1493，大约 aa1485至大约aa1494，大约 aa1486至大约aa1495，大约aa1497至大约aa1496，大约 aa1488至大约aa1497，大约 aa1489至大约aa1498，大约 aa1490至大约aa1499，大约 aa1491至大约aa1500，大约 aa1492至大约aa1501，大约 aa1493至大约aa1502，大约 aa1494至大约aa1503，大约 aa1495至大约aa1504，大约aa1496至大约aa1505，大约 aa1497至大约aa1506，大约 aa1498至大约aa1507，大约 aa1499至大约aa1508，大约 aa1500至大约aa1509，大约 aa1501至大约aa1510，大约 aa1502至大约aa1511，大约 aa1503至大约aa1512，大约 aa1504至大约aa1513，大约aa1505至大约aa1514，大约 aa1506至大约 aa1515，大约 aa1507至大约aa1516，大约 aa1508至大约aa1517，大约 aa1509至大约aa1518，大约 aa1510至大约aa1519，大约 aa1511至大约aa1520，大约 aa1512至大约aa1521，大约 aa1513至大约aa1522，大约aa1514至大约aa1523，大约 aa1515至大约 aa1524，大约 aa1516至大约aa1525，大约 aa1517至大约aa1526，大约 aa1518至大约aa1527，大约 aa1519至大约aa1528，大约 aa1520至大约aa1529，大约 aa1521至大约aa1530，大约 aa1522至大约aa1531，大约aa1523至大约aa1532，大约 aa1524至大约aa1523，大约 aa1525至大约aa1534，大约 aa1526至大约aa1535，大约 aa1527至大约aa1536，大约 aa1528至大约aa1537，大约 aa1529至大约aa1538，大约 aa1530至大约aa1539，大约 aa1531至大约aa1540，大约aa1532至大约aa1541，大约 aa1533至大约aa1542，大约 aa1534至大约aa1543，大约 aa1535至大约aa1544，大约 aa1536至大约aa1545，大约 aa1537至大约aa1546，大约 aa1538至大约aa1547，大约 aa1539至大约aa1548，大约 aa1540至大约aa1549，大约aa1541至大约aa1550，大约 aa1542至大约aa1551，大约 aa1543至大约aa1552，大约 aa1544至大约aa1553，大约 aa1545至大约aa1554，大约 aa1546至大约aa1555，大约 aa1547至大约aa1556，大约 aa1548至大约aa1557，大约 aa1549至大约aa1558，大约aa1550至大约aa1559，大约 aa1551至大约aa1560，大约 aa1552至大约aa1561，大约 aa1553至大约aa1562，大约 aa1554至大约aa1563，大约 aa1555至大约aa1564，大约 aa1556至大约aa1565，大约 aa1557至大约aa1566，大约 aa1558至大约aa1567，大约aa1559至大约aa1568，大约 aa1560至大约aa1569，大约 aa1561至大约aa1570，大约 aa1562至大约aa1571，大约 aa1563至大约aa1572，大约 aa1564至大约aa1573，大约 aa1565至大约aa1574，大约 aa1566至大约aa1575，大约 aa1567至大约aa1576，大约aa1568至大约aa1577，大约 aa1569至大约aa1578，大约 aa1570至大约aa1579，大约 aa1571至大约aa1580，大约 aa1572至大约aa1581，大约 aa1573至大约aa1582，大约 aa1574至大约aa1583，大约 aa1575至大约aa1584，大约 aa1576至大约aa1585，大约aa1577至大约aa1586，大约 aa1578至大约aa1587，大约 aa1579至大约aa1588，大约 aa1580至大约aa1589，大约 aa1581至大约aa1590，大约 aa1582至大约aa1591，大约 aa1583至大约aa1592，大约 aa1584至大约aa1593，大约 aa1585至大约aa1594，大约aa1586至大约aa1595，大约aa1587至大约aa1596，大约 aa1588至大约aa1597，大约 aa1589至大约aa1598，大约 aa1590至大约aa1599，大约 aa1591至大约aa1600，大约 aa1592至大约aa1601，大约 aa1593至大约aa1602，大约 aa1594至大约aa1603，大约aa1595至大约aa1604，大约 aa1596至大约aa1605，大约 aa1597至大约aa1606，大约 aa1598至大约aa1604，大约 aa1599至大约aa1608，大约 aa1600至大约aa1609，大约 aa1601至大约aa1610，大约 aa1602至大约aa1611，大约 aa1603至大约aa1612，大约aa1604至大约aa1613，大约 aa1605至大约aa1614，大约 aa1606至大约aa1615，大约 aa1607至大约aa1616，大约 aa1608至大约aa1617，大约 aa1609至大约aa1618，大约 aa1610至大约aa1619，大约 aa1611至大约aa1620，大约 aa1612至大约aa1621，大约aa1613至大约aa1622，大约 aa1614至大约aa1623，大约 aa1615至大约aa1624，大约 aa1616至大约aa1625，大约 aa1617至大约aa1626，大约 aa1618至大约aa1627，大约 aa1619至大约aa1628，大约 aa1620至大约aa1629，大约 aa1621至大约aa1630，大约aa1622至大约aa1632，大约 aa1623至大约aa1632，大约 aa1624至大约aa1633，大约 aa1625至大约aa1634，大约 aa1626至大约aa1635，大约 aa1627至大约aa1636，大约 aa1628至大约aa1637，大约 aa1629至大约aa1638，大约 aa1630至大约aa1639，大约aa1631至大约aa1640，大约 aa1632至大约aa1641，大约 aa1633至大约aa1642，大约 aa1634至大约aa1643，大约 aa1635至大约aa1644，大约 aa1636至大约aa1645，大约 aa1637至大约aa1646，大约 aa1638至大约aa1647，大约 aa1639至大约aa1648，大约aa1640至大约aa1649，大约 aa1641至大约aa1650，大约 aa1642至大约aa1651，大约 aa1643至大约aa1652，大约 aa1644至大约aa1653，大约 aa1645至大约aa1654，大约 aa1646至大约aa1655，大约 aa1647至大约aa1656，大约 aa1648至大约aa1657，大约aa1649至大约aa1658，大约 aa1650至大约aa1659，大约 aa1651至大约aa1660，大约 aa1652至大约aa1661，大约 aa1653至大约aa1662，大约 aa1654至大约aa1663，大约 aa1655至大约aa1664，大约 aa1656至大约aa1665，大约 aa1657至大约aa1666，大约aa1658至大约aa1667，大约 aa1659至大约 aa1668，大约 aa1660至大约aa1669，大约 aa1661至大约aa1670，大约 aa1662至大约aa1671，大约 aa1663至大约aa1672，大约 aa1664至大约aa1673，大约 aa1665至大约aa1674，大约 aa1666至大约aa1675，大约aa1667至大约aa1676，大约 aa1668至大约aa1677，大约 aa1669至大约aa1678，大约 aa1670至大约aa1679，大约 aa1671至大约aa1680，大约 aa1672至大约aa1681，大约 aa1673至大约aa1682，大约 aa1674至大约aa1683，大约 aa1675至大约aa1684，大约aa1676至大约aa1685，大约 aa1677至大约aa1686，大约 aa1678至大约aa1687，大约 aa1679至大约aa1688，大约 aa1680至大约aa1689，大约 aa1681至大约aa1690，大约 aa1682至大约aa1691，大约 aa1683至大约aa1692，大约 aa1684至大约aa1693，大约aa1685至大约aa1694，大约 aa1686至大约aa1695，大约 aa1687至大约aa1696，大约 aa1688至大约aa1697，大约 aa1689至大约aa1698，大约 aa1690至大约aa1699，大约 aa1691至大约aa1700，大约 aa1692至大约aa1701，大约 aa1693至大约aa1702，大约aa1694至大约aa1703，大约 aa1695至大约aa1704，大约 aa1696至大约aa1705，大约 aa1697至大约aa1706，大约 aa1698至大约aa1707，大约 aa1699至大约aa1708，大约 aa1700至大约aa1709，大约 aa1701至大约aa1710，大约 aa1702至大约aa1711，大约aa1703至大约aa1712，大约 aa1704至大约aa1713，大约 aa1705至大约aa1714，大约 aa1706至大约aa1715，大约 aa1707至大约aa1716，大约 aa1708至大约aa1717，大约 aa1709至大约aa1718，大约 aa1710至大约aa1719，大约 aa1711至大约aa1720，大约aa1712至大约aa1721，大约 aa1713至大约aa1722，大约 aa1714至大约aa1723，大约 aa1715至大约aa1724，大约 aa1716至大约aa1725，大约 aa1717至大约aa1726，大约 aa1718至大约aa1727，大约 aa1719至大约aa1728，大约 aa1720至大约aa1729，大约aa1721至大约aa1730，大约 aa1722至大约aa1731，大约 aa1723至大约aa1732，大约 aa1724至大约aa1733，大约 aa1725至大约aa1734，大约 aa1726至大约aa1735，大约 aa1727至大约aa1736，大约 aa1728至大约aa1737，大约 aa1729至大约aa1738，大约aa1730至大约aa1739，大约 aa1731至大约aa1740，大约 aa1732至大约aa1741，大约 aa1733至大约aa1742，大约 aa1734至大约aa1743，大约 aa1735至大约aa1744，大约 aa1736至大约aa1745，大约 aa1737至大约aa1746，大约 aa1738至大约aa1447，大约aa1739至大约aa1748，大约 aa1740至大约aa1749，大约 aa1741至大约aa1750，大约 aa1742至大约aa1751，大约 aa1743至大约aa1752，大约 aa1744至大约aa1753，大约 aa1745至大约aa1754，大约 aa1746至大约aa1755。
在另一个实施例中，图2中所示的、可用于本发明组合物的肽的抗原性部分具有选自大约aax至大约aay的氨基酸序列，其中aax表示大约从SEQ ID NO:2的1号氨基酸至大约1750号氨基酸，aay是SEQID N0:2的约x+5号氨基酸，即一个选自含有如下氨基酸序列的氨基酸序列从SEQ ID NO:2的约aa1至约aa6，约aa2至约aa7，约aa3至约aa8，约aa4至约aa9，约aa5至约aa10，以及等等，直至约aa1749至约aa1754和约aa1750至约aa1755。
此外，本发明还包括在功能上与上面介绍的MMTV肽或由上文介绍的核酸分子编码的MMTV肽等价的肽类似物，这种功能等价由多种标准进行判断，包括但不限于，等价的肽被一种MMTV反应性抗体识别的能力。这种等价MMTV肽可在氨基酸序列中含有氨基酸残基的删除、添加或取代，但它们产生一种静默改变，从而产生一种在功能上等价的MMTV肽。氨基酸取代可根据所涉及残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性本质来进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。用于此处，“功能上等价”是指一种蛋白质能被MMTV肽反应性抗体识别。
虽然(使用本领域技术人员熟知的随机诱变技术)可以对MMTV核苷酸序列进行随机突变，并对所产生的MMTV编码肽进行活性检测，但可以用遗传工程的方法对MMTV的编码序列进行位点特异性诱变(使用本领域技术人员熟知的位点特异性诱变技术)，制备具有提高的功能的突变MMTV肽，例如产生提高的表达或抗原性。
用于本发明的免疫调节组合物的MMTV肽是基本上纯的或均一的。当一种样品显示至少60至75％为单一一种肽序列时，该样品被认为是基本上纯的。一种基本上纯的肽应优选含有60至90％的一种肽样品，更优选约95％，最优选99％。本领域的技术人员熟知的方法可用于测定纯度或均一性，例如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并接着在染色后的胶上观察到一条单一肽条带。此外，还可使用HPLC或本领域熟知的其他类似方法获得解决方案。通常参见Sambrook等，1989，《分子克隆实验手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和Ausubel等(编辑)，1989，《当代分子生物学方法》Ⅰ卷，Green PublishingAssociates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York。
本发明包括MMTV肽在免疫调节组合物中的应用，MMTV肽通常纯化自表达了编码MMTV肽的重组核苷酸序列的宿主细胞。这种蛋白纯化可通过本领域熟知的各种方法来完成。在一个实施方案中，本发明的MMTV肽以与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白形式表达，所产生的重组融合蛋白通过亲和层析进行纯化，并且将MMTV肽结构域从异源半分子中切割下来，产生一种基本上纯的MMTV肽样品。其他方法也可以使用，例如参见《酶学方法》1990,Academic Press,Inc.,San Diego；《蛋白纯化，原理和实践》，1982,Springer-Verlag,New York中介绍的技术。
5.2．MMTV核酸本发明还包括编码至少一种MMTV肽或其免疫原性或抗原性部分以及这种肽或部分的类似物的核酸分子，和具有一个代表至少一个MMTV的不连续表位的氨基酸分子的肽及其在本发明的免疫调节组合物中的应用。本发明的核酸分子包括如下(1)具有一个包含图1(SEQ IDNO:1)中所示核苷酸序列或其至少18个连续核苷酸的部分的核苷酸序列的分子；(2)任何含有一个编码能与抗MMTV肽抗体进行免疫反应的肽的核苷酸序列的核酸分子；(3)任何含有一个编码如下一种肽的核苷酸序列的核酸分子，这种肽包含图2-6(SEQ ID NO:2-6)中任何一个所示的氨基酸序列或其至少6个连续氨基酸的部分；(4)任何含有一个编码至少一个MMTV的不连续表位的核苷酸序列的核酸分子；(5)任何含有如下一种核苷酸序列的核酸分子，这种核苷酸序列可与图1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的互补物在高度严谨条件下杂交，例如在0.5M NaHPO4,7％十二烷基磺酸钠(SDS),1mM EDTA中在65℃与滤膜结合的DNA杂交，并在0.1×SSC/0.1％的SDS中在68℃进行洗涤(Ausubel等编辑，1989，《当代分子生物学方法》Ⅰ卷，Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons，Inc.,New York，第2.10.3)，并编码一种功能上等价的MMTV肽；(6)任何含有如下一种核苷酸序列的核酸分子，这种核苷酸序列可与图1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的组分在低一些的严谨条件下杂交，例如中等严谨条件下，如在0.2×SSC/0.1％的SDS中在42℃进行洗涤(Ausubel等，1989，上文)，并编码一种功能上等价的MMTV肽；以及(7)任何含有如下一种核苷酸序列的核酸分子，这种核苷酸序列可与图1(SEQ ID NO:1)中所示DNA序列的互补物在低严谨条件下杂交，例如在0.2×SSC/0.1％的SDS中在37℃进行洗涤，并编码一种功能上等价的MMTV肽。
例如，可用于本发明的方法中的一种核酸分子具有这样一种核苷酸序列，它含有一个选自图1(SE ID NO:1)中所示的序列的大约ntx至大约nty的核苷酸序列，其中ntx表示从SEQ ID NO:1的大约1号核苷酸至大约8786号核苷酸，nty是SEQ ID NO:1的大约x+17号核苷酸；即这样一种核苷酸，它选自含有SEQ ID NO:1的从大约nt1至大约nt20，大约nt2至大约nt21，大约nt3至大约nt22，大约nt4至大约nt23，大约nt5至大约nt24，等等，直至大约nt8785至大约nt8804以及大约nt8786至大约nt8805的核苷酸序列。
在另一个实施例中，可用于本发明的方法中的一种核酸分子具有这样一种核苷酸序列，它含有一个选自图1(SEQ ID NO:1)中所示的序列的大约ntx至大约nty的核苷酸序列，其中ntx表示从SEQ ID NO:1的大约1号核苷酸至大约8786号核苷酸，nty是SEQ ID NO:1的大约x+29号核苷酸；即这样一种核苷酸，它选自含有SEQ ID NO:1的从大约nt1至大约nt30，大约nt2至大约nt31，大约nt3至大约nt32，大约nt4至大约nt33，大约nt5至大约nt34，等等，直至大约nt8775至大约nt8804以及大约nt8776至大约nt8805的核苷酸序列。
此外，本发明还包括这样一种核酸分子，它编码在功能上与这里介绍的MMTV肽等价的MMTV肽类似物，这种功能等价由多种标准进行判断，包括但不限于，等价的肽被一种MMTV反应性抗体识别的能力。这种等价MMTV肽可在氨基酸序列中含有氨基酸残基的删除、添加或取代，但它们产生一种静默改变，从而产生一种在功能上等价的MMTV肽。这种MMTV核酸的免疫等价类似物可通过如下方法进行鉴定(1)制备核酸分子的类似物，使之编码在序列的5’和3’末端被剪切和/或具有一个或多个内部删除的肽；(2)表达这种核苷酸序列类似物；并(3)确定所产生的表达肽是否能与一种MMTV反应性抗体进行免疫反应或是否能在体内诱导这种抗体的产生。
用于本发明的免疫调节组合物的核酸分子是基本上纯的或均一的。当一种样品显示至少60至75％为单一一种核酸序列时，该核酸样品被认为是基本上纯的。一种基本上纯的核酸应优选含有60至90％的一种核酸样品，更优选约95％，最优选99％。本领域的技术人员熟知的方法可用于测定纯度或均一性，例如样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并接着在染色后的胶上观察到一条单一核酸条带。此外，还可使用HPLC或本领域熟知的其他类似方法获得更高的分辨率。通常参见Sambrook等，1989，《分子克隆实验手册》，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，和Ausubel等(编辑)，1989，《当代分子生物学方法》Ⅰ卷，Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.,New York。
本发明还包括(1)含有任何前述核酸分子与调节元件操纵连接的核酸表达载体，其中所说的调节元件指导核苷酸编码序列的表达，和(2)经过遗传工程构建的宿主细胞，这种细胞含有与调节元件操纵连接的任何前述编码MMTV肽的核酸分子，其中所说的调节元件指导核苷酸编码序列的表达。用于此处，调节元件包括但不限于诱导型或非诱导型启动子、增强子、操纵子和其他本领域技术人员熟知的能驱动和调节表达的元件。更具体的讨论，见下文的章节5.4和5.5。
MMTV肽或其部分或非连续表位可通过重组DNA技术使用本领域熟知的技术进行制备。因此，这里将讨论通过表达含有MMTV核苷酸序列的核酸分子来制备本发明的肽的方法。本领域的技术人员熟知的方法可用来构建含有MMTV核苷酸序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括诸如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。见诸如Sambrook等，1989，《分子克隆实验手册》，Cold SpringHarbor Laboratory Press，和Ausubel等，1989，上文中介绍的技术。此外，能够编码一种MMTV肽的RNA或其一个部分可使用诸如合成仪进行化学合成。参见，诸如《寡核苷酸合成》，1984,Gait编辑，IRL Press,Oxford中介绍的技术，该文在此全文引入作为参考。
5.3．为免疫调节组合物选择抗原本发明还通过测定候选MMTV抗原是否能与一种获自接触或感染了MMTV的个体或接触了一种能与抗MMTV抗体如鼠中和性多克隆或单克隆抗体进行反应的化学或生物试剂的个体的抗体或免疫细胞发生反应，来提供选择或鉴定能够引发一种免疫应答的候选MMTV抗原的方法。所鉴定或选择的抗原可用于本发明的免疫调节组合物。
在本发明的一个实施方案中，该方法是建立一个肽库，这种肽库含有所有可能的MMTV肽中含有的给定长度的肽。这个文库将代表该肽的完全的肽扫描。然后该肽扫描文库可用获自诸如感染了MMTV的个体的血清或免疫细胞进行筛选，来确定哪些肽代表一种抗原性肽，并因而确定哪些肽可以包含在免疫调节组合物中，用来在个体中诱导一种免疫反应。例如血清可获自感染了MMTV的小鼠。这样一种完全的肽扫描已由Baughn等在1996，《感染与免疫》，64卷，2457-2466，关于Treponema pallidum的15kDa中介绍。合成重叠的十肽(10个氨基酸)，每种肽与后一种肽重叠9个氨基酸并后移1个氨基酸，这样就合成了该蛋白的一套完全的十肽。然后用来自患梅毒的兔的血清在ELISA(酶联免疫吸附试验)中进行筛选，来发现那些能与抗梅毒抗体反应的肽。相似的方法可用于本发明，即使用人血清来筛选可用于本发明的组合物的MMTV抗原。
另一个方法涉及组合的噬菌体显示文库，包括随机肽噬菌体显示文库，在这种文库中编码MMTV肽的核酸分子被插入到一个噬菌体显示文库中，表达，并用于一个筛选试验，使用获自感染了MMTV的个体或获自接触了能与MMTV抗体反应的生物或化学试剂的个体或具有MMTV反应性抗体的个体的免疫血清或免疫细胞进行筛选。例如，血清或免疫细胞可获自感染了MMTV的小鼠。使用这种组合噬菌体显示文库，连续和不连续抗原表位都被筛选到。连续表位被定义为这样一种表位，其中抗原性残基位于一个短的氨基酸序列内，即相互连续。不连续表位由来自一级氨基酸序列的不同位置但在蛋白的三维结构中接近的氨基酸序列组成。不连续表位也被称为构象肽，它可由含有编码在三维结构中接近的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子编码。
这种噬菌体肽库通常以下面的方式构建。噬菌体由衣壳蛋白包围的DNA组成，这种结构使噬菌体能够感染细菌并复制其自身，产生大量的噬菌体拷贝。为利用这种特征，将编码目标肽的DNA序列插入到编码噬菌体衣壳蛋白的基因中。只要这些插入不干扰噬菌体的生命周期，这些修饰的噬菌体将具有显示外源肽的衣壳蛋白。丝状噬菌体是优选的载体，因为它们的两种衣壳蛋白很容易修饰来在它们的表面显示外源肽和外源表位。一般说来，这些修饰具有很好的耐受性。但是，即使修饰不被耐受，噬菌体仍能通过多种技术保持存活，这包括共感染一种野生型噬菌体，后者在本领域中被称为辅助噬菌体。
丝状类型的噬菌体如M13、fd和f2的两种衣壳蛋白已知为pⅢ和pⅧ。在噬菌体衣壳中只有5个拷贝的pⅢ，而在衣壳中有大约2700个拷贝的pⅧ。但是，pⅢ通常能耐受高达几百个氨基酸长度的大的插入，而pⅧ只能耐受5或6个氨基酸的插入。如同上文的介绍，其他的技术可用来保持在pⅧ蛋白中含有较大插入的噬菌体的存活。
在本发明的一个实施方案中，可以通过MMTV基因组的基本上消化即90％或更大程度的消化，来获得多样性的核酸片段，并将消化所获得的片段插入到噬菌体中，构建一种连续的肽库。然后表达这些核酸片段，并用获自诸如感染了MMTV的个体或能与MMTV抗原进行免疫反应的个体的免疫血清或免疫细胞对噬菌体进行反应性筛选。纯化可以与免疫血清或免疫细胞反应的噬菌体，并将MMTV核酸片段或编码的肽包含在免疫组合物中，用于人体给药。
在本发明的另一个实施方案中，可以通过MMTV基因组的基本上消化即90％以上程度的消化，来获得多样性的核酸片段，使片段连接，形成至少一个连接片段，并将消化所得的连接片段插入噬菌体，构建一种不连续的肽库。然后表达连接的核酸片段。并用获自诸如接触或感染了MMTV的个体或能与MMTV抗原进行免疫反应的个体例如获自感染了MMTV的小鼠的免疫血清或免疫细胞对噬菌体进行反应性筛选。纯化可以与免疫血清或免疫细胞反应的噬菌体，并将含有不连续表位的核酸片段或编码的肽包含在免疫组合物中，用于人体给药。
在本发明的另一个实施方案中，获自任何来源的随机肽噬菌体显示文库可用于筛选MMTV表位。
5.4．表达系统本发明包括表达系统的使用，这包括真核和原核表达载体以及病毒表达载体，它们可用于表达全长和剪切部分的MMTV肽以及使用上文章节5.3中的方法鉴定的不连续表位。
在本发明的一个实施方案中，编码一种MMTV肽的图1的核苷酸序列或其一个部分在真核、原核或病毒表达载体中进行了表达。图1-6中描述的核酸和氨基酸序列获自GenBank，号码为No.AF033807，并描述了MMTV的一个分离株的核苷酸和编码氨基酸序列。可以想象，其他MMTV分离株的其他核苷酸和氨基酸序列也可用于本发明。在另一个实施方案中，用上文章节5.3中介绍的方法分离的一种核苷酸序列在真核、原核或病毒表达载体中进行了表达。
本发明的一个实施方案包括在一种杆状病毒系统中表达MMTV肽。本发明的另一个实施方案包括在一种杆状病毒系统中表达一种编码不连续MMTV表位的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案包括在一种哺乳动物细胞系统中表达一种编码不连续MMTV表位的核苷酸序列。
多种宿主一表达载体系统可用来表达本发明的核苷酸序列。这种宿主一表达载体系统代表这样一种载体，通过这种载体，可以制备和基本上纯化目标核苷酸编码序列，并且还代表这样一种细胞，当这种细胞用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，可在细胞表面表达本发明的MMTV肽。它们包括但不限于微生物例如用含有MMTV核苷酸编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)、用含有MMTV肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(如酵母、毕赤酵母)、感染了含有MMTV核苷酸编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)的昆虫细胞系统、感染了含有MMTV核苷酸编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)或转化了重组质粒表达载体(如Ti质粒)的植物细胞系统、以及携带了含有处于来自哺乳动物细胞基因组(如金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子、痘病毒7.5k启动子)的启动子控制之下的MMTV核苷酸编码序列的重组表达结构物的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)。
在细菌系统中，可根据所要表达的MMTV核苷酸序列的使用目的，优先选择多种表达载体。例如，在要制备大量的肽时，如制备药物组合物用于产生针对肽的抗体时，或将肽包含在药物组合物中时，能够指导肽高水平表达并使之能很方便地纯化的载体将是可取的。这种载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，1983,EMBOJ.2卷，1791)，其中本发明的编码核苷酸序列可分别连接到载体中，与lacZ编码区处于同一阅读框内，产生一种融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye,1985，《核酸研究》13卷，3101-3109；Van Heeke&Schuster,1989，《生物化学杂志》264卷，5503-5509)等等。pGEX载体也可用于以与谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白形式表达外源肽。一般来说，这种融合蛋白是可溶性的，能够通过与谷胱甘肽-琼脂珠吸附并接着用存在有游离谷胱甘肽的洗脱液进行洗脱，很方便地从裂解的细胞中纯化。pGEX载体设计为包含有凝血酶或Ⅹa因子的蛋白酶切位点，从而使克隆的靶基因的产物可从GST半分子上释放出来。
在昆虫系统中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)可用作载体来表达外源基因。该病毒生长于草地夜蛾细胞中。一种MMTV基因编码序列如pol蛋白编码序列可插入到该病毒的非必需区域(例如多角体基因)中，并置于一种AcNPV启动子(例如多角体启动子)的控制之下。成功地插入一种肽编码序列将导致多角体基因失活，产生非封闭型的重组病毒(即缺少由多角体基因编码的蛋白型衣壳的病毒)。然后将这些重组病毒用于感染用来表达插入基因的草地夜蛾细胞。(例如，参见Smith等，1983，《病毒学杂志》46卷，584页；Smith等，美国专利No.4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种以病毒为基础的表达系统。在一种腺病毒被用作表达载体的场合，一种目标MMTV核酸分子可连接至一种腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可将这种嵌合基因通过体外或体内重组插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区域(例如区域E1或E3)的插入将导致这样一种重组病毒，这种病毒能够在感染的宿主细胞中存活，并能够表达目标核酸分子编码的肽。(例如，参见Logan&Shenk,1984，《美国科学院院刊》81卷，3655-3659)。特殊的起始信号对插入的编码序列的有效翻译来说也是必需的。这些信号包括ATG起始密码子和其他相邻的序列。在一个完整的基因，包括其自己的起始密码子和相邻序列被插入到合适的表达载体的场合，就不需要另外的翻译控制信号。但是，在仅有编码序列的一个部分被插入的场合，就需要提供外源的翻译控制信号，这可能包括ATG起始密码子。而且，起始密码子必须与目标编码序列处于同一阅读框，来保证整个插入的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可以有多种来源，天然和合成的都可以。表达的效率可通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子等等来提高。(参见Bittner等，1987，《酶学方法》，153卷，516-544)。
其他的病毒表达系统也可用于本发明。这种系统包括但不限于，痘苗病毒、重组病毒或金丝雀痘病毒表达系统等等。
5.5细胞系本发明包括MMTV肽在动物和昆虫细胞系中的表达。在本发明的一个实施方案中，env糖蛋白或其一个部分用一种杆状病毒表达载体在一种昆虫细胞系中进行了表达。在本发明的另一个实施方案中，gag蛋白或其一个部分在一种稳定转染的哺乳动物细胞系中进行了表达。在另一个实施方案中，一种含有一个编码MMTV的不连续表位的核苷酸序列的核酸分子在哺乳动物细胞系中进行了表达。
可以选择能够调节核酸编码序列的表达或以所需的特殊方式修饰和加工表达肽的宿主细胞菌株。表达肽的这种修饰(如糖基化)和加工(如切割)对其功能如抗原性来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性的和特殊的机制来对表达肽进行翻译后加工和修饰。可以选择适当的细胞系或宿主系统来保证表达的肽的正确修饰。为这一目的，可以使用拥有能够对表达肽进行原初转录本的正确加工、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这种哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38细胞系。
对于重组蛋白的长期、高产量的制备来说，优选稳定表达。例如，可以通过遗传工程构建能够稳定地表达env糖蛋白或其一个部分的细胞系。除了使用含有病毒复制起始区域的表达载体，宿主细胞可用位于合适表达控制元件(如启动子、增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和一种选择标记控制之下的DNA进行转化。在导入外源DNA后，可将工程细胞在一种加富培养基中生长1-2天，然后转入一种选择培养基。重组质粒中的选择标记提供对选择压力的抗性，使细胞能将质粒稳定地整合到其染色体中，生长形成转化灶，对后者可进行克隆，并形成细胞系。这种方法可优选用于能够表达诸如MMTV env糖蛋白的工程细胞系。
可以使用多种选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler等，1977，《细胞》11卷，223页)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,1962，《美国科学院院刊》48卷，2026页)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，《细胞》22卷，817页)，这些基因可分别应用于tk-、hgprt-或arpt-细胞。对下列基因来说，抗代谢物抗性也可作选择的基础dhfr，它提供对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，《美国科学院院刊》77卷，3567页；O’Hare等，1981，《美国科学院院刊》78卷，1527页)；gpt，它提供对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981，《美国科学院院刊》78卷，2072页)；neo，它提供对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，《分子生物学杂志》150卷，1页)；以及hygro，它提供对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，《基因》30卷，147页)。
此外，任何表达肽都可方便地使用一种针对该表达肽的抗体进行纯化。例如Janknecht等介绍的一种系统可允许对人细胞系中表达的非变性融合蛋白方便地进行纯化(Janknecht等，1991，《美国科学院院刊》88卷，8972-8976页)。在该系统中，目标基因被亚克隆到一种痘苗重组质粒中，使该基因的开放阅读框与一个由6个组氨酸残基组成的氨基末端标记在翻译时融合。将来自感染了重组痘苗病毒的细胞的抽提物上样到Ni2+氮川乙酸一琼脂糖柱，用含有咪唑的缓冲液选择性地洗脱表达的组氨酸标记的肽。
5.6免疫调节组合物和给药方法本发明的免疫调节组合物包括一种有效剂量的免疫原性活性成分即一种或多种MMTV抗原和一种可药用的载剂，其中活性成分能够有效地在受体中产生一种可测量的针对抗原的免疫应答。
含有一种免疫原性肽或一种编码这种肽的核酸分子作为活性成分的免疫调节组合物的制备，对本领域的技术人员来说是熟知的。
5.6.1免疫调节组合物效果的测定MMTV抗原的免疫能力可通过在用MMTV抗原免疫后在试验动物中监测免疫应答或通过使用本领域任何已知的免疫试验来测定。体液(抗体)应答和/或细胞介导的免疫可用作免疫应答的指征。试验动物可包括小鼠、仓鼠、犬、猫、猴、兔、猩猩等以及人。
导入免疫调节组合物的方法可包括口、脑内、皮内、肌肉、腹膜内、静脉、皮下、鼻内或任何其他标准的免疫途径。试验受体的免疫应答可通过多种方法如所产生的免疫血清与MMTV抗原的反应性，用已知的的技术如免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹、放射免疫沉淀等，进行分析，或者在MMTV抗原显示抗原性或免疫原性的场合，通过为免疫动物提供对MMTV感染的保护，或在免疫宿主中减轻因感染MMTV而产生的症状，或减轻因接触一种能与抗MMTV抗原的抗体发生反应的化学或生物试剂而产生的症状，来进行分析。
作为MMTV免疫组合物的合适动物试验的一个例子，本发明的一种组合物可在小鼠中试验其诱导一种对MMTV抗原应答的抗体的能力。可以使用BALB/c小鼠。每个试验组接受一个固定浓度的组合物。对照组接受一个缓冲液注射，如注射不含MMTV抗原的1mM Tris-HCl pH9.0。
从小鼠中每1或2周抽取血样，分析血清中的抗MMTV抗原的抗体。可以使用诸如ELISA分析针对抗原的抗体的存在。
5.6.2免疫组合物这种组合物的合适配方包括可注射的液体溶液或悬浮液，也可制备在注射前溶于或悬浮于液体的固体形式。为用于这样一种配方，组合物也可以是乳化的，或者MMTV抗原可以包裹在脂质体中或与多糖和/或其他聚合物接合。活性的免疫原性成分通常与可药用的并与活性成分相匹配的赋形剂混合。合适的赋形剂为诸如盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物。此外，在需要时，组合物也可包括少量的辅助物质如湿润或乳化试剂、pH缓冲液试剂、和/或能增强组合物的效果的佐剂。
可能有效的佐剂的例子包括但不限于，矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、油乳化物、明矶、MDP、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酰-2-(1’-2’-二棕榈基-sn-甘油酰-3-羟基磷酰氧)-乙胺。一种佐剂的有效性可通过测定在存在或不存在各种佐剂的情况下测量针对含有MMTV抗原的组合物的抗体的诱导来确定。
MMTV抗原可配制成中性或盐形式的组合物。可药用的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基基团形成)和与无机酸如盐酸、磷酸或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的盐。与游离羧基基团形成的盐也可从无机碱如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物以及有机碱如异丙胺、三甲基胺、2-乙胺乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生。
本发明的组合物可以是多价的或单价的。多价组合物可以从指导一种以上抗原表达的重组病毒制备。
多种方法可用来导入本发明的免疫调节组合物。这些包括但不限于口、皮内、肌肉、腹膜内、静脉、皮下、鼻途径以及通过划痕(擦破皮肤的表层，例如使用一种分支的针)。口服组合物可包括标准的载剂如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。含有本发明的核酸的组合物可通过任何本领域已知的用于将一种核酸传递给一种受体的方法进行给药，例如按照这里的介绍。
被给药本发明的一种免疫调节组合物的患者是一种哺乳动物，优选是人，但也可以是一种非人类的动物，包括但不限于奶牛、马、羊、猪、家禽(如鸡)、山羊、猫、犬、仓鼠、小鼠和大鼠。患者最优选是一个没有接触过MMTV的人或一个对MMTV抗原没有免疫反应的人。
一般来说，各成分以单位剂量形式单独或混合在一起提供，例如以标明了活性成分数量的密封容器如安瓶或小袋中的冻干粉末或无水浓缩物的形式进行提供。当组合物通过注射给药时，可以提供一安瓶的无菌稀释剂，使成分在给药前可以混合。
在一个特殊实施方案中，本发明的一种冻干MMTV抗原在第一个容器中提供，第二个容器含有溶剂，溶剂由50％甘油、0.25％酚和一种抗菌剂(例如0.005％的亮绿)的水溶液组成。
一种免疫调节组合物使用的准确剂量也可根据给药途径、患者的体质来决定，并可按照医师的判断和每个患者的状况按照标准的临床技术来决定。一种有效的免疫剂量是足以在给药了组合物的宿主中产生一种针对该抗原的免疫应答的数量。
将纯化的抗原用作免疫调节组合物可通过标准的方法进行。例如，纯化的肽应被调整为一个合适的浓度，用任何合适的佐剂进行配制，包装待用。当MMTV抗原是一种半抗原时，半抗原是一种具有抗原性的分子，它能选择性地与相关抗体发生反应，但没有免疫原性，它不能引发一种免疫应答。半抗原可共价结合于一种载体或免疫原性分子，例如一种大的蛋白如血清白蛋白可为与之偶联的半抗原提供免疫原性。半抗原-载体可配制来用作一种免疫调节组合物。
本发明的组合物在人体中的有效剂量也可从动物模型试验系统获得的剂量应答曲线推知。
5.6.3本发明的组合物产生的抗体的应用通过给药本发明的MMTV抗原产生的针对该抗原的抗体也可用于诊断免疫试验、被动免疫治疗和产生抗独特型抗体。
所产生的抗体可用本领域熟知的标准技术进行分离(例如免疫吸附层析、离心、沉淀等等)，并用于诊断免疫试验。抗体也可用来监测治疗和/或疾病过程。本领域熟知的任何免疫试验系统，例如下文所列出的，都可用于这一目的，它们包括但不限于，使用技术如放射免疫、ELISA(酶联免疫吸附试验)、“夹心”免疫试验、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体固定试验、免疫放射分析试验、荧光免疫试验、蛋白A免疫试验和免疫电泳试验的竞争性和非竞争性试验系统，仅举出一小部分。
本发明的免疫调节组合物也可用来制备抗体，用于被动免疫治疗，在这种治疗过程中，通过给药预先形成的针对MMTV抗原的抗体，宿主获得短期的保护。
用本发明的免疫调节组合物制备的抗体也可用于产生抗独特型抗体。然后抗独特型抗体又可用来进行免疫，来产生一个能结合最初的病原微生物抗原或试剂的抗体亚群(Jerne,1974，《免疫学年鉴》(Paris)125c,373页；Jerne等，1982,EMBO J,1卷，234页)。
5.6.4包装在需要时，组合物可存在于一个包装或分配装置中，后者包括一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。例如包装可包括金属或塑料薄片，例如一种blister包装。包装或分配装置可伴随有给药指示。与这种包装或分配装置相关的是管理制造者的政府机构签发的关于药物或生物制品的使用或销售的注意事项，该注意事项反映制造管理部门同意人体给药的使用或销售。含有配制在一种匹配的药用载剂中的本发明的一种抗原的组合物也可在一个合适的容器中制备、放置，并标明用于治疗适应症。
本发明并不限于这里介绍的特殊实施方案的范围。事实上，对本领域的技术人员来说，根据前面的介绍，除了这里介绍的修改，本发明的各种修改都是显而易见的。这种修饰也在后面所附的权利要求的范围内。
这里引用了各种参考文献，它们的内容在此全文引如作为参考。序列表(1)一般信息(ⅰ)发明人Stewart,T.
Gershoni,J.(ⅱ)发明名称MMTV抗原的免疫调节组合物及其使用方法(ⅲ)序列数6(ⅳ)联系地址(A)联系人Pennie&Edmonds LLP(B)街道1155 Avenue of Americas(C)城市New York(D)州New York(E)国家USA(F)ZIP:10036(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型磁盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ Version2.0(ⅵ)现申请日期(A)申请号(B)提交日期(C)分类(ⅶ)律师/代理人信息(A)姓名Gordon,Jennifer(B)登记号30,753(C)参考/登记号9345-004(ⅸ)电信信息(A)电话212-790-9090(B)传真212-869-9741(C)电传66141 PENNIE(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8805碱基对(B)类型核酸(C)线型单链(D)拓扑构型线形(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCAACAGTCC TAACATTCAC CTCTCGTGTG TTTGTGTCTG TTCGCCATCC CGTCTCCGCT 60CGTCACTTAT CCTTCACTTT CCAGAGGGTC CCCCCGCAGA CCCCGGTGAC CCTCAGGTCG 120GCCGACTGCG GCAGCTGGCG CCCGAACAGG GACCCTCGGA TAAGTGACCC TTGTCTCTAT 180TTCTACTATT TTGTGTTCGT CTTGTTTTGT CTCTATCTTA TCTGGCTATT ATCACAAGAG 240CGGAACGGAC TCACCACAGG GAACTGCAGT CTCGCCTACA GAGAAGAGGT AGGTTACGGT 300GAGCCATTGG AAATGGGGGT CTCGGGATCA AAAGGGCAGA AACTCTTTGT TTCTGTTCTA 360CAAAGACTCC TCTCAGAGAG GGGTCTTCAT GTGAAAGAGA GCAGTGCAAT AGAGTTTTAT 420CAGTTCCTAA TAAAGGTCTC TCCTTGGTTT CCCGAAGAAG GAGGATTAAA TTTACAAGAT 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权利要求
1．在人受体中诱导针对MMTV的免疫应答的方法，包括对受体给药一种免疫调节组合物，该组合物含有一种药用载剂和至少一种MMTV抗原，其中抗原的数量足以引起MMTV特异的细胞或体液应答提高。
2．权利要求1的方法，其中抗原是MMTV env肽或其一个部分。
3．权利要求2的方法，其中所说的部分包含MMTV env肽的至少6个连续氨基酸。
4．权利要求1的方法，其中抗原是MMTV核心肽或其一个部分。
5．权利要求4的方法，其中所说的部分包含MMTV核心肽的至少6个连续氨基酸。
6．权利要求1的方法，其中抗原是MMTV pol肽或其一个部分。
7．权利要求6的方法，其中所说的部分包含MMTV pol肽的至少6个连续氨基酸。
8．权利要求1的方法，其中抗原是一种核酸分子，该核酸分子编码至少一种MMTV抗原。
9．权利要求8的方法，其中核酸分子编码MMTV env肽或其一个部分。
10．权利要求9的方法，其中所说的部分编码MMTV env肽的至少6个连续氨基酸。
11．权利要求8的方法，其中核酸分子编码MMTV核心肽或其一个部分。
12．权利要求11的方法，其中所说的部分编码MMTV核心肽的至少6个连续氨基酸。
13．权利要求8的方法，其中核酸分子编码MMTV pol肽或其一个部分。
14．权利要求13的方法，其中所说的部分编码MMTV pol肽的至少6个连续氨基酸。
15．权利要求8的方法，其中核酸编码MMTV的一个不连续表位。
16．权利要求1的方法，其中人受体在给药该免疫调节组合物前没有接触或感染过MMTV。
17．权利要求1的方法，其中人受体在给药该免疫调节组合物前对MMTV抗原没有免疫反应性。
18．权利要求1的方法，其中免疫调节组合物通过选自口、鼻内途径、皮下途径、静脉途径、腹膜内途径和皮下途径的途径进行给药。
19．使用一种方法制备的MMTV的不连续表位，该方法包括(a)基本上消化MMTV的基因组，产生多样性的MMTV核酸片段；(b)将片段连接，产生至少一种连接的核酸片段，后者至少编码一种肽；(c)在一种表达系统中表达该连接片段，使编码的肽表达；(d)用血清对表达的肽进行筛选，其中血清含有能与至少一种MMTV抗原反应的抗体或免疫细胞；和(e)将与抗体或免疫细胞反应阳性的表达肽纯化。
20．在人受体中诱导针对MMTV的免疫应答的方法，包括将一种免疫调节组合物给药于该受体，其中该组合物包含一种可药用载剂和一种MMTV的不连续表位，其中该不连续表位通过下面的方法制备，包括(a)基本上消化MMTV的基因组，产生多样性的MMTV核酸片段；(b)将片段连接，产生至少一种连接的核酸片段，后者至少编码一种肽；(c)在一种表达系统中表达该连接片段，使编码的肽表达；(d)用血清对表达的肽进行筛选，其中血清含有能与至少一种MMTV抗原反应的抗体或免疫细胞；和(e)将与抗体或免疫细胞反应阳性的表达肽纯化，使其数量足以引发MMTV特异的细胞或体液应答的增加。
全文摘要
本发明涉及在人体中诱导针对MMTV抗原的免疫应答的方法,用来在人体中治疗或预防因感染MMTV或接触能与抗MMTV抗原的抗体发生反应的生物或化学试剂而引起的疾病或紊乱。
文档编号A61K48/00GK1305384SQ99807144
公开日2001年7月25日 申请日期1999年4月8日 优先权日1998年4月8日
发明者T·H·M·斯图尔特, J·格尔肖尼 申请人:国际生物免疫系统公司