本发明属于食品加工技术领域，特别涉及一种基于葡聚糖与大豆蛋白耦联的糖接枝蛋白的制备方法。
背景技术：
糖接枝蛋白是基于maillard反应机理的一种绿色高效的蛋白改性方法，该方法不需外加化学试剂，仅加热即可自发形成糖-蛋白复合物，安全性高、快速、稳定，在食品工业中应用广泛。蛋白质多肽链中糖链的引入，使蛋白质的功能性质，如溶解性、热稳定性、乳化性、起泡性、凝胶性等得到显著改善，甚至增加某些蛋白质的抗氧化性、抑菌性和降低免疫原性，可作为天然防腐剂。糖接枝蛋白为具有球状形貌的两亲性接枝共聚物，较强两亲性使其能够在水中自组装为胶束，该胶束可包埋β-胡萝卜素、姜黄素、布洛芬等疏水性物质，且负载效率高，可作为靶向药物载体或营养递送载体，或作为天然表面活性剂应用于乳液体系。糖接枝蛋白技术为研究和开发新型食品添加剂提供了一条新的途径，目前该研究在国内外食品功能性添加剂、医药等领域有良好的发展前景。
cn105669825a公开了“一种基于可溶性大豆多糖的糖基化及其制备方法”。将蛋白和大豆多糖分别溶解混合后冻干为粉末，在温度为60℃、湿度为79％的干燥器中反应7-14天，将反应物复溶离心后取上清干燥得到糖基化蛋白。此法反应时间很长，所得物质褐变程度大、副产物多，不能完全保证得到maillard反应初期产物；反应条件要求湿度为79％、需冻干两次等条件苛刻，工业化大规模生产难以实现，因此限制了此方法的实际应用。
cn101429226a公开了“一种蛋白质-多糖接枝耦联技术改善大米蛋白功能性质的方法”。将大米蛋白在ph为12条件下溶解后与糖基混合，在ph为11、90℃条件下反应20min，将混合液冷冻干燥得到产物。此法条件为高温强碱，条件极端，所得产品副产物多，褐变程度大，不能完全保证得到maillard反应初期产物；工业化生产中污水处理成本高，因此限制了此方法的实际应用。
葡聚糖(dextran)是由蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后形成的高分子葡聚糖聚合物，具有绿色、安全的特点。其分子主链由α(1→6)糖苷键连接的葡萄糖单位聚合而成，形成简单的直链结构，其中每个葡聚糖分子都含一个还原末端，可发生接枝耦联反应。作为中性多糖的葡聚糖具有优良的水溶性、稳定性，具有在体内不被胃液消化而可被肠道内葡聚糖酶降解的特点，是一种潜在的优良人体结肠靶向药物载体。其也具有良好的生理功能：清除游离自由基、抗辐射、溶解胆固醇、预防高脂血症及调整体内消化道的微生态，促进有益菌增值等。葡聚糖是一种良好的蛋白质糖基化修饰反应物，能够明显改善蛋白的各种功能特性，是具有特殊功能性质的蛋白配料。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种反应时间短，接枝度高，安全、稳定，可有效降低产品褐变度的一种基于葡聚糖与大豆蛋白耦联的糖接枝蛋白的制备方法，可用于蛋白改性或对功能性营养因子/药物进行包埋，用于营养/药物递送体系。
本发明的技术解决方案是：
一种基于葡聚糖与大豆蛋白耦联的糖接枝蛋白的制备方法，其具体步骤如下：
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
将葡聚糖和大豆蛋白按照质量比1∶1～1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖与水的质量体积比为14.0mg/ml～21.0mg/ml，所述大豆蛋白与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述混合液调节ph至6.8～7.2，匀速搅拌1～2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液低温温浴
将步骤(1)制备的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒温水浴摇床中初步温浴，调节温度为50～60℃，温浴50～60min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步连续接枝反应
将经恒温水浴摇床预反应的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度为80～85℃，反应时间为10～15min；然后置于恒温水浴摇床中继续温浴，温度为50～60℃，时间30～40min；将葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒温水浴锅和恒温水浴摇床交替循环反应，经过恒温水浴锅和恒温水浴摇床处理一次计反应1次，共计反应6～8次后结束，然后将反应物冰浴3～5min；
(4)接枝物的提取与提纯
将(3)制备的反应产物调节ph值至4.0～5.0，在0～4℃下以8000～10000g离心力离心15～20min；取上清液后进行超滤离心，转速为2000～2500rpm，时间为10～15min；取上清液冻干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
进一步的，步骤(1)所述葡聚糖的分子量为40～50kda。
进一步的，步骤(1)所述大豆蛋白的蛋白纯度≥95％。
进一步的，步骤(1)和步骤(4)调ph值采用浓度为0.1mol/l的hcl溶液或浓度为0.1mol/l的naoh溶液。
进一步的，步骤(1)匀速搅拌时，搅拌速度为100～150r/min，低速搅拌能够使多糖和蛋白分子进行重排而不发生变性，未反应分子间能够更充分地相互结合参与下一步反应。
进一步的，步骤(2)和步骤(3)的恒温水浴摇床的转速为100～150r/min，摇床转动搅拌能够降低蛋白的变性热聚集效应，使蛋白重新分散增大接枝度。
进一步的，步骤(1)所述混合液调节ph至7，以提高产品溶解性。
进一步的，所述溶液均是用灭菌双蒸水配制。
本发明的有益效果：
(1)选择将混合溶液放入温度为50～60℃的恒温水浴摇床中初步温浴，其中7s形式的球蛋白开始变性温度在60～70℃，β-伴大豆球蛋白在60～75℃开始变性，因此在低于其变性范围进行温浴既提高温度，又使蛋白在未变性范围慢慢温浴以备进一步反应。采用分级连续反应的方式使大豆蛋白与多糖进行反应，反应条件温和，反应效率高，短时间内即可得到高接枝度产物；接枝物为美拉德反应初级产物，安全稳定，没有褐变。
(2)葡聚糖具有良好的溶解分散稳定性，使产物具有很好的溶解性，有效提高蛋白在等电点的溶解能力，同时得到功能性优越的糖基化蛋白，有效提高蛋白的溶解性、乳化性、热稳定性、起泡性等各种性能。所得糖接枝蛋白为两亲性接枝共聚物，可以用于蛋白改性或对功能性营养因子/药物进行包埋，用于营养/药物递送体系，具有良好的市场前景。
具体实施方式
实施例1
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
将0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，用0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以100r/min匀速搅拌1h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量为40kda，大豆蛋白的蛋白纯度为95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液预反应
将步骤(1)制备的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒温水浴摇床中初步温浴，调节温度为50℃、转速为100r/min，温浴50min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步连续接枝反应
将经恒温水浴摇床预反应的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度为80℃，反应时间为15min；然后置于恒温水浴摇床中继续温浴，温度为50℃、转速为100r/min，时间30min；将葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒温水浴锅和恒温水浴摇床交替循环反应，经过恒温水浴锅和恒温水浴摇床处理一次计反应1次，共计反应8次后结束，然后将反应物冰浴5min。
(4)接枝物的提取与提纯
将(2)制备的反应产物所述混合液以0.1mhcl调节使ph值为4.0，在4℃下以8000g离心力离心15min；取上清液后进行超滤离心，转速为2000rpm，时间为10min；取上清液冻干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
实施例2
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
将葡聚糖和大豆蛋白按照质量比1.25∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖与水的质量体积比为17.5mg/ml，所述大豆蛋白与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以125r/min匀速搅拌1.5h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量为50kda，大豆蛋白的蛋白纯度为95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液预反应
将步骤(1)制备的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒温水浴摇床中初步温浴，调节温度为55℃、转速为125r/min，温浴55min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步连续接枝反应
将经恒温水浴摇床预反应的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度为83℃，反应时间为13min；然后置于恒温水浴摇床中继续温浴，温度为55℃、转速为125r/min，时间35min；再次于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度83℃，反应时间为13min；将葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒温水浴锅和恒温水浴摇床交替循环反应，经过恒温水浴锅和恒温水浴摇床处理一次计反应1次，共计反应7次后结束，然后将反应物冰浴5min。
(4)接枝物的提取与提纯
将(2)制备的反应产物所述混合液以0.1mhcl调节使ph值为4.5，在4℃下以9000g离心力离心18min；取上清液后进行超滤离心，转速为2300rpm，时间为13min；取上清液冻干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
实施例3
(1)葡聚糖-大豆蛋白混合液的配制
将葡聚糖和大豆蛋白按照质量比1.5∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖与水的质量体积比为21.0mg/ml，所述大豆蛋白与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以150r/min匀速搅拌2h，得到葡聚糖-大豆蛋白混合液；葡聚糖的分子量为50kda，大豆蛋白的蛋白纯度为95％；
(2)葡聚糖-大豆蛋白混合液预反应
将步骤(1)制备的葡聚糖-大豆蛋白混合液放入恒温水浴摇床中初步温浴，调节温度为50℃、转速为150r/min，温浴60min；
(3)葡聚糖-大豆蛋白混合液分步连续接枝反应
将经恒温水浴摇床预反应的葡聚糖-大豆蛋白混合液取出，置于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度为85℃，反应时间为10min；然后置于恒温水浴摇床中继续温浴，温度为50℃、转速为150r/min，时间40min；再次于恒温水浴锅中进行接枝反应，温度85℃，反应时间为10min；将葡聚糖-大豆蛋白混合液于恒温水浴锅和恒温水浴摇床交替循环反应，经过恒温水浴锅和恒温水浴摇床处理一次计反应1次，共计反应6次后结束，然后将反应物冰浴3min。
(4)接枝物的提取与提纯
将(2)制备的反应产物所述混合液以0.1mhcl调节使ph值为5.0，在4℃下以10000g离心力离心20min；取上清液后进行超滤离心，转速为2000rpm，时间为15min；取上清液冻干，即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
对比例1
将0.7g葡聚糖和0.7g大豆蛋白加入50ml水配制混合液，葡聚糖的分子量为40kda，大豆蛋白的蛋白纯度为95％；以0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以100r/min匀速搅拌1h；将混合液置于恒温水浴锅中以温度为80℃，反应时间为380min进行接枝反应，然后放入冰浴中冷却5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
对比例2
将葡聚糖和大豆蛋白按照质量比1.3∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述大豆蛋白与水的质量体积比为17.5mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以125r/min匀速搅拌1.5h；将混合液置于恒温水浴锅中以温度为83℃，反应时间为365min进行接枝反应，然后放入冰浴中冷却5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
对比例3
将葡聚糖和大豆蛋白按照质量比1∶1，加入水配制混合液，所述葡聚糖与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述大豆蛋白与水的质量体积比为14.0mg/ml，所述混合液以0.1mhcl/naoh调节使ph为7.0，用磁力搅拌器以100r/min匀速搅拌2h；将混合液置于恒温水浴锅中以温度为85℃，反应时间为320min进行接枝反应，然后放入冰浴中冷却5min，得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。
表1接枝度与褐变指数
由表1可看出目标产物的接枝度与褐变程度与对照相比，接枝度显著高，褐变程度显著低。
分别采用实施例1～实施例3的方法制备葡聚糖-大豆蛋白接枝物，只改变步骤(1)混合液的ph值，其它内容不变，测试最终产物的溶解度，结果如表1所示。
表2产物溶解度(％)随ph的变化
由表2可知，目标产物的溶解度与对照相比，目标产物的溶解度受等电点的影响显著减小，在ph＝7处有很好的溶解性。
表3乳化活性与乳化稳定性
由表3可得到，目标接枝物乳化活性和乳化稳定性较强。
表4热稳定性
由表4可得到，目标接枝物的热稳定性很好。
表5起泡能力与泡沫稳定性
由表5可得到目标接枝物的起泡能力和泡沫稳定性很好。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。