专利名称：抗葡聚糖单链抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及抗葡聚糖的抗体，特别涉及抗葡聚糖单链抗体及其制备方法。
背景技术：
葡聚糖，又名右旋糖酐，由多个葡萄糖分子聚合而成，具有较高的分子量，葡萄糖残基之间主要以0-1，6键连接，支链主要有1，2键，1，3键，1，4键等。葡聚糖可由蔗糖溶液中污染的细菌葡聚糖蔗糖酶催化产生，葡聚糖从结构上可以分为α型和β型。α型葡聚糖通常由细菌分解蔗糖产生，β型葡聚糖具有生理活性，存在于真菌细胞壁中(1、范瑞梅， 范家恒.葡聚糖的免疫作用及研究进展.甘蔗糖业，2006，(6) :38-41)。单链抗体(Single chain antibody，ScFv)是一个重要的基因工程抗体，是将重链可变区基因与轻链可变区基因用寡聚核甘酸连接，在大肠杆菌中表达成单链多肽，并在细菌体内折叠成只由重链和轻链可变区构成的一种新型的抗体(2、沈倍奋，陈志南，刘民培.重组抗体[M].北京北京科学出版社，2005，21-2 。单链抗体的大小仅为完整抗体的 1/6，与抗体分子相比，^Fv在药代动力学上表现出了更好的组织穿透力，在用于治疗时可进入一般抗体不能达到的部位。同时，由于抗原结合面不变，因此单链抗体拥有抗体的全部结合特异性。单链抗体的多肽接头可设计为具有特殊功能的位点，如金属螯合、连接毒素或药物等，以用于影像和临床治疗。单链抗体可通过包涵体大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白，是目前研究最多的小分子抗体(3、王锐.基于杂交瘤细胞单链抗体制备技术的应用，抗GPV-NSl和GoIFN-Y单链抗体的构建[D]，东北农业大学，2009， 1-2)
发明内容
本发明的第一-目的在于提供抗葡聚_单链抗体。
本发明的另一-目的在于提供抗葡聚_单链抗体的制备方法。
所述抗葡聚賴■单链抗体的氨基麵■序列为
MetGluValGlnLeuGlnGlnSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGly
151015
GlySerMetLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsp
202530
AlaTrpMetAspTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrp
354045
ValAlaGluIleArgSerLysAlaAsnAsnHisGluThrTyrTyrAla
505560
GluSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSer
65707580
SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrGlylie
60
Tyr Tyr Cys
His 100 Val
85
Tyr Asp Val Ala
Ser Ser Gly
Thr Val Thr 115
Gly Gly Ser Asp
Gly
Ser 145 Ser
Gly 130 Val
Gly 120 Glu
90
Met Asp 105
Gly Gly Ser Gly
Ser Pro Gly
lie Gly Thr
Pro Arg Leu Ser Arg
Asn
Ser 210 Ser
Phe 195 Val
Leu 180
Ser
Ser 165 lie
Glu 150
lie
lie 135
Arg Val Ser Phe
95
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 110
Gly Gly Gly Ser 125
Pro Ala lie Leu
Leu Thr Gln Ser 140
Cys Arg Ala Ser
His Trp Tyr
Gln 170 Glu
Ser 155
Gln Arg Thr Asn
Ser lie Ser
Lys Tyr Ala Ser 185
Gly Thr Asp Phe
Gly Ser Gly
Ser 200
lie Ala
Gly 190 Leu
Gly 175 lie
Gln 160
Ser
Pro
Ser lie
Asn 225
Arg Leu Glu His
Glu Ser Glu Asp 215
Phe Gly Gly
Thr 205
Cys Gln Gln Ser
Trp Pro Trp
His 245
Thr 230 His
Asp Tyr Tyr 220
Gly Thr Lys Leu Glu lie 235
Lys 240
His His His
所述抗葡聚糖单链抗体的基因序列为
atggaggtgc aactgcagca gtctggagga ggcttggtgc aacctggagg atccatgaaactctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120
tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180
acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240
agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300
tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360
ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420
ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480
agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540
ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600
gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660
tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720
cggctcgagcaccaccacca ‘ccaccac747 其中第1 3M位核苷酸为抗葡聚糖单链抗体的重链可变区基因，全长为354bp ； 第355 399位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp ；第400 723位核苷酸为为抗葡聚糖单链抗体的轻链可变区基因，全长为324bp。
所述抗葡聚糖单链抗体的制备方法包括以下步骤1)克隆抗葡聚糖单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗葡聚糖单链抗体的重组工程菌；3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗葡聚糖单链抗体。在步骤1)中，所述克隆抗葡聚糖单链抗体基因的模板来自抗葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株D9，所述杂交瘤细胞株D9于2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址中国.武汉.武汉大学，保藏中心保藏编号为CCTCC NO C2010107。所述克隆抗葡聚糖单链抗体基因可分别克隆抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因和抗葡聚糖单链抗体轻链可变区基因，再通过连接肽Linker将两者连接。所述克隆抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因的引物为5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG—3'；3'端引物5' GCC TCC AGA ACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。所述克隆抗葡聚糖单链抗体轻链可变区基因的引物为5'端引物5' GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。所述载体可为pET_22b (+)质粒。在步骤2)中，所述宿主细菌可为E. coli BL21(DE3)。在步骤幻中，所述纯化可采用亲和层析。本发明利用抗葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株D9，通过RT-PCR技术，获得了该抗体的重、轻链可变区序列，进一步组装成抗葡聚糖单链抗体基因，并构建重组表达载体 pET-22(b+)-SCFv，进行抗葡聚糖单链抗体的表达、纯化与鉴定。在基因工程技术的大背景下，抗葡聚糖单链抗体的获得将有助于未来该抗体的进一步开发和应用。
图1为抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因(Vh)和轻链可变区基因的PCR产物电泳图。在图1中，1、2为轻链可变区基因(VJ，3为DNA分子量标记(DNAMarker)，4、5 为重链可变区基因(Vh)。图2为抗葡聚糖单链抗体基因的PCR产物电泳图。在图2中，1为DNA分子量标记 (DNAMarker)，2为抗葡聚糖单链抗体基因。1500、1000、700、500、300、100为DNA分子量标记的大小。图3为纯化后的抗葡聚糖单链抗体的电泳图。在图3中，1为蛋白分子量标记 (Marker)，116. 0,45. 0,35. 0,25. 0,18. 4、14. 4为蛋白分子量大小，2、3为纯化后的抗葡聚
糖单链抗体。图4为抗葡聚糖单链抗体原核表达后的电泳图。在图4中，1为未经IPTG诱导的空载体菌蛋白，2为经IPTG诱导后的菌蛋白，3为经IPTG诱导菌的超声波上清液，4为经IPTG 诱导菌的超声波沉淀，5是蛋白分子量标记(Marker)，97. 4,66. 0,42. 7,31. 0,14. 4为蛋白分子量大小。
图5为抗葡聚糖单链抗体鉴定图。在图5中，横坐标为稀释度，纵坐标为0D490nm。
具体实施例方式实施例1抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因(Vh)和轻链可变区基因的克隆1)所用细胞和鼠源性抗葡聚糖单克隆抗体抗葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株D9由厦门大学和广州甘蔗糖业研究所共同研制，于2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心保藏编号为 CCTCCNO :C2010107o杂交瘤细胞株D9常规培养在10 %胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37°C，5 % CO2培养。2)引物设计要扩增的抗体可变区基因序列，其可变区基因序列是未知的，故本发明使用的引物采用国际上推广的弓丨物序列。 在Vh引物的5 ‘端加入酶切位点Nco I CATGCCATGG (含保护性碱基CATG)， 在八引物的3 ‘端加入酶切位点)(ho I :CCGCTCGAG (含保护性碱基CCG)。将连接肽 Linker (Gly4Ser)3设计在Vh3'端和八5'端，加下划线表示。扩增重链可变区的引物为Vh 5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；(注S =G, C ;M = A, C ;R = A, G ;ff = A, T)；Vh 3'端引物5' GCC TCC AGAACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。扩增轻链可变区的引物为Vl 5 ‘端引物5 , GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；Vl 3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。3) V1^P八基因的克隆取状态良好的杂交瘤细胞株D9，采用Trizol (购自^witrogen公司)试剂，按照说明书上的方法提取总RNA，以总RNA为模板，以Oligo (dT) 20 (购自Τ0Υ0Β0)为随机引物， 逆转成cDNA。以Oligo (dT) 20为随机引物进行逆转录方案如下RT-PCR 反应体系:5XAMV 缓冲液 4. 0 μ L ； dNTP (10mmol/L) l.OyL ；Oligo (dT) 20 随机引物(20ymol/L)2. Ομ L ；RNase 抑制剂 0· 5 μ L ；总 RNA 5. O μ L ；AMV 逆转录酶 1. O μ L ； DEPC /K 6. 5 μ L ；总体积 20 μ L0RT-PCR 反应条件50°C，60min ;75°C，15min。反应产物保存 _20°C备用。以RT-PCR扩增的cDNA为模板，扩增重链和轻链可变区基因。PCR 扩增体系为10 X PCR 缓冲液 2. 5 μ L ； dNTP (10mmol/L) 0. 5μ L ；5 ‘端引物 (20ymol/L)1.0yL;3'端 QO μ mol/L) 1. O μ L ;cDNA 1· 0 μ L ;Taq 聚合酶 0· 5 μ L ；双蒸水 18. 5μ L ；总体积 25. 0μ L。PCR 反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin， 扩增30个循环，最后72°C延伸lOmin。产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳观察分析结果(参见
7图1)，并用胶纯化回收试剂盒(OMEGA)回收V1^nt基因产物。实施例2抗葡聚糖单链抗体基因的克隆及其表达载体的构建以回收的V1^nt基因产物混合液为模板，通过乂力‘和VJ'引物扩增加入连接肽 Linker片段的抗葡聚糖单链抗体基因(VH-Linker-\)(参见图2)，其序列为atggaggtgcaactgcagcagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaa60
ctctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120
tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180
acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240
agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300
tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360
ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420
ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480
agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540
ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600
gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660
tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720
cggctcgagcaccaccacca ιccaccac747
其中第1 354位核苷画I为抗葡聚糖单链抗体的· 链可变区基因，全长为354bp ；第 355 ‘ 399位核苷I酸为连接肽Linker，全长45bp ；第400 7 位核苷酸为为抗葡聚糖
单链抗体的轻链可变区基因，全长为324bp。PCR 应体系为10XPCR 缓冲液 2. 5μ L ;dNTP(10mmol/L)0. 5μ L ;VH5 ‘引物 (20ymol/L) l.OyL ； VL3'引物(20ymol/L) l.OyL ；Vh 禾口 Vl 基因产物各 1 μ L ；Taq 聚合酶 0. 5 μ L ；双蒸水 18. 5 μ L ；总体积 25. 0μ L0PCR 反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 40s，58°C退火 45s，72°C延伸 lmin，扩增30个循环，72°C延伸IOmin0抗葡聚糖单链抗体基因产物及pET_22b(+)质粒(购自Novagen公司)分别用限制性内切酶Nco I和Bio I (NEB)进行酶切，胶回收酶切后的产物。在T4DNA连接酶的催化下，将抗葡聚糖单链抗体基因克隆至质粒pET-22b (+)中，构建重组质粒pET-22b (+) -scFv, 转化Ε. coliBL21 (DE3)，筛选阳性克隆并送上海英俊生物技术有限公司测序。实施例3抗葡聚糖单链抗体基因的原核表达和纯化挑选测序正确的含有pET-22b(+)-SCFv重组质粒的E. coli BL21(DE3)单菌落， 37°C振荡培养过夜，按1 100稀释到LB培养液中，振荡培养至OD6tltl值约0.6 0.8时， 加入终浓度为0. 5mmol/L的IPTG诱导表达4h，收集菌体进行SDS-PAGE电泳，经过染色、脱色，发现E. coliBL21 (DE3)的表达产物在^kD处有明显的条带，与预期的目的蛋白带大小一致，表明抗葡聚糖单链抗体基因获得了表达(参见图幻。抗葡聚糖单链抗体的氨基酸序列为Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly151015Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp0119]2025300120]AlaTrpMetAspTrpValArgGlnSerProGluLysGlyLeuGluTrp0121]3540450122]ValAlaGlulieArgSerLysAlaAsnAsnHisGluThrTyrTyrAla0123]5055600124]GluSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAspSerLysSer0125]657075800126]SerValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrGlylie0127]8590950128]TyrTyrCysHisTyrAspValAlaMetAspTyrTrpGlyGlnGlyThr0129]1001051100130]ThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer0131]1151201250132]GlyGlyGlyGlySerAsplieGluLeuThrGlnSerProAlalieLeu0133]1301351400134]SerValSerProGlyGluArgValSerPheSerCysArgAlaSerGln0135]1451501551600136]SerlieGlyThrSerlieHisTrpTyrGlnGlnArgThrAsnGlySer0137]1651701750138]ProArgLeuLeulieLysTyrAlaSerGluSerlieSerGlyliePro0139]1801851900140]SerArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuSerlie0141]1952002050142]AsnSerValGluSerGluAspIleAlaAspTyrTyrCysGlnGlnSer0143]2102152200144]AsnSerTrpProTrpThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulieLys0145]2252302352400146]ArgLeuGluHisHisHisHisHisHis0147]2450148]SDS--PAGE电泳表明，抗葡聚糖单链抗体基因的原核表达产物绝大部分出现
沉淀中，说明融合蛋白主要以包涵体的形式存在(参见图4)。包涵体经处理后，过Ni2+亲和柱，用洗脱液洗下亲和蛋白，胶上几乎只出现1条蛋白质条带，说明经亲和层析纯化到较高纯度含6XHis的融合蛋白。经凝胶成像(Quantity One-4. 6)分析显示其纯度达到90%。 采用逐步透析法对纯化的蛋白进行复性，复性蛋白回收率为45%，通过紫外分光光度计扫描，根据蛋白质浓度=1. 450D280-0. 740D260公式，测得纯化样品浓度为0. 6mg/mL。实施例3抗葡聚糖单链抗体的鉴定采用ELISA法测定抗葡聚糖scFv抗体片段的生物学活性。将葡聚糖与鸡卵血清白蛋白交联物用碳酸盐缓冲液稀释至5ug/mL，包被于96孔板，IOOyL/孔，4°C过夜。用的明胶封闭池，用PBST洗96孔板5次，每孔加入倍比稀释的蛋白100 μ L。同时以pET_22b (+)空载体诱导表达产物为阴性对照，37°C放置lh，用PBST洗涤液洗5次后，加入鼠抗6XHis 抗体，37°C放置lh，用PBST洗涤液洗3次，再加羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C放置45min，再用 PBST洗5次，加入OPD底物溶液，37°C避光放置15min，加终止液QM H2S04溶液)终止反应，酶标仪490nm读取结果(参见图5)。 重组表达的单链抗体在1 1稀释时OD49tl为2.31，在1 1 稀释时为0.201， 随着抗体浓度的下降，OD49tl值逐渐降低，表明单链抗体能与包被在板上的葡聚糖进行特异性结合。
权利要求
1.抗葡聚糖单链抗体，其特征在于所述抗葡聚糖单链抗体的氨基酸序列为 Met Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 151015Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp202530Ala Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp354045Val Ala Glu lie Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Glu Thr Tyr Tyr Ala505560Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser 65707580Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie859095Tyr Tyr Cys His Tyr Asp Val Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100105110Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser115120125Gly Gly Gly Gly Ser Asp lie Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala lie Leu130135140Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145150155160Ser lie Gly Thr Ser lie His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser165170175Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser lie Ser Gly lie Pro180185190Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie195200205Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser210215220Asn Ser Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 225230235240Arg Leu Glu His His His His His His 245。
2.如权利要求1所述的抗葡聚糖单链抗体，其特征在于其基因序列为atggaggtgcaactgcagcagtctggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaa60ctctcttgtgctgcctctggattcacttttagtgacgcctggatggactgggtccgccag120tctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagaagcaaagctaataatcatgaa180acatactatgctgagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagt240agtgtctacctgcaaatgaacagcttaagagctgaagacactggcatttattactgtcat300tacgacgtggctatggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaggc360ggtggttctggaggcggtggttctggaggcggtggttctgacattgagctcacccagtct420ccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtttctcctgcagggccagtcag480agcattggcacaagcatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctc540ataaagtatgcttctgagtctatctctgggatcccttccaggtttagtggcagtggatca600gggacagattttactcttagcatcaacagtgtggagtctgaagatattgcagattattac660tgtcaacaaagtaatagctggccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa720cggctcgagcaccaccaccaccaccac747其中第1 3M位核苷酸为抗葡聚糖单链抗体的重链可变区基因，全长为354bp ；第 355 399位核苷酸为连接肽Linker，全长45bp ；第400 723位核苷酸为为抗葡聚糖单链抗体的轻链可变区基因，全长为324bp。
3.如权利要求1所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)克隆抗葡聚糖单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；2)将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗葡聚糖单链抗体的重组工程菌；3)将重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗葡聚糖单链抗体。
4.如权利要求3所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述克隆抗葡聚糖单链抗体基因的模板来自抗葡聚糖单克隆抗体的杂交瘤细胞株D9，所述杂交瘤细胞株D9于2010年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为 CCTCCNO :C2010107o
5.如权利要求3所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述克隆抗葡聚糖单链抗体基因是分别克隆抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因和抗葡聚糖单链抗体轻链可变区基因，再通过连接肽Linker将两者连接。
6.如权利要求5所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗葡聚糖单链抗体重链可变区基因的引物为5'端引物5' -CAT GCCATG GAG GTS MAR CTG CAG SAG TCff GG-3'；3'端引物5' -GCC TCC AGA ACC ACC GCC TCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GG-3'。
7.如权利要求5所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于所述克隆抗葡聚糖单链抗体轻链可变区基因的引物为5'端引物5, -GGT GGT TCT GGA GGC GGT GGT TCT GAC ATT GAG CTC ACC-3‘；3'端引物5' -CCGCTCGAG CCG TTT GAT TTC CAG CTT GGT GCC-3‘。
8.如权利要求3所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述载体为pET-22b(+)质粒。
9.如权利要求3所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤幻中，所述宿主细菌为 E. coli BL21(DE3)。
10.如权利要求3所述的抗葡聚糖单链抗体的制备方法，其特征在于在步骤；3)中，所述纯化采用亲和层析。
全文摘要
抗葡聚糖单链抗体及其制备方法。涉及抗葡聚糖的抗体，提供抗葡聚糖单链抗体及其制备方法。克隆抗葡聚糖单链抗体基因，并将其导入载体，构建重组载体；将重组载体导入宿主细菌，构建表达抗葡聚糖单链抗体的重组工程菌；重组工程菌发酵培养，分离纯化发酵液，即得抗葡聚糖单链抗体。利用抗葡聚糖单克隆抗体杂交瘤细胞株D9，通过RT-PCR技术，获得了该抗体的重、轻链可变区序列，进一步组装成抗葡聚糖单链抗体基因，并构建重组表达载体pET-22(b+)-scFv，进行抗葡聚糖单链抗体的表达、纯化与鉴定。在基因工程技术的大背景下，抗葡聚糖单链抗体的获得将有助于未来该抗体的进一步开发和应用。
文档编号C12N15/13GK102153651SQ20111002390
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者倪二茹, 曾练强, 梁达奉, 王生育, 颜江华 申请人:厦门大学, 广州甘蔗糖业研究所