专利名称：：miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种内源性非编码小RNA(MicroRNA，miRNA)作为生物标志物的应用，特别是涉及一种miR-378(miRNA-378)在胃癌检测和诊断中的应用。
背景技术：
：胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，每年约有100万个新发病例，男性胃癌的死亡率为各种肿瘤的第二位，女性则为第四位GarciaMetal.2007.GlobalCancerFacts&Figures2007[online].AccessedAug20,2008.URL:www.cancer,gov。而我国是胃癌的高发区，每年我国新发现40万胃癌患者，约占世界胃癌发病人数的42%左右。由于胃癌早期症状不明显，又缺乏特异的早期诊断方法diMarioFetal.Non-invasivetestsingastricdiseases.DigLiverDis40:523-530(2008)，现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高，对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出，而此时病人的平均生存期只有79个月WagnerADetal.Chemotherapyinadvancedgastriccancerasystematicreviewandmeta-analysisbasedonaggregatedata.JClinOncol.24:2903-2909(2006)。因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热点。MicroRNA(miRNA)是在动植物体内发现的长度约为2125个核苷酸的非编码RNA分子，主要通过切断降解和翻译抑制来完成它对靶基因的负调控ReinhartBJetal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans.Nature403，901-906(2000)；BrenneckeJetal.BantamencodesadevelopmentalIyregulatedmicroRNAthatcontrolscellproliferationandregulatestheproapoptoticgenehidinDrosophila.Cell113，25-36(2003)；ZengYetal.SequencerequirementsformicroRNAprocessingandfunctioninhumancells.RNA9，112-123(2003)；HakeSetal.MicroRNAsAroleinplantdevelopment.Curr.Biol.13，R851-R852(2003)。由于它的序列、结构、丰度和表达方式的多样性，使其在真核基因表达调控中有着广泛的作用。作为人类肿瘤信号通路积极的参与者，miRNA不仅扮演着原癌基因和抑癌基因的角色DewsMetal.AugmentationoftumorangiogenesisbyaMyc-activatedmicroRNAcluster.NatGenet.38，1060-1065(2006)；HeLetal.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene.Nature435,828-33(2005)；BonciDetal.ThemiR-15a-miR-16-lclustercontrolsprostatecancerbytargetingmultipleoncogenicactivities.NatMed.14，1271-1277(2008)，与肿瘤的转移凋亡也有关联HuangQetal.ThemicroRNAsmiR-373andmiR_520cpromotetumorinvasionandmetastasis.NatCellBiol.10，202-210(2008)；MaLetal.TumourinvasionandmetastasisinitiatedbymicroRNA-10binbreastcancer.Nature449，682—688(2007)；TavazoieSFetal.EndogenoushumanmicroRNAsthatsuppressbreastcancermetastasis.Nature451，147-152(2008)。由于不同的肿瘤显不出特异性的miRNA表达谱[LuJetal.MicroRNAexpressionprofilesclassifyhumancancers.Nature435，834-838(2005)，miRNA在福尔马林固定的组织中有很高的稳定性XiYetal.SystematicanalysisofmicroRNAexpressionofRNAextractedfromfreshfrozenandformalin-fixedparaffin-embeddedsamples.RNA13,1668-1674(2007)；NelsonPTetal.RAKEandLNA-ISHrevealmicroRNAexpressionandlocalizationinarchivalhumanbrain.RNA12,187-191(2006)，所以越来越多的科学家提出miRNA在血清和血浆中也能有稳定的表达，并可以作为潜在的新型肿瘤标志物。单个miRNA能够影响数百个蛋白质表达，21-25个核苷酸的长度也决定了miRNA没有复杂的结构与修饰过程，这些特点都预示了miRNA作为生物学标志的优越性。已有研究发现，miR-141在包括人前列腺癌在内的上皮细胞性肿瘤患者血清中有明显的表达上调，提示miR-141可以作为判断肿瘤类型的生物学标志PatrickSetal.CirculatingmicroRNAsasstableblood-basedmarkersforcancerdetection.PNAS.105,10513-10518(2008)。缺乏明显临床症状及有效生物学标志的卵巢癌患者也可以用血清miRNA检测来提高早期诊断及早期治疗的可能性。科学家们发现并证实了miR-21，92，93，126和29a在肿瘤血清样本中有明显的过量表达，而miR-155,127及99b的表达却明显降低ResnickKEetal.ThedetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsfromtheserumofovariancancerpatientsusinganovelreal-timePCRplatform.GynecolOncol.112,55-59(2009)；TaylorDetal.MicroRNAsignaturesoftumor-derivedexosomesasdiagnosticbiomarkersofovariancancer.GynecolOncol.110,13-21(2008)。此外在弥漫性大B细胞淋巴瘤血清中miR-21的表达明显增高,增高的miR-21还暗示了较好的无复发生存率LawrieCHetal.Detectionofelevatedlevelsoftumour-associatedmicroRNAsinserumofpatientswithdiffuselargeB-celllymphoma.BrJHaematol.141,672-5(2008)；ChinLJetal.Atruthserumforcancer-microRNAshavemajorpotentialascancerbiomarkers.CellRes.18,983-984(2008)。这一结果显不，检验miRNA的特异性表达不仅有助于肿瘤的早期诊断，还可用于病人的预后判断。这些研究都充分证实，血清及血浆miRNA的测定是一个检测癌症生物学标志物很有前途的领域。现有的肿瘤标志物CEA、CA19-9、CA50、CA125在胃癌中的敏感度与特异性不高，对胃癌具较高特异性的CA72-4也通常在胃癌的III-IV期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出，因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用。利用该生物标志物可以简单、快捷地进行胃癌检测、诊断，以便更好的治疗。为解决上述技术问题，本发明的一种用于胃癌检测的miRNA生物标志物，是如SEQIDNO.I所示miRNA序列的miR-378。该miR-378在胃癌患者血清中特异性表达上调。该生物标志物还可以应用于胃癌的诊断。另外，本发明还提供了一种利用上述生物标志物进行胃癌检测的方法，具体包括以下步骤(I)收集人血清样本；(2)提取血清中总RNA(包含miRNA)；(3)对miR-378生物标志物进行反转录和Realtime-PCR(RT_PCR，实时定量PCR)，并计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值；(4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时，则认为是非胃癌样本；大于2.9时，则认为是胃癌样本。其中，步骤⑴收集人血清样本的具体操作为将收集的血样本放入不含EDTA(乙二胺四乙酸)的试管中，静置凝固后，取上清在4°C下600g900g离心515分钟后，再取上清并在4°C下12000g16000g离心515分钟，取上清即得。步骤⑵中的总RNA抽提，可按照商业化的RNA抽提试剂盒进行操作，并测量RNA的浓度。步骤(3)中的反转录可按照商业化的反转录试剂盒进行；Realtime_PCR反应也可按照商业化RT-PCR反应试剂盒进行操作，其中，Realtime-PCR反应中，以U6snRNA作为内参，并自行设计U6snRNA的引物，以及使用2Δα公式来计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值，式中ACt=Ct^feift-Ctu6,Ct是域值循环数，Ct是miR-378生物标志物的Ct值，Ctu6是U6snRNA的Ct值。反转录反应条件为37°CI小时，95°C5分钟。Realtime-PCR反应中U6snRNA的引物序列设计为ttcgtgaagcgttccatatttt(SEQIDNO.2所示),miR-378生物标志物的引物序列为actggacttggagtcagaagg(SEQIDNO.3所示),其Realtime-PCR反应条件为95°C15分钟，然后进行循环，循环条件为94°C15秒，55°C30秒，700C34秒，共40个循环。再者，本发明还提供一种用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒，该检测试剂盒包括常规实时定量PCR试剂(包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水等)、内参U6snRNA的检测引物(SEQIDNO.2所示),miR-378的检测引物(SEQIDN0.3所示)。其中，该检测试剂盒的操作方法可参照利用上述生物标志物进行胃癌检测的方法进行。本发明的实验数据显示不同的肿瘤样本都具有特异性的血清miRNA表达谱。本发明中的miR-378在正常人和胃癌患者血清中存在差异表达，在胃癌血清中有显著的表达上调。另外，本发明以miR-378生物标志物的PCR相对定量值取2.9为临界值作为判断胃癌的依据是根据具体的实验数据所得，其中，实验数据包括以下具体实施例中的实施例I和实施例2。因此，可以成为胃癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景。图I是实施例I中的24个血清样本的miRNA表达谱聚类图。横排代表miRNA，纵排代表样本。从左到右，左侧区域显示的是10个正常样本，中间区域显示的是7个结直肠癌样本，右侧区域显示的是7个胃癌样本。图2是实施例I中的胃癌样本与正常样本中miR-378表达量的比值，其中，左侧显示的是芯片结果，右侧为RT-PCR的验证结果。图3是实施例2中的正常血清样本和胃癌血清样本中的miR-378表达丰度的比较图，其中，纵坐标为miR-378的PCR相对定量值。图4是实施例2中的正常血清样本和胃癌血清样本中的miR-378表达丰度的比较图(箱图)，其中，纵坐标为miR-378的PCR相对定量值。具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明实施例I用于胃癌检测的生物标志物组合的建立I.收集血清样本采集10个正常人、7个结直肠癌、7个胃癌各病期病人术前外周血2mL(采血时间一般为早晨或上午)，其中，这24个血清样本的具体临床数据如表I所示。将采集的2mL外周血迅速转入不含EDTA的普通试管中，在2225°C(室温)静置1530分钟至完全凝固。取O.6mlImL上清转至洁净的I.5mL离心管中，在I小时(室温条件下)或2小时(4°C条件下)内进行以下操作4°C下820g离心10分钟；再次吸取上清转至洁净的I.5mL离心管中，4°C下16000g离心10分钟，小心吸取上清到新的离心管中，置于-80°C保存备用。表I24个血清样本的具体临床数据权利要求1.一种用于胃癌检测的miRNA生物标志物，其特征在于所述miRNA生物标志物是如SEQIDNO.I所示miRNA序列的miR-378。2.如权利要求I所述的用于胃癌检测的miRNA生物标志物，其特征在于所述miR-378在胃癌患者血清中的特异性表达上调。3.如权利要求I或2所述的miR-378生物标志物还应用于胃癌的诊断。4.如权利要求I所述的应用于miR-378生物标志物的实时定量PCR反应中的内参，其特征在于所述内参为U6snRNA，其引物序列如SEQIDNO.2所示。5.如权利要求I所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法，包括步骤(1)收集人血清样本；(2)提取血清中总RNA；(3)对miR-378生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应，并计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值；(4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时，则认为是非胃癌样本；大于2.9时，则认为是胃癌样本。6.如权利要求5所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法，其特征在于所述步骤(I)收集人血清样本的具体操作为将收集的人血样本放入不含EDTA的试管中，静置凝固后，取上清在4°C下600g900g离心515分钟后，再取上清，并在4°C下12000g16000g离心515分钟，取上清即得。7.如权利要求5所述的利用miR-378生物标志物进行胃癌检测的方法，其特征在于所述步骤(3)中的实时定量PCR反应中，以U6snRNA作为内参，该内参的引物序列如SEQIDNO.2所示，miR-378生物标志物的引物序列如SEQIDNO.3所示；并使用2Δα公式来计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值，式中ΛCt=Ct_CtU6。8.如权利要求I所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括常规实时定量PCR试剂、如SEQIDNO.2所示的内参U6snRNA的检测引物、如SEQIDNO.3所示的miR-378生物标志物的检测引物。9.如权利要求8所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒，其特征在于所述常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水。全文摘要本发明公开了一种miR-378生物标志物在胃癌检测、诊断中的应用，该miR-378生物标志物的miRNA序列如SEQIDNO.1所示；其检测的方法，包括1)收集人血清样本；2)提取血清中总RNA；3)对miR-378生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应，以U6snRNA作为内参，计算miR-378生物标志物的PCR相对定量值；4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时，则认为是非胃癌样本，大于2.9时，则认为是胃癌样本。利用该生物标志物可以简单、快捷地进行胃癌检测、诊断，以便更好的治疗。文档编号C12Q1/68GK102605042SQ20111002269公开日2012年7月25日申请日期2011年1月20日优先权日2011年1月20日发明者刘寒梢,孟宪欣,张伟,张春秀,肖华胜申请人:上海生物芯片有限公司