用于前列腺癌的生物标志物检测中的方法和阵列的制作方法
【专利说明】用于前列腺癌的生物标志物检测中的方法和阵列 发明领域
[0001] 本发明提供用于确定前列腺癌相关疾病状态的方法，W及用于运些方法的阵列和 试剂盒。
[0002] 发巧背景
[0003] 使用血液中的前列腺特异性抗原（PSA)对前列腺癌（PC)的早期检测减少了未筛 过的人中的PC死亡。然而，由于通常使用的临界值PSA的中度特异性，对有助于在具有中 度升高的PSA的人中增强风险分类的另外的生物标志物有迫切的需求。
[0004] 前列腺癌（PC)在西方国家是与癌症相关的死亡的第二大原因山，而为了改进PC 患者的预后，早期且特异性的诊断至关重要。八十年代晚期，在临床中引入了基于血液的生 物标志物前列腺特异性抗原（PSA)，而在今天用作PC风险的指示物W及作为患者活组织检 查进一步检测的一个参数巧，3]。PSA的引入导致了早期诊断的PC病例的数量增加，但是 PSA对于恶性疾病的中度特异性已经引起了对于不必要的活组织检查的成本和潜在副作用 W及过度诊断和过度治疗的风险的主要关注巧-4]。实际上，基于总血清PSA水平（巧SA) (>4]1邑/1111)选择进行活组织检查的65%-75%的人不患有口(：(>丽.。曰]1。61\〇'邑）。因此， 为了改进风险分类，使得临床医生能够选择适当的患者进行活组织检查测试，需要确定另 外的和/或更特异性的生物标志物。
[000引为了改进测试PC时的特异性，已经进行了几种尝试W联合巧SA值与其它参数，例 如PSA随着时间的变化（PSA速率），与前列腺体积相关的PSA(PSA密度），或PSA的年龄特 异性范围巧，3]。然而，目前仅观察到了对巧SA试验诊断能力的无改进或仅中度改进巧]。 相反，已经证实了区分巧SA和游离（未结合的）PSA提高所述试验的表现，特别是对于具有 中间范围（4-1化g/ml)水平的巧SA的人。实际上，已经表明具有游离PSA对巧SA比率（％ 巧SA)在18-25%?下的人与显著较高的风险患有PC相关[5-7]。尽管如此，运一特定患 者群体中的25-50%不患有PC，但他们仍然被选择进行活组织检查测试[7,8]。最近，已经 表明一组四种激肤释放酶标志物作为活组织检查结果的潜在预示物巧，10]，而巧SA，游离 PSA与称为化roPSA的游离PSA子部分的组合也可W改进诊断准确性[11]。
[0006] 然而，对于能够用于检测前列腺癌和/或根据风险对前列腺癌分层（特别是在活 组织检查和/或治疗之前）的另外的、更特异性的，生物标记物仍然存在显著的未满足的临 床需要。
[0007] 发巧公开
[0008] 也已经开展主要的工作W确定与PC相关的另外的，新的血清生物标志物，最初使 用各种经典的生物化学技术。迄今，人激肤释放酶2 [12, 13]，尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激 活剂[14]，[11]转化生长因子0 1OOF-β1)巧，15, 16]，W及白细胞介素-6 (比-6) [16-1引 已特别被表明作为潜在的血清标志物。尽管前景看好，将需要进一步的验证研究来探索和 确认运些标志物的预后能力巧-4]、此外，使用传统的蛋白质组学技术也已经表明了另外的 潜在PC标志物[19, 20]，但是运些观察仍待使用独立的患者群进行验证巧1]。另外，对于 试验的灵敏度，动态范围，和/或处理量也提出了严重的技术问题巧2, 23]。为此，已经建立 了亲和蛋白质组学作为一种高通量替代，其能够w多重、灵敏且快速的方式祀向未分级的 蛋白质组，例如血清和血浆巧4-27]。
[0009] 在运种情况下，本发明人之前已经设计了重组单链片段可变（scFv)抗体微阵列 平台用于复杂蛋白质组的蛋白表达概况分析（profiling) [26, 28, 29]。使用运一亲和蛋 白质组学技术平台，本发明人已经能够W-种快速，灵敏W及可重现的方式，概况分析范 围广泛的天然的，直接标记的蛋白质组，包括血清，血浆，尿液，完整细胞，细胞裂解物，W 及组织提取物巧8, 30, 31]。我们已经掲示所述平台可W用于鉴定候选生物标记物签名 (signature)，用于例如诊断，预后，分类，W及用于基于证据的治疗选择巧2-37]。
[0010] 本发明人研究了亲和蛋白组是否可W用于验证和甚至进一步改善W血浆样品为 目标来自常规PSA测量的风险组分类，其中患者样品根据目前建立的临床实践被分为四种 生化定义的风险群体巧8-41]。该数据表明可W鉴定血浆蛋白签名，其能够准确确定PC("恶 性生物标志物签名"）并用于将患者分为当前W及新的与PC风险相关的亚组，其从长远来 看具有有助于更多的PC个体化治疗的潜力。
[0011] 因此，本发明的第一个方面提供用于确定个体中前列腺癌相关的疾病状态的方 法，其包含W下步骤，或由W下步骤组成：
[0012] a)提供来自所述个体的待测试样品；
[0013]b)通过测量所述测试样品中一种或多种选自表1中定义的组的生物标志物的表 达，确定所述测试样品的生物标志物签名；
[0014] 其中，所述测试样品中一种或多种选自表1中定义的组的生物标志物的表达对于 所述个体中一种或多种前列腺癌相关的疾病状态是指示性的。
[0015] 通过"前列腺癌相关疾病状态"我们表示前列腺癌的存在或不存在，前列腺癌组或 亚组（A，BC，C1，C2或化下文定义）和/或在个体中前列腺癌发生的可能性（优选的，在 给定的时间框内）。
[0016] 通过"生物标志物"我们表示天然存在的生物分子，或其组分或片段，其测量能够 提供在确定前列腺癌相关疾病状态中有用的信息，例如，前列腺癌的预后。例如，所述生物 标志物可W是天然存在的蛋白或碳水化合物部分，或抗原组分或其片段。
[0017] 优选的待测试样品提供自哺乳动物。所述哺乳动物可W是任意的驯养动物或农场 动物。优选的，所述哺乳动物是大鼠，小鼠，或豚鼠，猫，狗，马或灵长类。最优选的，所述哺 乳动物是人。优选的样品是细胞或组织样品（或其衍生物），其包含W下物质，或由W下物 质组成：粗制血，预分级的血，血浆，血浆细胞，前列腺细胞或同样优选的，衍生于细胞或组 织样品的蛋白或核酸，所述细胞或组织包含W下物质，或由W下物质组成：血浆，血浆细胞 或前列腺细胞。优选的测试和对照样品来自同一种类。
[0018] 在一个实施方案中，根据本发明的第一个方面的方法进一步包含W下步骤，或由 W下步骤组成：
[0019]C)提供来自未患前列腺癌的个体的一种或多种对照样品；
[0020] d)通过在步骤化）中测量所述对照样品中一种或多种生物标志物的表达，确定所 述对照样品的生物标志物签名；
[0021] 其中一种或多种前列腺癌相关疾病状态在W下事件中定义：在步骤化）中测量的 测试样品中一种或多种生物标志物的表达与步骤（d)中测量的对照样品中一种或多种生 物标志物的表达不同。
[0022] 在进一步的或另外的实施方案中，所述方法包含W下步骤，或由W下步骤组成：
[0023]e)提供来自患有前列腺癌的个体的对照样品；
[0024] f)通过在步骤化）中测量所述对照样品中一种或多种生物标志物的表达，确定所 述对照样品的生物标志物签名；
[0025] 其中一种或多种前列腺癌相关疾病状态在W下事件中定义：在步骤化）中测量的 测试样品中一种或多种生物标志物的表达对应步骤（f)中测量的对照样品中一种或多种 生物标志物的表达。
[0026] 通过"对应对照样品中的存在和/或量"我们表示所述存在和/或量与步骤（e) 中提供的对照样品的相同；或与步骤（e)中提供的对照样品（例如，阳性对照样品）比步骤 (C)中提供的对照样品（例如，阴性对照样品）（或与代表相同样品的预定义参考值）更接 近。优选的存在和/或量为步骤（e)中提供的对照样品的至少60%，例如至少65%，66%， 67%，68%，09%，7〇%，71%，巧％，巧％，74%，75%，76%，77%，78%，79%，8〇%，81%，没％，83%，84%，没％ ，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或 100%。
[0027] 通过"与对照样品中的存在和/或量不同"我们表示所述存在和或量与步骤（C) 中提供的对照样品（或与代表相同样品的预定义参考值）不同。优选的所述存在和/或值 不多于包含前列腺癌细胞或由前列腺癌细胞组成的对照样品的40%，例如，不多于39%，3 8%，37%，36%，35%，34%，33%，32%，31%，30%，29%，龙％，27%，龙％，25%，24%，23%，。％，21%，20%，19 %, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%,9%,8%, 7%,6%, 5%,4%, 3%, 2%, 1% 或0%。
[0028] 优选的，所述一种或多种对照样品对于待测试个体是年龄和/或性别匹配的。也 就是说，健康个体与待测的年龄大致相同（例如，5岁之内）且性别相同。
[0029] 优选的，在步骤化）中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的存在和/或量 与预定义参考值相比。
[0030] 因此，优选的是在步骤化）中测量的测试样品中一种或多种生物标志物的存在和 /或量与步骤（d)中测量的一种或多种生物标志物的存在和/或量或与预定义的参考值显 著差异（例如，统计学差异）。因此，优选的是在步骤化）中测量的测试样品中一种或多种 生物标志物的存在和/或量与步骤（f)中测量的一种或多种生物标志物的存在和/或量或 与预定义的参考值显著对应（即统计学相似）。例如，如在随附的实施例中讨论的，在测试 样品和对照样品中特定生物标志物的存在和/或量之间的显著差异可W归类为那些其中 p<0. 05 (例如，其中！)<0. 04,p<0. 03, !)<0. 02 或其中！)<0. 01)。
[0031] 优选的，步骤化）包含W下项，或由W下项组成：测量测试样品中一种或多种选自 表1中定义的组的生物标志物的存在和/或量，例如，至少2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11，12, 13 ，14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31，32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 3 9, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51，52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61，62, 63, 64， 65, 66,或67种选自表1中定义的组的生物标志物。
[0032] 步骤化）可W包含测量IL-4的表达，或由测量IL-4的表达组成。可替换的或者 另外，步骤化）可W包含测量IL-12的表达，或由测量IL-12的表达组成。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W包含测量IL-9的表达，或由测量IL-9的表达组成。可替换的或者另外， 步骤（b)可W包含测量IL-la的表达，或由测量IL-la的表达组成。可替换的或者另外，步 骤化）可W包含测量HLA-DR的表达，或由测量HLA-DR的表达组成。可替换的或者另外，步 骤化）可W包含测量IL-3的表达，或由测量IL-3的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量ICAM的表达，或由测量ICAM的表达组成。可替换的或者另外，步骤化） 可W包含测量CD40的表达，或由测量CD40的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W 包含测量IL-18的表达，或由测量IL-18的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包 含测量IL-化的表达，或由测量IL-化的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量GLP-1的表达，或由测量GLP-1的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量IL-11的表达，或由测量IL-11的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测 量VEGF的表达，或由测量VEGF的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量脫 抑素C(切statinC)的表达，或由测量脫抑素C的表达组成。可替换的或者另外，步骤化） 可W包含测量C1-INH的表达，或由测量C1-INH的表达组成。可替换的或者另外，步骤化） 可W包含测量MCP-3的表达，或由测量MCP-3的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可 W包含测量IL-13的表达，或由测量IL-13的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可 W包含测量TNF-β的表达，或由测量TNF-β的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可 W包含测量CIS的表达，或由测量CIS的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量整联蛋白α-10的表达，或由测量整联蛋白α-10的表达组成。可替换的或者另外， 步骤化）可W包含测量C3的表达，或由测量C3的表达组成。可替换的或者另外，步骤化） 可W包含测量GLP-1R的表达，或由测量GLP-1R的表达组成。可替换的或者另外，步骤化） 可W包含测量IgM的表达，或由测量IgM的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包 含测量IL-16的表达，或由测量IL-16的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量TM肤的表达，或由测量TM肤的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 Mucine-1的表达，或由测量Mucine-1的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量IL-2的表达，或由测量IL-2的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 IFN-丫的表达，或由测量IFN-丫的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 CD40配体的表达，或由测量CD40配体的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量比-10的表达，或由测量比-10的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测 量GM-CSF的表达，或由测量GM-CSF的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测 量因子B的表达，或由测量因子B的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 C4的表达，或由测量C4的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量整联蛋白 α-11的表达，或由测量整联蛋白α-11的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包 含测量IL-8的表达，或由测量IL-8的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测 量MCP-4的表达，或由测量MCP-4的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 LDL(l)的表达，或由测量LDL(l)的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量 TNF-β(1)的表达，或由测量TNF-β(1)的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包 含测量IL-7的表达，或由测量IL-7的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测 量Eotaxin的表达，或由测量Eotaxin的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含 测量Rantes的表达，或由测量Rantes的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包 含测量β-半乳糖巧酶的表达，或由测量β-半乳糖巧酶的表达组成。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W包含测量瘦素的表达，或由测量瘦素的表达组成。可替换的或者另外，步 骤化）可W包含测量粘蛋白1的表达，或由测量粘蛋白1的表达组成。可替换的或者另外， 步骤化）可W包含测量LDL(2)的表达，或由测量LDL(2)的表达组成。可替换的或者另外， 步骤化）可W包含测量JAK3的表达，或由测量JAK3的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量比-10的表达，或由测量比-10的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量备解素（properdin)的表达，或由测量备解素的表达组成。可替换的或 者另外，步骤化）可W包含测量IL-5的表达，或由测量IL-5的表达组成。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W包含测量Apo-Al的表达，或由测量Apo-Al的表达组成。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W包含测量LDL的表达，或由测量LDL的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量TNF-a的表达，或由测量TNF-a的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量BTK的表达，或由测量BTK的表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可 W包含测量TNF-β(2)的表达，或由测量TNF-β(2)的表达组成。可替换的或者另外，步骤 化）可W包含测量MCP-4(1)的表达，或由测量MCP-4(1)的表达组成。可替换的或者另外， 步骤化）可W包含测量MCP-4似的表达，或由测量MCP-4似的表达组成。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W包含测量GLP的表达，或由测量GLP的表达组成。可替换的或者另外，步 骤化）可W包含测量血管动蛋白（angiomotin)的表达，或由测量血管动蛋白的表达组成。 可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量MCP-1的表达，或由测量MCP-1的表达组成。可 替换的或者另外，步骤化）可W包含测量IL-6的表达，或由测量IL-6的表达组成。可替换 的或者另外，步骤化）可W包含测量LewisX的表达，或由测量LewisX的表达组成。可替 换的或者另外，步骤化）可W包含测量Clq的表达，或由测量Clq的表达组成。可替换的或 者另外，步骤化）可W包含测量唾液酸化LewisX的表达，或由测量唾液酸化LewisX的表 达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量TGF-β的表达，或由测量TGF-β的表 达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量比-Ira的表达，或由测量比-Ira的表 达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量TGF-β1的表达，或由测量TGF-β1的 表达组成。可替换的或者另外，步骤化）可W包含测量PSA的表达，或由测量PSA的表达组 成。
[0033] 因此，步骤化）可W不包含测量IL-4的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不 包含测量IL-12的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-9的表达。可替 换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-la的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W 不包含测量HLA-DR的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-3的表达。可 替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量ICAM的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W 不包含测量CD40的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-18的表达。可 替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-化的表达。可替换的或者另外，步骤化）可 W不包含测量GLP-1的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-11的表达。 可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量VEGF的表达。可替换的或者另外，步骤化）可 W不包含测量脫抑素C的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量C1-INH的表 达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量MCP-3的表达。可替换的或者另外，步骤 化）可W不包含测量IL-13的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量TNF-0 的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量Cls的表达。可替换的或者另外，步 骤（b)可W不包含测量整联蛋白α-10的表达。可替换的或者另外，步骤（b)可W不包含 测量C3的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量GLP-1R的表达。可替换的 或者另外，步骤化）可W不包含测量IgM的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含 测量IL-16的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量TM肤的表达。可替换的 或者另外，步骤化）可W不包含测量Mucine-1的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W 不包含测量IL-2的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IFN-T的表达。 可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量CD40配体的表达。可替换的或者另外，步骤 化）可W不包含测量IL-10的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量GM-CSF 的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量因子B的表达。可替换的或者另外， 步骤化）可W不包含测量C4的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量整联蛋 白α-11的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-8的表达。可替换的或 者另外，步骤化）可W不包含测量MCP-4的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含 测量LDL(1)的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量TNF-β(1)的表达。可 替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-7的表达。可替换的或者另外，步骤化）可 W不包含测量Eotaxin的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量Rantes的表 达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量β-半乳糖巧酶的表达。可替换的或者另 夕F，步骤化）可W不包含测量瘦素的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量粘 蛋白1的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量LDL(2)的表达。可替换的或 者另外，步骤化）可W不包含测量JAK3的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测 量IL-10的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量备解素的表达。可替换的 或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-5的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包 含测量Apo-Al的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量LDL的表达。可替换 的或者另外，步骤化）可W不包含测量TNF-a的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W 不包含测量BTK的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量TNF-β(2)的表达。 可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量MCP-4(1)的表达。可替换的或者另外，步骤 化）可W不包含测量MCP-4(2)的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量GLP 的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量血管动蛋白的表达。可替换的或者 另外，步骤化）可W不包含测量MCP-1的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测 量IL-6的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量LewisX的表达。可替换的 或者另外，步骤化）可W不包含测量Clq的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含 测量唾液酸化的LewisX的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量TGF-β的 表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量IL-lra的表达。可替换的或者另外， 步骤化）可W不包含测量TGF-β1的表达。可替换的或者另外，步骤化）可W不包含测量 PSA的表达。
[0034] 通过"表达"我们表示基因产物例如mRNA或蛋白的水平或量。
[003引通过"TM肤"我们表示衍生于10TM蛋白的肤，W下的scFv抗体构建物SEQIDNO: 1 对其具有特异性（其中CDR序列W下划线表示）：
[0036] MAEVQLLESGGGLVQPGG化化SCAASGFTFSSYGFHWVRQAPGKGLEWV化ISWDGGSTYYADSVKGR FTIS畑NSKNTLYLQMN化RAEDTAVYYCARGTW抑PWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSASGTP GQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIS化RS邸EADYYCAAWDD化SWVFGGGTKLWLG [0037][SEQIDN0:1]
[003引