治疗前列腺癌(PCa)的组合物的制作方法

专利名称：治疗前列腺癌(PCa)的组合物的制作方法
治疗前列腺癌(PCa)的组合物 本发明涉及活性(免疫刺激性)组合物，其包含至少一种RNA，优选mRNA，其编码 至少两种(优选不同的)能够在哺乳动物中引发(适应性)免疫反应的抗原，其中所述抗 原选自由PSA (前列腺特异性抗原)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，PSCA (前列腺干细胞抗 原)，和 STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原(Six Transmembrane Epithelial Antigen))组 成的组。本发明进一步涉及包含所述活性(免疫刺激性)组合物的疫苗，以及所述活性(免 疫刺激性)组合物的用途(用于制备疫苗)，和/或疫苗的用途，所述疫苗用于引发(适应 性)免疫反应来治疗前列腺癌(PCa)，优选肿瘤辅助治疗和/或激素-难治性前列腺癌，及 其相关的疾病或病症。最后，本发明涉及试剂盒，特别是多部件的试剂盒，其包含所述(免 疫刺激性)组合物和/或疫苗。目前，前列腺癌是排名第二位的最常见诊断癌症，在全球发达国家中是男性癌症 相关死亡的第四大主要原因。有效医疗疗法日益削弱，目前只可用于地方性疾病。在激 素难治性前列腺癌中，尚未显示有药剂延长大约1年以上的寿命(参见例如Pavlenko， M. , A. K. Roos, ^ A (2004). " Aphase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specificantigen in patients with hormone-refractory prostate cancer.(用表达前列腺特异性抗原的质粒DNA接种激素难治性前列腺癌患者 的I期实验)"Br JCanceH英国癌症杂志)91 (4) =688-94.) 0在一些高度发达的西方 国家，如美国，前列腺癌甚至是目前最常诊断的恶性肿瘤，并且在美国(参见例如Jemal， A.，R. Siegel，等人(2006). “ Cancer statistics (癌症统计学)，2006. “ CACancer J Clin 56 (2) 106-30.)和欧洲(参见例如 Thomas-Kaskel，A. K.，C. F. Waller,等人 (2007) " Immunotherapy with dendritic cells for prostatecancer.(关于前列腺癌用 树突细胞进行免疫疗法)"Int T Cancer (国际癌症杂志)121 (3) :467_73)分别是男性中 第三大致死癌症病因。大多数被诊断的肿瘤是腺癌，其最初是以激素依赖型的方式增殖的。 前列腺癌是这样的疾病，其中在男性生殖系统的一种腺体，即前列腺中发展癌症。它是当前 列腺细胞突变，并开始不受控制地增殖时发生的。与正常对照相比前列腺癌细胞显示过表 达的典型抗原特别是像PSA，PSMA, PAP，PSCA，HER-2和Ep-CAM的抗原。这些前列腺癌细胞 可以从前列腺扩散(转移)到身体的其它部分，特别是骨骼和淋巴结。前列腺癌可以引发 疼痛，排尿困难，勃起功能障碍和其它症状。一般，前列腺癌在五十岁以上的男性中最频繁 地发展，其代表最常见的患者群。不过，前列腺癌经常未被发现，即使确诊是有可能的。通 常通过身体检查或通过筛选血液测试，如PSA (前列腺特异性抗原)测试来实现前列腺癌的 确诊。当怀疑是前列腺癌时，通常通过切除一片前列腺(活组织检查)并在显微镜下检查 它来确认癌症。可以进行其它的测试，如X射线和骨扫描来确认前列腺癌是否扩散。前列腺癌的治疗将仍是未解决的挑战。对于前列腺癌的治疗可以应用传统的治疗 方法，如手术，放射治疗，激素治疗，有时候进行化学治疗，质子疗法，或这些疗法的一些组 合。不过，男性的年龄和基本健康状况以及扩散程度，显微镜下的外观，以及癌症对初始治 疗的反应在确定疾病结果中是重要的。由于前列腺癌通常是对于老年男性诊断的疾病，许 多人将会在缓慢发展的前列腺癌能够扩散或引发症状之前死于其它原因。这使得治疗选择困难。是否用医疗手段治疗局部的前列腺癌(包含在前列腺内的肿瘤)的决定是在关于患 者生存和生活质量的预期有益和有害作用之间的患者权衡。不过，以上治疗方法，如手术，放射治疗，激素治疗和化学治疗等，全部都会伴有严 重的限制。例如，手术切除前列腺，或前列腺切除术，对于早期前列腺癌或对于对放射治疗 没有响应的癌症来说都是常用的治疗。它可以引发显著改变生活质量的神经损伤。最常见 的严重并发症是小便失禁和阳萎。不过，即使前列腺癌可以成功切除，但前列腺癌在整个生 物体中的扩散仍是未解决的问题。在前列腺癌治疗中放射治疗是最常用的。对于早期癌症可以使用它而非手术，并 且它也可以用于前列腺癌晚期以治疗疼痛的骨转移。当单独的放射治疗不太可能治愈癌症 时， 放射治疗也可以结合激素疗法用于中间性的危险疾病。不过，放射治疗还具有高风险并 且经常导致免疫防御的完全丧失，因为患者免疫系统受到破坏。另外，放射治疗一般在癌症 生长位点上局部应用，因此不可避免前列腺癌在整个生物体中扩散的以上问题。如果全身 应用，放射治疗可能导致细胞和免疫系统的严重损伤。化学治疗长期以来被认为对于前列腺癌是一种较少有效的治疗，因为甚至只有非 常少数的患者对这种疗法产生响应。不过，某些患有转移性前列腺癌的患者(响应者)，可 以从化学治疗获益。响应率大约为20%并且因此化学治疗将在肿瘤复发和激素治疗失败的 治疗期间发挥作用。不过，化学治疗通常将只是缓解性的，并不带来患者前列腺癌的完全消 除。典型的化学治疗剂包括环磷酰胺，多柔比星，5-氟尿嘧啶，阿霉素，苏拉明和其它药剂， 不过这些药物中没有一种能够带来患者的明显更长存活。在最近发表于新英格兰医药杂志 (New England Journal of Medicine) 2004的研究中，每三周接受一剂多西他赛的患者可以 显示平均值为2. 5个月的更长存活。激素治疗通常使用药物或激素疗法与手术的结合以阻抑前列腺癌细胞获得二氢 睾酮(DHT)，二氢睾酮(DHT)是一种在前列腺中产生的激素并且是大多数前列腺癌细胞的 生长和扩散所必需的。阻抑DHT通常引起前列腺癌停止生长，甚至缩小。不过，激素治疗很 少治愈前列腺癌，因为最初响应激素治疗的癌症通常在一到两年后变得耐药。例如缓解性 雄激素缺失治疗能够诱发高达80%患者的症状缓和，但是在15-20个月后，肿瘤细胞变得 对激素不敏感并且发展了不依赖雄激素的前列腺癌。在这种情况下治疗选择很少，因为化 学治疗效力有限(见上面)。所以通常当癌症已经从前列腺扩散时使用激素治疗。它还可 以给予某些接受放射治疗或手术的男性以帮助阻止他们的癌症反复。因此患有正常前列腺癌的患者，还有患复发性或晚期前列腺癌的患者急需备选的 治疗策略。作为一种方法，上面讨论的用于器官限制性前列腺癌的标准疗法，包括根治性 前列腺切除术或放射治疗如外(射线)照射和近程放射治疗还可以在某些情况下结合肿 瘤辅助治疗或佐剂激素治疗(参见例如Totterman，Τ. H.，A. Loskog，等人(2005). “ The immunotherapy ofprostate and bladder cancer.(前列腺禾口膀腕癌的免疫治疗)〃 BJU Int 96(5) :728-35.)。尽管这些疗法在短期内是相对有效的，但相当部分(30-40%)最初 患有局部性疾病的患者最终将复发。对于转移性的前列腺癌主要的疗法是雄激素切除术 (androgen ablation) 0尽管这通常带来细胞减少和减轻，但在14-20个月内通常会出现激 素难治性疾病发展。在化学治疗领域对于晚期不依赖雄激素的前列腺癌已经报告了许多临 床研究。只有最近的两次试验揭示化学治疗稍微改善了患有激素难治性疾病的患者的整体存活。综上所述，诸如上述手术、放射治疗、激素治疗、偶而使用的化学治疗、质子疗法等 的标准技术，如果单独应用的话，似乎不适于进行有效治疗前列腺癌(PCa)。所以一种改进 的治疗方式可以包括这些治疗或可以补充这些标准技术的补充性治疗。因而，本文建议在 使用前列腺癌(PCa)的治疗或补充治疗方法中使用适应性免疫系统。如本领域所知，免疫系统在多种疾病的治疗和预防中起着重要的作用。按照目前 的知识水平，哺乳动物提供了多种机制通过识别和杀死例如肿瘤细胞来保护生物体。为了 本发明的目的，这些肿瘤细胞必须检测到并且与生物体的正常(健康)细胞和组织区别开 来。脊椎动物如人的免疫系统由多种类型的蛋白、细胞、器官、和组织组成，其以精细 的和动态的网络相互作用。作为该种复杂的免疫反应的部分，脊椎动物系统随时间适应更 有效地识别特定病原体或肿瘤细胞。适应过程产生免疫学记忆，并且允许在将来相遇过程 中甚至更有效的保护。该适应性或获得性免疫性过程形成接种策略的基础。适应性免疫系统是抗原特异性的，并且需要在称为抗原呈递的过程中识别特定的 “自体”或“非自体”抗原。抗原特异性允许产生专门针对特定病原体或病原体-感染细胞 或肿瘤细胞的反应。固定这些专门反应的能力在体内通过所谓的“记忆细胞”保持。如果 病原体不止一次感染机体，则这些特异性记忆细胞用来快速清除其。因此，适应性免疫系统 允许更强的免疫反应以及允许免疫学记忆，其中每种病原体或肿瘤细胞被一种或多种特征 抗原“记住”。脊椎动物中适应性免疫系统的主要成分在细胞水平主要包括淋巴细胞，在分子水 平主要包括抗体。淋巴细胞作为适应性免疫系统的细胞成分包括B细胞和T细胞，其来源 于骨髓中的造血干细胞。B细胞参与体液反应，而T细胞参与细胞介导的免疫反应。B细胞 和T细胞携带识别特定靶标的受体分子。仅在抗原(例如，病原体的小片段)已经被处理 且与称为主要组织相容性复合体(MHC)分子的“自我”受体组合呈递后，T细胞识别“非自 我”靶标，如致病性靶标结构。相反，B细胞抗原特异性受体是在B细胞表面上的抗体分子， 并且当其表面上的抗体与特异性外源抗原结合时，识别这样的病原体。该抗原/抗体复合 体被B细胞吸收，并且通过蛋白质水解作用处理成肽。然后，B细胞在其表面II类MHC分 子上展示这些抗原肽。MHC和抗原的这种组合吸引匹配的辅助T细胞，其释放淋巴因子并且 激活B细胞。因为活化的B细胞然后开始分化，其后代分泌数百万拷贝的识别该抗原的抗 体。这些抗体在血浆和淋巴中循环，结合病原体或表达所述抗原的肿瘤细胞，并且将它们标 记，用以通过补体激活进行分解或用以通过吞噬细胞吸收和分解。作为适应性免疫系统的 细胞成分，细胞毒性T细胞(⑶8+)还可以形成CTL-反应。细胞毒性T细胞(⑶8+)可以识 别来自内源性病原体的肽和由I型MHC分子结合的自体抗原。CD8+-T细胞通过在细胞中释 放细胞毒性蛋白而行使它们的杀伤功能。免疫系统机制由此形成多种疾病的有疗效的治疗的靶标。适当的方法典型地基于 施用佐剂，以引发先天性免疫反应，或者基于施用抗原或免疫原，以激发适应性免疫反应。 由于抗原典型地是基于病原体(例如，表面蛋白)或其片段的特定成分，所以还考虑向患者 施用核酸然后其表达需要的多肽、蛋白或抗原。例如，基于已知前列腺相关抗原的接种研究已经在Noguchi等人(2003)和(2004)中开展(参见例如 Noguchi，M.，K. Itoh,等人(2004). “ Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA_A2-positive patients withmetastatic hormone-refractory prostate cancer.(在转移性激素难治性前列腺癌HLA-A2-阳性患者 中的患者定向接种的I期试验)‘‘Cancer Sci (癌症科学)95(1) -Jl-M ；和Noguchi, M.， K. Kobayashi,等人(2003) · “ Induction ofcellular and humoral immune responses to tumor cells and peptide inHLA~A24 positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptidevaccination.(通过肽接种在HLA-A24阳性激素难治性前列腺癌患 者中诱导针对肿瘤细胞和肽的细胞和体液免疫反应)“Prostate (前列腺)57 (1) =80-92. Noguchi 等人 2003 和 Noguchi 等人 2004)。Noguchi 等人(2003)和(2004)在转移性激素 耐受型前列腺癌患者中用接种的多种肽试验开展了两次I期研究，显示对于选定靶标的增 强的细胞以及体液免疫反应。接种策略是安全的，良好耐受，无严重毒性作用。不过，也观 察到前列腺特异性抗原(PSA)水平的稳定或降低，只有一名患者显示骨转移的消失。这种 方法的主要限制取决于需要患者HLA单倍型以及前列腺癌细胞的肽表达的现有知识，这使 得它难以进行临床应用。一些其它的近期方法利用基于细胞的接种策略，例如在接种策略中使用不同 的抗原或使用加载了不同抗原或其片段的树突细胞。根据一个实例，在临床试验中使 用用重组人PSA脉冲的自体树突细胞测试前列腺癌患者的接种(参见例如Barrou， B. , G.Benoit,等人(2004). “ Vaccination ofprostatectomized prostate cancer patients in biochemical relapse, withautologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA(用重组人PSA脉冲的自体树突细胞接种具有生化复发的前列腺 切除的前列腺癌患者).〃 Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学免疫疗法)53 (5): 453-60)。在用加载了 PSCA和PSA肽的树突细胞接种晚期前列腺癌患者期间，10名患者 中有5名显示针对至少一种抗原的免疫反应(参见例如Thomas-Kaske 1，A. K.，R. Zeiser, 等人(2006). “ Vaccination of advanced prostate cancer patientswith PSCA and PSA peptide—loaded dendritic cells induces DTH responses thatcorrelate with superior overall survival.(用加载PSCA和PSA肽的树突细胞接种晚期前列腺癌患 者诱导了与良好总体存活相关的DTH反应)“Int JCanceH国际癌症杂志)119(10): 2428-34.)。在另一个实例中，Murphy等人(1996)用两种HLA-A*0201 PSMA表位接种处于 相应I期试验的前列腺癌患者，以便与用单独的肽接种或与用经脉冲的DCs的接种相比 较。结果显示如果用经脉冲的DCs接种患者，更多患者对接种有应答。这一研究显示用 加载了肽或蛋白质的DCs接种至少部分地导致可检测到的免疫反应，以及暂时性的PSC 下降或稳定(参见例如 Murphy，G.，B. Tjoa，等人(1996). “ Phase I clinical trial T-cell therapyfor prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed withHLA-A0201-specific peptide from prostate-specific membrane antigen (I 期临床 试验关于前列腺癌使用用来自前列腺特异性膜抗原的HLA-A0201特异性肽脉冲的自体树 突细胞的T细胞疗法)· “ Prostate (前列腺)29 (6) 371-80)。前列腺癌患者的接种还可以组合加载到树突细胞上的肽来进行，例如用肽混 合物加载的树突细胞(参见例如Fuessel，S.，A.Meye，等人(2006). “ Vaccinationof hormone-refratory prostate cancer patients with peptidecocktail-loaded dendritic cells results of a phase I clinical trial.(用肽混合物负载的树突细 胞接种激素难治性前列腺癌患者1期临床试验的结果)"Prostate (前列腺)66 (8) 811-21)。所述混合物包含来自PSA，PSMA，存活蛋白，Prostein和Trp-p8 (瞬时型感受 器电位p8 (transient receptor potentialp8))的肽。还用基于树突细胞的激素难治性 前列腺癌的多表位免疫疗法来进行临床试验(参见例如Waeckerle-Men，Y.，E. Uetz-von Allmen, 等 人(2006). “ Dendritic cell-based multi-epitope immunotherapy ofhormone-refratory prostate carcinoma(激素难治性前列腺癌的基于树突细胞的多表 位免疫疗法).〃 Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学免疫疗法)55 (12) 1524-33)。 Waeckerle-Men, Y.，E. Uetz-von Allmen，等人(2006)测试了用来自 PSCA，PAP(前列腺酸 性磷酸酶)，PSMA和PSA的肽接种激素难治性前列腺癌。尽管用抗原蛋白或肽，例如当加载到树突细胞时，进行接种是引发免疫反应的常 用方法，免疫或接种还可以基于核酸的使用以便将所需的遗传信息结合到细胞中。一般地， 已经发展了多种方法用于将核酸引入细胞中，如磷酸钙转染，polyprene转染，原生质体融 合，电转化，显微注射和脂转染，特别是脂转染已经被证明是一种合适的方法。根据一个实例，前列腺癌的接种治疗可以基于将来自自体肿瘤的总mRNA 转染到DCs中(见Heiser等人(2002)(参见例如Heiser, A.，D. Coleman,等人 (2002). “ Autologous dendritic cells transfected withprostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastaticprostate tumors (Mltf歹 Ι· 胃 生 原RNA转染自体树突细胞刺激针对转移性前列腺肿瘤的CTL反应).“J Clin Invest (临 床研究杂志)109(3) 409-17.)。这一策略具有下列益处，其靶向多种I类和II类HLA患 者特异性肿瘤相关抗原(TAAs)，而无先前的HLA分型。另外，甚至基质抗原也可以被这种策 略所靶向，因为mRNA获自手术样本而非获自肿瘤细胞系。例如，Heiser等人开发了基于DC 的免疫治疗方案，其中用编码PSA的mRNA转染DCs。所述接种被良好耐受并诱导了增强的 针对PSA的T细胞反应。不过，这些基于DC的抗前列腺癌疫苗似乎生成了强烈的T细胞反 应，其可以伴随临床反应，尽管后者的频率仍然令人不满意。在接种策略中DNA也可以用作核酸以便将所需的遗传信息结合到细胞中。根据具体的实例，DNA病毒可以用作DNA载体。由于它们的感染特性，这些病毒获得非常高的转染 率。所用的病毒以这种方式进行遗传修饰，即在转染细胞中不形成功能性感染颗粒。例如， 在Eder等人(2000)中使用表达PSA的重组痘苗病毒进行了 I期试验。作者表明了针对 PSA的T细胞免疫反应并且还表明了在选定的患者中的血清PSA稳定。(参见例如Eder， J. P. , P. W. Kantoff,等人(2000). “ A phase I trial of a recombinantvaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer.(在晚期前歹[J腺 癌中表达前列腺特异性抗原的重组痘苗病毒的I期试验)"Clin Cancer Res (临床癌症研 究)6(5) =1632-8. )0由来自重组病毒的高度免疫原性肽促发的炎性反应可以增强外源蛋 白质的免疫原性，但据显示免疫系统减少重组病毒的复制并由此限制了临床效果。即使重 组疫苗已经显示免疫原性并且在若干试验中显示了肿瘤应答的证据，但这些结果需要加以 证实。根据另一种方法，用表达PSA的DNA质粒进行激素难治性前列腺癌患者的接种(参见例如 Pavlenko，Μ·，A. K. Roos，等人(2004). “ A phase Itrial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen inpatients with hormone-refratory prostate cancer.(在激素难治性前列腺癌患者中用表达前列 腺特异性抗原的质粒进行DNA接种的I期试验)"Br J Cancer (英国癌症杂志)91 (4) 688-94)。Garcia-Hernandez等人(2007)显示用编码STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原) 的质粒或病毒样复制子进行治疗性和预防性接种延长了肿瘤侵袭的小鼠的存活(参见例 如 Garcia-HernandezMde，L，A.Gray，等人(2007). ” In vivo effects of vaccination withsix-transmembrane epithelial antigen of the prostate :a candidate antigen fortreating prostate.(用前列腺的6跨膜上皮抗原接种的体内作用用于治疗前列腺的 候选抗原)"Cancer Res (癌症研究)67 (3) : 1344-51)。近来STEAP被鉴定为晚期人前列 腺癌的指示蛋白，其在人前列腺癌中高度过表达。它的功能当前是未知的。不过，在使用DNA作为遗传信息的载体时，不可能排除导入基因或病毒基因的不 受控制的增殖的危险，例如由于潜在的重组事件。这也需要承担DNA通过例如重组插入到 宿主细胞基因组的完整基因中的风险，结果是这一基因可能突变并由此完全或部分地失活 或该基因可能引起错误信息。换句话说，细胞必需的基因产品的合成可能被完全抑制或者 表达出经修饰的或不正确的基 因产品。如果DNA被整合入参与细胞生长调控的基因中，则 发生一种特定的风险。在这种情况下，宿主细胞可能退化并导致癌症或肿瘤形成。另外，如 果导入到细胞中的DNA要被表达，相应的DNA载体必需包含强启动子，如病毒CMV启动子。 这些启动子整合到处理细胞的基因组中可以导致细胞中基因表达调控的有害变化。使用 DNA作为诱导免疫反应试剂(例如作为疫苗)的另一个风险是在导入了外源DNA的患者中 诱导病原性抗DNA抗体，从而带来(可能是致命的)免疫反应。总结以上方法的结果，无疑对于前列腺癌(PCa)的治疗取得了一些进展，即使这 样，考虑到高致死率，对于其它选择性的或改进的治疗途径仍有强烈需求。因而总之，对于有效系统有空间和需求，其可以用于有效刺激免疫系统来进行前 列腺癌(PCa)的治疗，同时避免由于基于DNA的组合物而导致的导入基因不受控制增殖的 问题。因而本发明的一个目的是提供组合物，其a)能够通过刺激免疫系统来治疗前列 腺癌(PCa)，同时b)避免上述缺点。这一目的通过本发明的主题而得以解决，特别是通过活性(免疫刺激性)组合物 得以解决，其包含编码选自下列抗原的至少两种、三种或甚至四种(优选不同的)抗原的至 少一种RNA · PSA (前列腺特异性抗原)=KLK3 (激肽释放酶_3)，· PSMA (前列腺特异性膜抗原)，· PSCA (前列腺干细胞抗原)，· STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)。令人惊讶的是，据发现上述组的至少两种抗原、抗原蛋白或抗原性肽的特定组合， 优选这些抗原、抗原蛋白或抗原性肽的两种、三种或四种的组合，当包含在根据本发明的活 性(免疫刺激性)组合物中时，能够有效刺激(适应性)免疫系统以治疗前列腺癌(PCa)， 优选肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，及其相关的疾病或病症。在此，术语抗原、抗原蛋白或抗原性肽可以同义使用。在本发明的上下文中，本发明的活性(免疫刺激性) 组合物应当进一步理解为一种组合物，其能够引发免疫反应，优选本文所定义的适应性免 疫反应，这是由于所述活性(免疫刺激性)组合物的组分所包含或编码的组分之一的作用， 优选是编码至少两种(优选不同的)抗原的至少一种RNA，优选是(m)RNA。 与正常对照相比，诸如PSA，PSMA和PSCA的抗原已经显示被前列腺癌细胞过 表达。所以这些抗原代表了免疫疗法的可能靶标(参见例如Marrari，A.，M. Iero，等 A (2007). ‘‘ Vaccination therapy in prostate cancer. ( ^ fr ^lJ Φ W ft ft ^n 疗)“Cancer Immunol Immunother (癌症免疫学免疫治疗)56 (4) 429-45.)。所述活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以是PSA。在本发明的上下文 中“PSA”是“前列腺特异性抗原”并且在文献中可以同义地称之为KLK3 (激肽释放酶-3)。 前列腺特异性抗原(PSA)是一种33kDa的蛋白质并且是雄激素调控的激肽释放酶样丝氨酸 蛋白酶，其是所有类型的良性和恶性前列腺组织的上皮细胞所特有产生的。具体地，PSA由 正常前列腺上皮细胞高度表达并代表前列腺癌中最具特征性的肿瘤相关抗原中的一种。在 生理上，它以高浓度存在于精液中，并作用来将负责精液凝结的高分子量蛋白质剪切成较 小的多肽。这一作用导致凝结物的液化。PSA也存在于血清中并可以通过单克隆放射免疫 测定或多克隆免疫放射测定可靠地进行测量。今天对于筛选、诊断和监测前列腺癌来说PSA 是最广泛使用的肿瘤标记。具体地，几种用于检测血清PSA的免疫测定正广泛用于临床。 近来，对于血清中的PSA mRNA已经开发出反转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)测试。不 过，PSA未被认作疾病特异性标记，因为在高百分比的患BPH和前列腺炎的患者(25-86% ) (Gao等人，1997，Prostate (前列腺)31 :264_281)中，以及在其它非恶性病症和在一些正常 男性中可检测到升高水平的PSA，这是显著限制这一标记诊断特异性的因素。在本发明的上 下文中编码PSA (前列腺特异性抗原)的至少一种RNA，优选mRNA的优选序列，一一如果用 于根据本发明的活性(免疫刺激性)组合物，一一则包含或含有登记号为NM_001648的序 列，更加优选地，它包含或含有

图1 (SEQ ID NO :1)所示的序列，甚至更加优选地，所述至少 一种RNA，如果编码PSA (前列腺特异性抗原)，则包含或含有图2或3 (SEQ ID NOs :2或3) 的任一个所示的编码序列。根据另一个优选的实施方案，活性(免疫刺激性)组合物的至 少一种RNA可以备选地或另外地编码PSA抗原序列，其选自登记号为NM_001648或如图1， 2或3(SEQ ID N0s:l，2或3)中任一个所示的PSA序列的片段，变体或表位。所述活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以是PSMA。在本发明的上下 文中“PSMA”是“前列腺特异性膜抗原”并且可以同义地称之为F0LH1 (叶酸水解酶1)或 “PSM”。PSMA是IOOkDa的II型跨膜糖蛋白，其中PSMA表达在很大程度上局限于前列腺组 织，但在脑、唾液腺、小肠和肾细胞癌中已经观察到可检测水平的PSMA mRNA (Israe 1 i等人， 1993，Cancer Res (癌症研究)53 :227_230)。PSMA在大多数原发性和转移性前列腺癌中 高度表达，但是也在大多数正常上皮内肿瘤样本中表达(Gao等人(1997)，同上)。具体地， PSMA在前列腺癌细胞和非前列腺实体肿瘤新脉管系统中高度表达，是抗癌成像和治疗剂的 靶标。PSMA充当小分子底物，包括叶酸，抗癌药物甲氨蝶呤和神经肽N-乙酰基-L-天冬氨 酰-L-谷氨酸的谷氨酸羧肽酶(GCPII)。在前列腺癌中，已经显示PSMA表达与疾病进程相 关联，在激素难治性和转移性疾病中具有最高水平表达。PSMA的细胞定位是细胞质和/或 膜。PSMA被认为是前列腺癌(PCa)的生物标记并且进行积极研究用作成像和治疗靶标。在本发明的上下文中编码PSMA (前列腺特异性膜抗原)的至少一种RNA，优选mRNA的优选序 列，一如果用于根据本发明的活性(免疫刺激性)组合物，一一则包含或含有登记号为 NM_004476的序列，更加优选地，它包含或含有图4(SEQ ID NO :4)所示的序列，还要更加优 选地，所述至少一种RNA，如果编码PSMA (前列腺特异性抗原)，包含或含有图5或6 (SEQ ID NOs :5或6)的任一个所示的编码序列。根据另一个优选的实施方案，活性(免疫刺激性)组 合物的至少一种RNA可以备选地或另外地编码PSMA抗原序列，其选自登记号为NM_004476 或如图5或6 (SEQ ID NOs 5或6)中任一个所示的PSMA序列的片段、变体或表位。所述活 性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以是PSCA。在本发明的上下 文中“PSCA”是“前列腺干细胞抗原”。在前列腺癌的所有阶段，包括高级前列腺上皮内瘤形 成(PIN)，雄激素依赖型和雄激素不依赖型前列腺肿瘤，PSCA被广泛过表达。PSCA基因显 示与干细胞抗原_2有30 %的同源性，所述干细胞抗原_2是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定细 胞表面抗原的Thy-I/Ly-6家族的成员，编码具有氨基末端信号序列、羧基末端GPI锚定序 列和多个N-糖基化位点的123个氨基酸的蛋白质。PSCA mRNA表达在雄激素依赖型和雄 激素不依赖型前列腺癌异种移植体中都高度上调。原位mRNA分析将PSCA表达定位于前列 腺的基细胞上皮，即推定的干细胞区室。流式细胞分析表明PSCA主要在细胞表面表达并通 过GPI连接所锚定。荧光原位杂交分析将PSCA基因定位于染色体8q24. 2，即80%以上前 列腺癌所具有的等位基因区。PSCA可以用作前列腺癌标记以区分恶性前列腺癌，正常前列 腺腺体和非恶性瘤。例如，相对于良性前列腺增生(BPH)，PSCA在前列腺癌中以非常高的水 平表达。在本发明的上下文中，编码PSCA(前列腺干细胞抗原)的至少一种RNA，优选mRNA 的优选序列，一一如果用于根据本发明的活性(免疫刺激性)组合物，一一则包含或含有 登记号为NM_005672的序列，更加优选地，它包含或含有图7 (SEQ IDNO 7)所示的序列，还 要更加优选地，所述至少一种RNA，如果编码PSCA (前列腺干细胞抗原)，包含或含有图8或 9 (SEQ ID N0s:8或9)的任一个所示的编码序列。根据另一个优选的实施方案，活性(免 疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以备选地或另外地编码PSCA抗原序列，其选自登记号 为NM_005672或如图8或9 (SEQ ID NOs 8或9)中任一个所示的PSCA序列的片段、变体或 表位。所述活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA可以是STEAP。在本发明的上下文 中“STEAP”是前列腺的六跨膜上皮抗原并且可以同义地称之为STEAPl。STEAP或STEAP-I 是新型细胞表面蛋白，主要表达在人前列腺组织中和在其它常见恶性肿瘤包括前列腺、膀 胱、结肠和卵巢癌中，以及在尤因肉瘤中，提示它可以充当几乎通用的肿瘤抗原。具体地， STEAP在原发性前列腺癌中高度表达，在正常组织中限制表达。STEAP在骨髓样本中的阳性 与Kaplan Meier分析中的新转移存活性高度相关联(ρ = 0. 001)。在本发明的上下文中，编 码STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)的至少一种RNA、优选mRNA的优选序列，一一如果用 于根据本发明的活性(免疫刺激性)组合物，一一则包含或含有登记号为NM_012449的序 列，更加优选地，它包含或含有图10 (SEQ ID NO: 10)所示的序列，甚至更优选地，所述至少 一种RNA，如果编码STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)，包含或含有图11或12 (SEQ ID NOs 11或12)的任一个所示的编码序列。根据另一个优选的实施方案，活性(免疫刺激性)组 合物的至少一种RNA可以备选地或另外地编码STEAP抗原序列，其选自登记号为NM_012449 或如图11或12 (SEQ ID NOs 11或12)中任一个所示的STEAP序列的片段、变体或表位。
上述定义的可以由本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 编码的抗原、抗原蛋白或抗原肽，可以包括那些序列的片段或变体。所述片段或变体可以典 型地包括与上文提及的抗原、抗原蛋白或抗原肽或序列或它们的编码核酸序列之一具有至 少5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，优选地至少70 %，更优选地至少80 %，等价地更 优选地至少85 %，甚至更优选地至少90 %且最优选地至少95 %或甚至97 %，至完整的野生 型序列的序列同源性的序列，不管是在核酸水平还是在氨基酸水平上。
在本发明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的“片段”可以包括如上文定义的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，关于其氨基酸序列(或编码其的核酸序列)，与原始(天 然)蛋白的氨基酸序列(或编码其的核酸序列)相比较，其是N端、C端和/或序列内部截 短的。所述截短可以因此发生在氨基酸水平或者相对应的发生在核酸水平上。因此，关于 如上文定义的所述片段的序列同源性可以优选地是指如上文定义的完整的抗原、抗原蛋白 或抗原肽或所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的完整(编码)核酸序列。在本发明的上下文中，抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包括如上述定义的 抗原、抗原蛋白或抗原肽的序列，其具有约6-约20个或甚至更多个氨基酸的长度，例如，由 I类MHC分子处理和呈递的片段，优选地具有约8-约10个氨基酸的长度，例如，8，9，或10 个，(或者甚至6，7，11，或12个氨基酸)，或由II类MHC分子处理和呈递的片段，优选地具有 约13个以上的氨基酸的长度，例如，13，14，15，16，17，18，19，20个或甚至更多个氨基酸，其 中这些片段可以选自所述氨基酸序列的任一部分。这些片段典型地以由所述肽片段和MHC 分子组成的复合体形式被T细胞识别，即，所述片段典型地不以它们的天然形式被识别。如本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段还可以包括那些抗原、抗原蛋白或 抗原肽的表位。在本发明的上下文中，表位(还称为“抗原决定簇”)典型地是位于本文定 义的(天然)抗原、抗原蛋白或抗原肽的外表面的片段，优选地具有5-15个氨基酸，更优选 地具有5-12个氨基酸，甚至更优选地具有6-9个氨基酸，其可以被抗体或B细胞受体识别， 艮口，以它们的天然形式被识别。抗原、抗原蛋白或抗原肽的所述表位还可以选自本文提及的 所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体的任一种。在该情形中，抗原决定簇可以是构象或不连 续的表位，其由本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的片段组成，所述片段在本文定义的抗 原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸序列中是不连续的，但是在三维结构中是在一起的或是由 单一多肽链组成的连续的或线性表位。如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的“变体”可以由本发明所述的活性(免疫 刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码，其中编码如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽 的所述至少一种(m)RNA的核酸是交换的。由此，可以产生具有在一个或多个突变，如一个 或多个取代的、插入的和/或删除的氨基酸而与原始序列不同的氨基酸序列的抗原、抗原 蛋白或抗原肽。优选地，与全长天然抗原或抗原蛋白相比较，这些片段和/或变体具有相同 的生物学功能或特异性活性，例如，其特异性抗原特性。本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA还可以编码上文定 义的抗原或抗原蛋白，其中与其生理学序列相比较，所编码的氨基酸序列包括保守氨基酸 取代。那些编码的氨基酸序列以及它们的编码核苷酸序列特别落入如上文定义的术语变体 中。来源于相同种类的氨基酸与另一种交换的取代称为保守取代。特别地，这些是具有脂肪 族侧链、带正电荷或负电荷的侧链、在侧链中具有芳香族基团的氨基酸，或其侧链可以进入氢桥的氨基酸，例如，具有羟基官能的侧链。这意味着，例如，具有极性侧链的氨基酸被具有 同样极性侧链的另一种氨基酸替换，或者例如，以疏水侧链为特征的氨基酸被具有同样的 疏水侧链的另一种氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)置换或亮氨酸 (异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)置换)。插入和取代是可能的，特别是在对三维结构没 有引起修饰或不影响结合区的那些序列位置上。插入或删除对三维结构的修饰可以容易地 确定，例如，使用 CD 光谱确定(圆二色谱)(Urry，1985，Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polyp印tides (多肽的吸附、圆二色性和 ORD)，在Modern Physical Methods in Biochemistry (生物化学的现代物理方法)中，Neuberger等，(ed.)，Elsevier，阿姆斯 特丹)。此外，如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的变体，其可以由本发明所述的活性 (免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码，还可以包括那些序列，其中所述至少一种 (m)RNA的核酸按照遗传密码的简并性进行交换，不导致所述抗原、抗原蛋白或抗原肽的各 自氨基酸序列的改变，即，所述氨基酸序列或至少其部分可以以在上述意义内的一个或多 个突变而并不在原始序列上不同。为了确定两个序列(核酸序列，例如，如本文定义的RNA或mRNA序列，或氨基酸序 列，优选地它们编码的氨基酸序列，例如，如上文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的氨基酸 序列)相同的百分比，可以比对序列，以随后与另一种进行比较。因此，例如，可以在第一序 列的序列中插入缺口，并且可以比较在第二序列的相对应位置处的成分。如果在第一序列 中的位置由与在第二序列中位置处的情形相同的成分占据，则这两个序列在该位置处是相 同的。两个序列相同的百分比是相同的位置数目除以位置总数的函数。两个序列相同的 百分比可以使用数学算法确定。可以应用的数学算法的一个优选的但非限制性的实例是 Karlin 等，(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877 或 Altschul 等，(1997)，Nucleic Acids Res. (核酸研究)，25:3389-3402的算法。这样的算法结合在BLAST程序中。可以通过该程序 鉴定与本发明的序列在某种程度上相同的序列。本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物包括，如上文定义，至少一种RNA，其编码 选自上述组的任意抗原的至少两种(优选不同的)抗原，原因在于按照本发明，前文提及的 组的至少两种(优选不同的)抗原的特定组合能够有效刺激(适应性)免疫系统，以允许 治疗前列腺癌(PCa)。然而，本发明还可以提供这样的活性(免疫刺激性)组合物，其包括 编码选自上述组任意抗原的三种或四种(优选不同的)抗原的至少一种RNA，其中这些抗原 的任意组合是可能的和由本发明涵盖。更优选地，本发明还可以提供包括至少一种RNA的活性(免疫刺激性)组合物，所 述至少一种RNA编码选自上述组的任意抗原的至少三种或四种(优选不同的)抗原，其中 这些抗原的任意组合是可能的。因此，由于另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以编码至少两种(优选不同的)抗原，所述抗原选自上文提及的包括(至 少)任一种下述抗原组合的组的任意抗原· PSA 和 PSMA，或· PSA 和 PSCA，或· PSA 和 STEAP，或
· PSMA 和 PSCA，或· PSMA 和 STEAP，或· PSCA 和 STEAP，或· PSA，PSMA 禾口 PSCA，或· PSA，PSMA 和 STEAP，或· PSMA, PSCA 和 STEAP，或· PSA，PSCA 和 STEAP，或或 · PSA, PSMA, PSCA 和 STEAP.根据另一个优选实施方案，本发明提供一种活性(免疫刺激性)组合物，其包括编 码至少两种、三种或四种(优选地不同抗原)的至少一种RNA，a)其中至少一种抗原选自· STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)；和b)其中其它的抗原选自任意下列抗原或其特定组合的至少一种抗原· PSA (前列腺特异性抗原)，或· PSMA (前列腺特异性膜抗原)，或· PSCA (前列腺干细胞抗原)；或· PSA 和 PSMA，或參 PSA 禾口 PSCA，或· PSMA 和 PSCA ；或· PSA，PSMA 禾口 PSCA。根据甚至更优选的实施方案，本发明提供活性(免疫刺激性)组合物，其包括编码 四种(优选不同的)选自PSA，PSMA, PSCA和STEAP的抗原的活性(免疫刺激性)组合物。本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA典型地是任意RNA，优选地，但不限于此，编码RNA，环形或线性RNA，单链或双链RNA (其还可以视为是由于两个 单链RNA的非共价缔合形成的RNA)或部分双链或部分单链的RNA，其至少部分是自身互补 性的(这些部分双链或部分单链的RNA分子二者典型地由更长和更短的单链RNA分子形 成，或者由两个单链RNA分子形成，其在长度上大约相等，其中一个单链RNA分子部分与另 一而单链RNA分子互补，并且因此二者在该区域形成双链RNA，即，相对于完整的RNA序列部 分是双链或部分是单链的RNA)。更优选地，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的所 述至少一种RNA是单链RNA，甚至更优选地是线性RNA。最优选地，本发明所述的活性(免 疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA是信使RNA (mRNA)。在该情形中，信使RNA (mRNA)典 型地是这样的RNA，其由(至少)一些结构元件组成，例如，任选的5’ -UTR区，位于上游的 核糖体结合位点，之后是编码区，任选的3’-UTR区，其可以后接聚腺苷酸尾(和/或聚胞苷 酸尾)。由于一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少两种(优选不同的)抗原的每一种，可以由一种(单顺反子)RNA编码，优选地一种(单顺 反子)mRNA编码。换言之，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包含至少两种(单顺 反子)RNAs，优选mRNAs，其中这些两种(单顺反子)RNAs、优选mRNAs的每一种可以仅编码 一种(优选不同的)抗原，所述抗原选自上文提及的组或亚组之一，优选地以上文提及的组合之一
按照另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包括 (至少)一种双顺反子或者甚至多顺反子RNA，优选mRNA，S卩，携带至少两种(优选不同的) 抗原的两种或甚至多种编码序列的(至少)一种RNA，所述抗原选自上文提及的组或亚组之 一，优选地在上文提及的组合之一中。所述(至少)一种双顺反子或甚至多顺反子RNA的 至少两种(优选不同的)抗原的所述编码序列可以由至少一个下文定义的IRES(内部核糖 体进入位点)序列分开。因此，术语“编码至少两种(优选不同的)抗原”可以意指，但不限 于，所述(至少)一种(双顺反子或甚至多顺反子)RNA，优选mRNA，可以编码上文提及的抗 原组的至少两种、三种或四种(优选不同的)抗原或在它们上述定义内的片段或变体。更优 选地，但不限于此，所述(至少)一种(双顺反子或甚至多顺反子)RNA，优选mRNA，可以编 码，例如，上文提及的抗原亚组的至少两种、三种或四种(优选不同的)抗原或它们在上述 定义内的片段或变体。在该情形中，如上文定义的所谓的IRES(内部核糖体进入位点)序 列可以作为唯一的核糖体结合位点行使功能，但是它还可以作用为提供如上文定义的编码 几种蛋白的双顺反子或甚至多顺反子RNA，所述蛋白将由彼此独立的核糖体翻译。按照本发 明可以使用的IRES序列的实例是选自小RNA病毒(例如FMDV)，鼠疫病毒(CFFV)，脊髓灰 质炎病毒(PV)，脑心肌炎病毒(ECMV)，口蹄疫病毒(FMDV)，丙型肝炎病毒(HCV)，猪霍乱病 毒(CSFV)，小鼠角膜白斑病毒(MLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的 那些。按照另一个特别优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以包括 如上文定义的至少一种单顺反子RNA、优选mRNA和如上述定义的至少一种双顺反子或甚至 多顺反子RNA、优选mRNA的混合物。所述至少一种单顺反子RNA和/或所述至少一种双顺 反子或甚至多顺反子RNA优选地编码不同的抗原或它们在上述定义内的片段或变体，所述 抗原优选地选自上文提及的抗原组或亚组之一，更优选地在上文提及的组合之一中。然而， 所述至少一种单顺反子RNA和所述至少一种双顺反子或甚至多顺反子RNA可以优选地还编 码选自上文提及的抗原组或亚组之一的(部分)相同的抗原，优选地在上文提及的组合之 一中，条件是本发明的活性(免疫刺激性)组合物完全提供如上文定义的至少两种(优选 不同的)抗原。这样的实施方案可以有利的用于，例如交错的，例如时间依赖性的向需要其 的患者施用本发明的活性(免疫刺激性)组合物。本发明的所述活性(免疫刺激性)组合 物的成分，特别是编码所述至少两种(优选不同的)抗原的不同RNAs，可以，例如，包含在部 分组合物试剂盒(的不同部分)中，或者可以，例如，作为本发明所述的不同活性(免疫刺 激性)组合物的成分分开施用。优选地，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，其编码选自上文定 义的抗原组、更优选地在上述组合中的至少两种(优选不同的)抗原，典型地包括约50-约 20000个，或100-约20000个核苷酸的长度，优选地约250-约20000个核苷酸，更优选地约 500-约10000个，甚至更优选地约500-约5000个核苷酸长度。
按照一个实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，其编码 选自上文定义的抗原组或亚组、更优选地在上述组合中的至少两种(优选不同的)抗原， 可以采用修饰的RNA的形式，其中如本文定义的任何修饰可以引入到所述活性(免疫刺激 性)组合物的所述至少一种RNA中。如本文定义的修饰优选地导致本发明的活性(免疫刺 激性)组合物的稳定的至少一种RNA。按照第一实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可 以因此提供为“稳定的RNA”，优选稳定的mRNA，也就是说，作为基本上抗体内降解(例如， 由外切-或内切-核酸酶进行)的(m)RNA。所述稳定可以，例如，通过本发明的活性(免 疫刺激性)组合物的所述至少一个(m)RNA的修饰的磷酸酯骨架实现。关于本发明的骨架 修饰是其中化学修饰RNA中包含的核苷酸骨架的磷酸酯的修饰。可以优选地用在该情形 中的核苷酸包含，例如，硫代磷酸酯_修饰的磷酸酯骨架，优选地磷酸酯骨架中所包含的至 少一个磷酸氧被硫原子取代。稳定的(m)RNAs还可以包括，例如非离子磷酸酯类似物，诸 如例如，烷基和芳基磷酸酯，其中带电荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替换，或磷酸二酯和烷基 磷酸三酯，其中带电荷的氧残基以烷基化形式存在。所述骨架修饰典型地包括，但不暗示 任何限制，来自由下列各项组成的组的修饰甲基膦酸酯，磷酰胺和硫代硫酸酯(例如，胞 苷-0-(l-硫代磷酸))。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以另外或备选地还包 含糖修饰。与本发明有关的糖修饰是对所述至少一种RNA的核苷酸的糖的化学修饰，并且 典型地包括，不暗示任何限制，选自由下列各项组成的组的糖修饰2'-脱氧-2'-氟-寡 核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氟-2'-脱氧尿苷-5'-三磷 酸)，2'-脱氧-2'-脱氨寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷-5'-三磷酸，2'-氨 基-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)，'-0-烷基寡核糖核苷酸，2'-脱氧-2' -C-烷基寡 核糖核苷酸(2 ‘ -0-甲基胞苷-5'-三磷酸，2'-甲基尿苷-5'-三磷酸)，‘-C-烷 基寡核糖核苷酸，和它们的异构体(2'-阿糖胞苷(araCytidine)-5'-三磷酸，2'-阿 糖尿苷(araUridine)-5'-三磷酸)，或叠氮三磷酸(2'-叠氮-2'-脱氧胞苷-5'-三 磷酸，2'-叠氮-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸)。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以另外或备选地还包含至少一种碱基修饰，与未改变的、即天然(natural)(=天然(native))RNA序列相此较， 其优选地适于显著增加由所述至少一种RNA序列编码的蛋白的表达。在这种情形中，显著 性意指与天然RNA序列的表达相比，蛋白表达增加至少20%，优选地至少30%，40%，50% 或60 %，更优选地至少70 %，80 %，90 %或甚至100 %，并且最优选地至少150 %，200 %或者 甚至300%以上。关于本发明，具有这样的碱基修饰的核苷酸优选地选自由下列各项组成的 碱基-修饰的核苷酸组2_氨基-6-氯嘌呤核苷-5'-三磷酸，2-氨基腺苷-5'-三磷酸， 2_硫胞苷-5'-三磷酸，2-硫尿苷-5'-三磷酸，4-硫尿苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙 基胞苷-5'-三磷酸，5-氨基烯丙基尿苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，5-溴尿 苷-5'-三磷酸，5-碘胞苷-5'-三磷酸，5-碘尿苷-5'-三磷酸，5-甲基胞苷-5'-三 磷酸，5-甲基尿苷-5'-三磷酸，6-氮胞苷-5'-三磷酸，6-氮尿苷-5'-三磷酸，6-氯 嘌呤核苷-5'-三磷酸，7-脱氮腺苷-5'-三磷酸，7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸，8-氮杂 腺苷-5'-三磷酸，8-叠氮腺苷-5'-三磷酸，苯并咪唑-核苷-5'-三磷酸，Nl-甲基腺苷-5'-三磷酸，Nl-甲基鸟苷-5'-三磷酸，N6-甲基腺苷-5'-三磷酸，06-甲基鸟 苷-5'-三磷酸，假尿苷-5'-三磷酸，或嘌呤霉素-5'-三磷酸，黄苷-5'-三磷酸。 对于碱基修饰特别优选的核苷酸选自由下列各项组成的碱基_修饰的核苷酸组5-甲基胞 苷-5'-三磷酸，7-脱氮鸟苷-5'-三磷酸，5-溴胞苷-5'-三磷酸，和假尿苷-5'-三 磷酸。 按照另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 同样可以通过引入进一步修饰的核苷酸进行修饰(且优选地进行稳定)，所述进一步修饰 的核苷酸包含它们的核糖或碱基结构部分的修饰。通常，本发明的活性(免疫刺激性)组 合物的所述至少一种(m)RNA可以包含任何天然的(=天然存在的)核苷酸，例如，鸟苷， 尿嘧啶，腺苷，和/或胞嘧啶或它们的类似物。在该情形中，核苷酸类似物定义为天然存 在的核苷酸的非天然存在的变体。因此，类似物是化学衍生的具有非天然存在的官能团 的核苷酸，所述非天然存在的官能团优选地添加或由天然存在的核苷酸删除，或其取代核 苷酸的天然存在的官能团。因此，天然存在的核苷酸的每个成分可以进行修饰，即，形成 RNA序列的骨架(见上文)的碱基成分、糖(核糖)成分和/或磷酸酯成分。鸟苷、尿嘧 啶、腺苷和胞嘧啶的类似物包括，不暗示任何限制，已经化学改变的任何天然存在的或非天 然存在的鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶，例如，通过乙酰化、甲基化、羟基化等化学改 变，其包括1-甲基-腺苷，I-甲基-鸟苷，1-甲基-肌苷，2，2_ 二甲基-鸟苷，2，6_ 二氨 基嘌呤，2'-氨基-2'-脱氧腺苷，2'-氨基-2'-脱氧胞苷，2'-氨基-2'-脱氧 鸟苷，2'-氨基-2'-脱氧尿苷，2-氨基-6-氯嘌呤核苷，2-氨基嘌呤-核苷，2'-阿 糖腺苷(Araadenosine)，2'-阿糖胞苷(Aracytidine)，2 ‘-阿糖尿苷(Arauridine)， 2'-叠氮-2'-脱氧腺苷，2'-叠氮-2'-脱氧胞苷，2'-叠氮-2'-脱氧鸟苷， 2'-叠氮-2'-脱氧尿苷，2-氯腺苷，2'-氟-2'-脱氧腺苷，2'-氟-2'-脱氧胞 苷，2'-氟-2'-脱氧鸟苷，2'-氟-2'-脱氧尿苷，2'-氟胸苷，2-甲基-腺苷，2-甲 基-鸟苷，2-甲基-硫-N6-异戊烯基(isopenenyl)-腺苷，2' -0-甲基_2_氨基腺苷， 2' -0-甲基-2'-脱氧腺苷，2' -0-甲基-2'-脱氧胞苷，2' -0-甲基-2'-脱氧鸟 苷，2' -0-甲基-2'-脱氧尿苷，2' -0-甲基-5-甲基尿苷，2' -0-甲基肌苷，2' -0-甲 基假尿苷，2-硫代胞苷，2-硫代-胞嘧啶，3-甲基-胞嘧啶，4-乙酰基-胞嘧啶，4-硫尿苷， 5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶，5，6- 二氢尿苷，5-氨基烯丙基胞苷，5-氨基烯丙基-脱氧-尿 苷，5-溴尿苷，5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶，5-氯-阿 糖胞苷，5-氟-尿苷，5-碘尿苷，5-甲氧基羰基甲基-尿苷，5-甲氧基-尿苷，5-甲基-2-硫 代_尿苷，6-氮胞苷，6-氮尿苷，6-氯-7-脱氮-鸟苷，6-氯嘌呤核苷，6-巯基-鸟苷，6-甲 基_巯基嘌呤_核苷，7-脱氮-2 ‘-脱氧-鸟苷，7-脱氮腺苷，7-甲基-鸟苷，8-氮腺苷， 8_溴-腺苷，8-溴-鸟苷，8-巯基-鸟苷，8-氧代鸟苷，苯并咪唑-核苷，β-D-甘露糖基-辫 苷((β-D-marmosyl-queosine)，二氢-尿嘧啶，肌苷，Nl-甲基腺苷，Ν6_([6_氨基己基] 氨基甲酰基甲基)_腺苷，Ν6-异戊烯基-腺苷，Ν6-甲基-腺苷，Ν7-甲基-黄苷，N-尿嘧 啶-5-羟基乙酸甲酯，嘌呤霉素，辫苷(Queosine)，尿嘧啶-5-羟基乙酸，尿嘧啶-5-羟基乙 酸甲酯，Wybutoxosine，黄苷，和木-腺苷。所述类似物的制备是本领域的技术人员已知的， 例如，由美国专利 4，373，071，US 4，401，796，US 4，415，732，US4, 458，066，US 4，500，707， US 4，668，777，US 4，973，679，US 5，047，524，US5, 132，418，US 5，153，319，US 5，262，530和5，700，642可知。在上述类似物的情形中，按照本发明可以特别优选增加本发明活性(免 疫刺激性)组合物的RNA的免疫原性和/或不干扰已经引入的RNA进一步修饰的那些类似 物。按照特别的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 可以包含脂质修饰。所述脂质_修饰的RNA典型地包括如本文定义的RNA，其编码选自上述 定义的抗原组的、优选在上述组合中的至少两种抗原。所述脂质_修饰的RNA典型地进一 步包含与所述RNA共价连接的至少一个连接体，和与各自的连接体共价连接的至少一个脂 质。备选地，所述脂质_修饰的RNA包括如本文定义的(至少一个)RNA和与所述RNA共价 连接(无连接体)的至少一个(双官能性)脂质。按照第三备选方案，所述脂质-修饰的 RNA包括如本文定义的RNA，与所述RNA共价连接的至少一个连接体，和与各自的连接体共 价连接的至少一个脂质，和与所述RNA共价连接(无连接体)的至少一个(双官能性)脂 质。在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA中包含的脂质(与 其复合或共价结合)典型地是脂质或优选自身是生物活性的亲脂残基。所述脂质优选地 包括天然物质或化合物，诸如例如，维生素，例如，α “生育酚(维生素Ε)，包括RRR- α -生 育酚(以前为D-α-生育酚)，L-α-生育酚，外消旋D，L-α -生育酚，维生素E琥珀酸 酯(VES)，或维生素A及其衍生物，例如视黄酸，视黄醇，维生素D及其衍生物，例如维生素 D以及其麦角固醇前体，维生素E及其衍生物，维生素K及其衍生物，例如维生素K和相关 的醌或植醇化合物，或类固醇，如胆汁酸，例如胆酸，脱氧胆酸，脱氢胆酸，可的松，洋地黄毒 苷(digoxygenin)，睾酮，胆固醇或硫代胆固醇。在本发明范围内的其它脂质或亲脂残基 包括，不暗示任何限制，聚二醇(Oberhauser等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1992，20， 533)，脂肪族基团，诸如例如，C1-C20-链烷，C1-C20-链烯或C1-C20-链烷醇化合物，等等， 诸如例如，十二烷二醇，十六醇或i^一烷基残基(Saison-Behmoaras等，，EMBO J，1991，10， 111 ；Kabanov 等，，FEBS Lett. (FEBS 通信)，1990，259，327 ；Svinarchuk 等，，Biochimie, 1993，75，49)，磷脂，诸如例如，磷脂酰甘油，二酰基磷脂酰甘油，磷脂酰胆碱，二棕榈酰磷脂 酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰乙醇胺，双十六烷基_外消旋_甘油 (di-hexadecyl-rac-glycerol)，鞘脂，脑苷脂，神经节苷脂，或三乙基铵1，2_ 二 _0_十六 烷基_外消旋_甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，，Tetrahedron Lett.(四面体通信)， 1995，36，3651 ；Shea 等，，Nucl. Acids Res.(核酸研究)，1990，18，3777)，聚胺或聚二醇，诸 如例如，聚乙二醇(PEG) (Manoharan 等，，Nucleosides & Nucleotides (核苷和核苷酸)， 1995，14，969)，六甘醇(HEG)，棕榈酸甘油酯或棕榈基残基(Mishra等，，Biochim. Biophys. Acta (生物化学生物物理学报)，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇残 基(Crooke 等，，J. Pharmacol. Exp. Ther.(药理学实验治疗杂志)，1996，277，923)，以及蜡， 萜烯，脂环烃，饱和的和单_或多-不饱和脂肪酸残基，等等。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA可以同样进行稳定，以防止RNA在体内被各种途径降解。在本领域已知mRNA或RNA的体内不稳定性和(快速) 降解通常可以在基于RNA的组合物应用中代表着严重的问题。这种RNA不稳定性典型地是 由于RNA-降解酶“RNA酶”(核糖核酸酶)引起，其中所述核糖核酸酶的污染有时可以完全 降解溶液中的RNA。因此，在细胞的细胞质中的天然mRNA降解非常精细地调控，并且RNA酶污染通常可以通过在使用所述组合物之前进行专门的处理而去除，特别是用焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理。在现有技术中，在该情形中，可以使用的多种天然降解机制是已知的。例如， 在体内，末端结构典型地对于mRNA是至关重要的。例如，在天然存在的mRNAs的5'末端通 常存在所谓的“帽结构”(修饰的鸟苷核苷酸)，且在3'末端典型地是多至200个腺苷的核 苷酸的序列(所谓的聚腺苷酸尾)。本发明活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA，特别是如果作为mRNA提 供，因此可以通过添加所谓的“5'帽”结构而抗RNA酶降解被稳定。在这种情形中，特别优 选 m7G(5' )ppp(5' (A, G(5' )ppp(5' )A 或 G(5' )ppp(5' )G 作为 “5'帽”结构。然 而，仅在如果还没有在本发明的免疫刺激性组合物的(m)RNA 5'末端引入修饰如脂质修饰 时或者如果所述修饰 不干扰所述(未修饰的或化学修饰的)(m) RNA的免疫原性特性时引入 这样的修饰。按照更优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA,特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，可以在3'末端包含典型地约10-200个腺苷 核苷酸、优选约10-100个腺苷核苷酸、更优选约20-100个腺苷核苷酸或甚至更优选地约 40-80个腺苷核苷酸的聚腺苷酸尾。按照更优选的实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA，特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，可以在3'末端包含典型地约10-200个胞嘧啶 核苷酸、优选地约10-100个胞嘧啶核苷酸、更优选地约20-70个胞嘧啶核苷酸或甚至更优 选地约20-60个或甚至10-40个胞嘧啶核苷酸的聚胞苷酸尾。按照另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA 可以进行修饰，并且因此被稳定，特别是如果所述RNA采用mRNA形式时，通过改变所述RNA 的G/C含量，优选是至少一种RNA的编码区的G/C含量进行。在本发明的特别优选的实施方案中，与其具体的野生型(m)RNA，即未修饰的(m) RNA编码区的G/C含量相比较，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA 的编码区的G/C含量被改变，特别是增加。与具体的野生型(m) RNA所编码的氨基酸序列相 比较，所述至少一种(m) RNA所编码的氨基酸序列优选不被改变。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA的这种修饰是基于 要翻译的任意(m) RNA区序列对于所述(m) RNA的有效翻译是重要的事实。因此，多种核苷酸 的组成和序列是重要的。特别地，具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增 加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。按照本发明，因此与其野生型(m)RNA相比 较，所述(m)RNA的密码子不同，同时保留所翻译的氨基酸序列，以致它们包括增加量的G/C 核苷酸。关于一些密码子编码一种且是相同的氨基酸的事实(所谓的遗传密码简并性)，可 以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的备选密码子应用)。取决于由所述至少一种(m) RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比较，对于所述 (m) RNA序列的修饰存在多种可能性。在由专门包含G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的 情形中，不需要密码子的修饰。因此，对于Pro (CCC或CCG)，Arg (CGC或CGG)，Ala (GCC或 GCG)和Gly (GGC或GGG)的密码子不需要修饰，因为不存在A或U。相反，包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过编码相同的氨基酸但是不含有A 和/或U的其它密码子的取代而进行修饰。这些的实例如下Pro的密码子可以由CCU或CCA修饰为CCC或CCG ；Arg的密码子可以由CGU或CGA或AGA或AGG修饰为CGC或CGG ；Ala的密码子可以由GCU或GCA修饰为GCC或GCG ；Gly的密码子可以由GGU或GGA修饰为GGC或GGG。在其它情形中，尽管不从所述密码子中去除A或U核苷酸，然而，可以通过使用含 有较低的A和/或U核苷酸含量的密码子而降低A和U含量。这些的实例如下Phe的密码子可以由UUU修饰为UUC ；Leu的密码子可以由UUA，UUG, CUU或CUA修饰为CUC或CUG ；Ser的密码子可以由UCU或UCA或AGU修饰为UCC，UCG或AGC ；Tyr的密码子可以由UAU修饰为UAC ；Cys的密码子可以由UGU修饰为UGC ；His的密码子可以由CAU修饰为CAC ；Gln的密码子可以由CAA修饰为CAG ；Ile的密码子可以由AUU或AUA修饰为AUC ；Thr的密码子可以由A⑶或ACA修饰为ACC或ACG ；Asn的密码子可以由AAU修饰为AAC ；Lys的密码子可以由AAA修饰为AAG ；Val的密码子可以由GUU或GUA修饰为GUC或⑶G ；Asp的密码子可以由GAU修饰为GAC ；Glu的密码子可以由GAA修饰为GAG ；终止密码子UAA可以修饰为UAG或UGA。另一方面，在Met (AUG)和Trp (UGG)的密码子的情形中，不存在序列修饰的可能性。上文列出的取代可以单独的或以所有可能的组合使用，以在与其具体的野生型 (m) RNA (S卩，原始序列)相比较时，提高本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少 一种(m)RNA的G/C含量。因此，例如，在野生型序列中存在的所有Thr密码子可以修饰为 ACC (或ACG)。然而，优选地，例如，使用上述取代可能性的组合将原始序列(野生型(m) RNA)中编码Thr的所有密码子取代为ACC (或ACG)和将原始编码Ser的所有密码子取代为UCC (或UCG或AGC)；将原始序列中编码Ile的所有密码子取代为AUC和将原始编码Lys的所有密码子取代为AAG和将原始编码Tyr的所有密码子取代为UAC ；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC (或GCG)和将原始编码Arg的所有密码子取代为CGC (或CGG)；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Glu的所有密码子取代为GAG和将原始编码Ala的所有密码子取代为GCC (或GCG)和
将原始编码Gly的所有密码子取代为GGC (或GGG)和将原始编码Asn的所有密码子取代为AAC ；将原始序列中编码Val的所有密码子取代为GUC (或GUG)和将原始编码Phe的所有密码子取代为UUC和将原始编码Cys的所有密码子取代为UGC和将原始编码Leu的所有密码子取代为CUG (或CUC)和将原始编码Gln的所有密码子取代为CAG和将原始编码Pro的所有密码子取代为CCC(或CCG)；等等。优选地，与编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或变体的野生型(m) RNA的G/C含量相比较，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m) RNA的编 码区的G/C含量增加至少7%，更优选地至少15%，特别优选地至少20%。按照具体实施方 案，在编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽或其片段或变体的区域中或野生型(m)RNA 序列的完整序列中至少5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，更优选地至少70%，甚至 更优选地至少80%和最优选地至少90%，95%或者甚至100%的可取代的密码子被取代， 由此增加所述序列的GC/含量。在该情形中，与野生型序列相比较，特别优选将本发明的活性(免疫刺激性)组合 物的所述至少一种(m) RNA的G/C含量增加至最大值(S卩，可取代的密码子100%被取代)， 特别是在编码蛋白的区域中。按照本发明，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA的另一 种优选修饰基于这样的发现，即翻译效率也通过细胞中tRNA出现的不同频率确定。因此， 如果在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m) RNA中存在所谓的“罕用密 码子”达到增多的程度，则相应修饰的至少一种(m) RNA序列被翻译至比其中存在编码相对 “频繁” tRNA的密码子的情形显著更差的程度。按照本发明，在本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述修饰的至少一种(m) RNA中，编码辅助蛋白的区域与野生型(m)RNA的相应区域相比被修饰，以致编码细胞中相 对稀有的tRNA的野生型序列的至少一个密码子交换成编码细胞中相对频繁的tRNA的密码 子并携带与相对稀有tRNA相同的氨基酸。通过该变化，改变本发明的活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种(m)RNA的序列，从而插入可以获得频繁出现的tRNA的密码子。换 言之，按照本发明，在各种情形中，通过该变化，野生型序列的编码细胞中相对稀有的tRNA 的所有密码子可以交换成编码细胞中相对频繁的tRNA的密码子，并且其，在各种情形中， 携带与相对稀有tRNA相同的氨基酸。哪些tRNA在细胞中相对频繁出现和相反地哪些相对罕见出现是本领域中技术人员已知的，cf.例如Akashi，Curr. Opin. Genet. Dev.(当前遗传发育观点)2001，11 (6) 660-666。特别优选对于特定氨基酸，使用最频繁出现的tRNA的密码子，例如Gly密码子， 其使用在(人)细胞中最频繁出现的tRNA。按照本发明，特别优选的是将本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述修饰的 至少一种(m) RNA中增加的特别是最大化的序列G/C含量与不改变由所述(m) RNA编码区编 码的蛋白的氨基酸序列的“频繁”密码子相连。这个优选的实施方案容许提供本发明的活 性(免疫刺激性)组合物的特别有效翻译和稳定(修饰)的至少一种(m)RNA。
如上述的本发明的活性(免疫刺激性)组合物的修饰的至少一种(m)RNA的确定 (增加的G/C含量；tRNA的交换)可以利用WO 02/098443中解释的计算机程序进行——其 公开内容全文包括在本发明中。利用该计算机程序，任何所需的(m)RNA的核苷酸序列可以 借助于遗传密码或其简并性质来修饰，由此最大G/C含量结果，与使用编码细胞中尽可能 频繁出现的tRNA的密码子相结合，导致由所述修饰的至少一种(m) RNA编码的氨基酸序列 与未修饰的序列相比，优选不被改变。备选地，与原始序列相比，还可能仅改变G/C含量或 仅改变密码子的使用。Visual Basic (视觉基础)6. 0(使用的开发环境具有Servic印ack3 的 Microsoft Visual StudioEnterprise6. 0)中的源码也记述在 WO 02/098443 中。在本发明的另一个优选实施方案中，本发明的活性(免疫刺激性) 组合物的至少 一种(m) RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量与其特定野生型(m) RNA的核糖体结合 位点环境中A/U含量相比是增加的。该修饰(在核糖体结合位点周围增加的A/U含量) 增加核糖体结合所述至少一种(m)RNA的效率。核糖体与核糖体结合位点(Kozak序列 GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO 27)，AUG形成起始密码子)的有效结合又具有有效翻译所述至 少一种(m) RNA的作用。按照本发明的另一个实施方案，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种 (m) RNA可以关于潜在地促降解序列元件(destabilizingsequence elements)而被修饰。 具体地，所述至少一种(m)RNA的编码区和/或5’和/或3’非翻译区与特定野生型(m)RNA 相比可以被修饰，从而不包含促降解序列元件，所修饰的至少一种(m)RNA的编码氨基酸序 列与其特定野生型(m) RNA相比优选不被改变。已知，例如，在真核生物的RNA序列中存在 促降解序列元件(DSE)，信号蛋白与其结合并在体内调节RNA的酶降解。为了进一步稳定所 修饰的至少一种(m)RNA，任选地在编码本文定义的抗原、抗原蛋白或抗原肽的区域内，可以 因此进行与野生型(m)RNA的相应区域相比的一种或多种这样的修饰，从而使其中不含有 或基本上不含有促降解序列元件。按照本发明，也可以通过所述修饰，从本发明的活性(免 疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA中除去非翻译区(3'-和/或5' -UTR)中存在的 DSE。所述促降解序列是例如富含AU的序列(AURES)，其存在于许多不稳定RNA的 3 ‘ -UTR 部分(Caput 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)1986，83 1670-1674)。因此按照本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA与野生型 (m)RNA相比，优选被修饰使得该所述至少一种(m)RNA不含有所述促降解序列。这还应用于 那些由可能的核酸内切酶识别的序列基序，例如序列GAACAAG，其包含在编码转铁蛋白受体 的基因的 3' -UTR 片段中(Binder 等，EMBO J. (ΕΜΒ0 杂志)1994，13 1969-1980)。在本发 明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA中，这些序列基序优选地被去除。按照本发明还优选地，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA，以 修饰的形式，具有如上文定义的以修饰形式存在的至少一个IRES和/或至少一个5'和/ 或3'稳定序列，例如，以增强核糖体结合或允许位于本发明的活性(免疫刺激性)组合物 的至少一种(双_或甚至是多顺反子)RNA上的不同编码的抗原的表达。按照本发明，本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种(m)RNA还更优 选地具有至少一个5'和/或3'稳定序列。这些位于5’和/或3’非翻译区的稳定序列具 有增长所述至少一种(m)RNA在细胞溶胶中半衰期的作用。这些稳定序列可以与在病毒、细菌和真核生物中存在的天然存在序列具有100%序列同源性，但也可以是部分或完全合成 的。例如来自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的珠蛋白基因的不翻译 序列(UTR)可以作为可以在本发明中关于稳定的RNA使用的稳定序列的实例提及。稳定序 列的另一个实例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID N0:28)，其包含在编 码珠蛋白、(I) _胶原蛋白、15-脂加氧酶或编码酪氨酸羟化酶的非常稳定的RNA的3’UTR中 (参见 Holcik 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美国国家科学院学报)1997,94 =2410-2414)。 所述稳定序列当然可以单独或彼此组合使用，并且还与本领域中技术人员已知的其他稳定 序列组合使用。本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种(m)RNA因此优选表示为 珠蛋白UTR(非翻译区)_稳定的RNA，特别地表示为珠蛋白UTR-稳定的RNA。然而，关于本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA优选地进行碱基 的置换、添加或去除，其利用用来制备本发明的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA 的DNA基质使用公知的基因定点诱变或寡核苷酸连接策略技术进行(参见例如Maniatis 等，Molecular Cloning =ALaboratory Manual (分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (冷泉港实验室出版社)，第三版，Cold Spring Harbor(冷泉港)， 纽约，2001)。在该过程中，为了制备所述至少一种(m)RNA，可以在体外转录相应的DNA分 子。该DNA基质优选地包括合适的启动子，例如T7或SP6启动子，以用于体外转录，其后是 待制备的所述至少一种RNA的理想核苷酸序列和体外转录的终止信号。形成至少一种目 的RNA基质的DNA分子可以通过发酵增殖和随后分离为可以在细菌内复制的质粒的一部分 来制备。可以作为适合于本发明提及的 质粒是例如质粒pT7Ts (GenBank编号U26404 ；Lai 等，Development (发育)1995，121 2349-2360)，pGEM 系列，例如pGEM -l (GenBank 编号 X65300 ；来自 Promega)和 pSP64(GenBank 编号 X65327)；还参考Mezei 和 Storts， Purification of PCRProducts (PCR 产物的纯化)，在Griffin 和 Griffin (编)，PCR Technology =Current Innovation (PCR 技术当前改革)中，CRC Press (CRC 出版社)，Boca Raton, FL,2001 ο本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的稳定可以同样通过 将所述至少一种RNA与阳离子化合物缔合或复合、或与其结合而进行，所述阳离子化合物 特别是聚阳离子化合物，例如，(聚)阳离子肽或蛋白。特别地，使用鱼精蛋白、核仁蛋白 (nucleoline)、精胺(spermin)或亚精胺作为聚阳离子，针对RNA的核苷酸结合蛋白是特别 有效的。此外，同样可以使用其它阳离子肽或蛋白，诸如聚-L-赖氨酸或组蛋白。用于稳定 RNA的这一方法记述在EP-A-1083232中，其公开内容通过弓I用完全结合在本发明中。可以 用于稳定本发明的活性(免疫刺激性)组合物的RNA的其它优选的阳离子物质包括阳离子 多糖，例如，脱乙酰壳多糖、聚凝胺(polybrene)、聚氮丙啶(PEI)或聚-L-赖氨酸(PLL)等。 本发明活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA与阳离子化合物(例如，作为基于脂 质的复合剂的阳离子蛋白或阳离子脂质，例如，oligofectamine)的缔合或复合优选地增加 作为药物活性成分存在的所述至少一种RNA向待治疗的细胞或待治疗的生物体内的转运。 关于通过复合稳定本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的稳定作用， 还参考本文的公开内容，其也支持RNA的稳定。按照另一个特别优选的实施方案，所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一 种RNA可以另外或备选地编码分泌信号肽。所述信号肽是这样的序列，其典型地表现出约15-30个氨基酸的长度，且优选地位于所编码的肽的N端，并不限于此。如本文定义的信号 肽优选地允许由所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA编码的抗原、抗原蛋 白或抗原肽转运到限定的细胞区室中，优选地转运到细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶 体区室中。如本文定义的分泌信号肽序列的实例包括，但不限于此，经典或非经典MHC-分 子的信号序列(例如，MHC I和II分子的信号序列，例如，I类MHC分子HLA-A*0201的信号 序列)，如本文定义的细胞因子或免疫球蛋白的信号序列，如本文定义的免疫球蛋白或抗体 的不变链的信号序列，Lampl、Tapasin、Erp57、Calretikulin、钙联蛋白(Calnexin)、和其它 膜缔合蛋白或与内质网(ER)或内体-溶酶体区室缔合的蛋白的信号序列。特别优选地，按 照本发明可以使用I类MHC分子HLA-A*0201的信号序列。任何上述修饰可以应用于本发明的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种 RNA上，并且还应用于在本发明的情形中所使用的任意(m) RNA上，并且可以，如果合适或需 要，以任意组合彼此组合，条件是这些修饰组合在各自的至少一种RNA中彼此互不干扰。本 领域技术人员能够因此进行他的选择。按照另一个实施方案，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物可以包括佐剂。 在该情形中，佐剂可以理解为适于支持本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的施用 和递送的任何化合物。此外，所述佐剂可以，不限于此，起始或增加先天免疫系统的免疫反 应，即，非特异性免疫反应。换言之，当施用时，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物 典型地由于由包含在本发明的活性(免疫刺激性)组合物中的至少一种RNA编码的至少 两种抗原而起始适应性免疫反应。另外，本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物可以由 于加入如本文为本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物限定的佐剂而产生(支持性) 先天性免疫反应。所述佐剂可以选自本领域技术人员已知的和适用于本情形的任何佐剂， 即，支持在哺乳动物中诱导免疫反应的任何佐剂。优选地，所述佐剂可以选自由下列各项 组成的组，但不限于此TDM，MDP，胞壁酰二肽，泊洛沙姆(pluronics)，明矾溶液，氢氧化 铝，ADJUMER (聚磷腈)；磷酸铝凝胶；源自藻类的葡聚糖；algammulin ；氢氧化铝凝胶(明 矾)；高蛋白吸附性氢氧化铝凝胶；低粘性氢氧化铝凝胶；AF或SPT(角鲨烷乳状液(5% )， 吐温80(0. 2% )，泊洛沙姆L121(1.25% )，磷酸盐缓冲液，pH 7.4) ；AVRIDINE (丙烷二 胺)；BAYR1005 ((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基_b_D_吡喃葡糖基)_N_十八烷基-十二 烷酰-酰胺氢化乙酸(hydroacetate)) ；CALCITRI0L (1-α，25-二羟基-维生素D3)；磷 酸钙凝胶；CAPTM(磷酸钙纳米颗粒)；霍乱全毒素，霍乱-毒素-Al-蛋白-A-D-片段融合 蛋白，霍乱毒素的B亚基；CRL 1005(嵌段共聚物Ρ1205)；包含细胞因子的脂质体；DDA(二 甲基双十八烷基溴化铵)；DHEA(脱氢表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)；DMPG(二 肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DOC/明矾复合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐 齐U; Y菊粉；Gerbu佐剂(下列各项的混合物i)N-乙酰葡糖胺基-(Pl-4)-N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酰基-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii) 二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，iii)锌-L-脯 氨酸盐复合物(ZnPro-8) ；GM-CSF) ；GMDP (N-乙酰葡糖胺基-(bl_4)-N-乙酰胞壁酰-L-丙 氨酰基-D-异谷氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)； ImmTher (N-乙酰葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰-L-Ala-D-异Glu-L-Ala- 二棕榈酸甘油酯)； DRVs (由脱水-再水合小泡制备的免疫脂质体)；干扰素-Y ；白介素-1 β ；白介素-2;白介 素-7 ；白介素-12 ； ISC0MS ； ISC0PREP 7. 0. 3. ；脂质体；L0X0RIBINE (7-烯丙基-8-氧代鸟苷)；LT 口服佐剂(大肠杆菌(E.coli)易变肠毒素-前毒素)；任意组成的微球体和微 粒；MF59 ;(角鲨烯-水乳状液)；MONTANIDE ISA51 (纯化的不完全弗氏佐剂)；MONTANIDE ISA 720 (可代谢的油佐剂)；MPL (3-Q-去酰基-4'-单磷酰基脂质A) ；MTP-PE和MTP-PE 脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2- (1，2- 二棕榈酰基-sn-甘 油 _3-(羟基磷酰氧基))-乙基酰胺，一钠盐)；MURAMETIDE (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH 3) ；MURAPALMITINE 和 D-MURAPALMITINE (Nac-Mur-L-Thr-D-异 Gln-sn-甘油二棕榈酰)； NAGO(唾液酸苷酶-半乳糖氧化酶)；任意组成的纳米球体或纳米颗粒；NISVs (非离子表 面活性剂小泡)；PLEURAN ( β -葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA (乳酸和乙醇酸的同聚物-和共 聚物；微球体/纳米球体)；PLUR0NICL121 ;PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；P0DDS (类蛋白 微球体)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；聚_rA:聚-rU(聚腺苷酸-聚尿苷酸复合物)；聚山 梨酸酯80 (吐温80)；螺旋状蛋白(Avanti极性脂质公司(Avanti Polar Lipids, Inc.), Alabaster, AL) ；STIMUL0N (QS-21) ；Quil-A (Quil-A 皂角苷)；S-28463 (4-氨基-otec-二 甲基-2-乙氧基甲基-IH-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-ItmC Syntex佐剂制剂〃)； Sendai脂蛋白体(proteoliposomes)和包含Sendai的脂质基质；Span-85 (失水山梨糖醇 三油酸酯)；Specol (Marcol 52，司盘85和吐温85的乳液)；角鲨烯或Robane (2,6,10, 15，19，23-六甲基二十四烧和 2，6，10，15，19，23—六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四烧 己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐)；Theramid (N-乙酰葡糖胺基-N-乙 酰基胞壁酰-L-Ala-D-异 Glu-L-Ala- 二棕榈氧基丙酰胺)；Theronyl-MDP (Termurtide 或[thr U-MDP ；N-乙酰基胞壁酰-L-threonyl-D-异谷氨酰胺)；Ty颗粒(Ty-VLPs或病 毒样颗粒)；Walter-Reed脂质体(包含吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)，和脂质 肽，其包括Pam3Cys，特别是铝盐，诸如Adju-phos，铝胶(Alhydrogel)，Rehydragel ；乳状 液，其包括 CFA，SAF, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin ；共聚物，其包 括 Optivax (CRL1005)，L121, Poloaxmer4010)，等；脂质体，其包括 Stealth，cochleates, 包括BIORAL ；植物来源的佐剂，其包括QS21，Quil A，Iscomatrix, ISCOM ；适于共刺激的佐 齐IJ，其包括番茄素，生物聚合物，其包括PLG，ΡΜΜ，菊粉；微生物来源的佐剂，其包括罗莫肽， DET0X，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR 1-10的配体，鼠TLR 1-13的配体， ISS-1018, IC31，咪唑并喹啉，阿普林津，Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs，霍乱毒素，热变性 毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI锚定子，LNFPII I/Lewis X，抗微生物肽，UC-1V150，RSV融合 蛋白，cdiGMP ；和适合用作拮抗剂的佐剂，包括CGRP神经肽。 合适的佐剂还可以选自阳离子或聚阳离子化合物，其中所述佐剂优选地在本发明的活性(免疫刺激性组合物)的所述至少一种RNA与所述阳离子或聚阳离子化合物复合 时制备。所述活性(免疫刺激性)组合物的RNA与本文定义的阳离子或聚阳离子化合物 的缔合或复合优选地为佐剂提供特性，并且赋予所述活性(免疫刺激性)组合物的所述 至少一种RNA的稳定作用。特别地，所述优选的阳离子或聚阳离子化合物选自阳离子或 聚阳离子肽或蛋白，其包括鱼精蛋白，核仁蛋白，精胺或亚精胺，或其它阳离子肽或蛋白， 诸如聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，穿透细胞的肽(CPPs)，其包括HIV-结 合肽，Tat, HIV-I Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin, VP22 来源的或类似物肽，HSV VP22(单纯疱疹)，MAP，KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620，富含脯氨酸的肽，富含精 氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，MPG-肽，Pep-1, L-寡聚物，降钙素肽，触角足来源的肽(特另1J是来自 Drosophila antennapedia), ρAntp, plsl, FGF,乳铁转运蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-来源的肽，SAP，鱼精蛋白，精胺，亚精 胺，或组蛋白。其它优选的阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖，例如，脱乙酰 壳多糖，聚凝胺，阳离子聚合物，例如聚氮丙啶(PEI)，阳离子脂质，例如DOTMA :[1-(2， 3-sioleyloxy)丙基)]-N，N, N-三甲基氯化铵，DMRIE，二 -C14-脒，DOTIM，SAINT，DC-Chol， BGTC, CTAP, DOPC, DODAP, DOPE 二油基磷脂酰乙醇胺，DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS Dioctadecylamidoglicylspermin, DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵， DOTAP 二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙烷，DC-6-14 :0，O-双十四烷酰-N- ( α -三甲基氨 溶乙酰基)二乙醇胺氯，CLIPl 外消旋-[(2，3-双十八烷基氧基丙基)(2-羟基乙基)]_ 二 甲基氯化铵，CLIP6:外消旋-[2(2，3_双十六烷基氧基丙基-羟甲基氧基)乙基]三甲基 铵，CLIP9:外消旋-[2 (2，3-双十六烷基氧基丙基-羟基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵， oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物，例如改性聚氨基酸，诸如β -氨基酸-聚 合物或反转聚酰胺，等，改性聚乙烯，诸如PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，等， 改性丙烯酸脂，诸如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))，等，改性酰氨基胺 (Amidoamines)诸如pAMAM(聚(酰氨基胺))，等，改性聚β氨基酯(PBAE)，诸如二胺末端 改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，等，树状聚体，诸如聚丙胺树 状聚体或基于PAMAM的树状聚体，等，聚亚胺，诸如PEI 聚(乙烯亚胺)，聚(丙烯亚胺)， 等，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，诸如基于环糊精的聚合物，基于葡萄糖的聚合物，脱 乙酰壳聚糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，诸如PMOXA-PDMS共聚物，等，嵌段聚合 物，其由一个或多个阳离子嵌段(例如，选自如上文提及的阳离子聚合物)的组合和一个或 多个亲水_或疏水_嵌段(例如，聚乙二醇)的组合组成；等。另外，可以通过与所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA复合而 用作佐剂的优选的阳离子或聚阳离子蛋白或肽，可以选自具有下述总式(I)的蛋白或肽 (Arg)1 ； (Lys) m ； (His)n ； (Orn)。；(Xaa)x，其中 l+m+η+ο+χ = 8-15，并且 1，111，11或0 彼此独立 地可以是选自 0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15 的任一数字，条件是 Arg，Lys， His和Orn的总含量占该寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn外的天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且χ可以是选自0， 1,2, 3或4的任一数字，条件是Xaa的总含量不超过该寡肽所有氨基酸的50%。在该情形中 特别优选的低聚精氨酸是，例如，Arg7, Arg8, Arg9, Arg7, H3R9，R9H3, H3R9H3, YSSR9SSY, (RKH)4, Y (RKH) 2R，等。此外，合适的佐剂可以选自具有式(II)的核酸=G1XmGn，其中G是鸟苷，尿嘧啶或 是鸟苷或尿嘧啶的类似物；χ是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的类 似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，G是鸟苷或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核 苷酸是鸟苷或其类似物；m是整数，并且至少为3 ;其中当m= 3时，X是尿嘧啶或其类似物， 当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或其类似物；η是1_40的整数，其中当η = 1时，G 是鸟苷或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物。其它合适的佐剂还可以选自具有式(III)的核酸=C1XmCn，其中C是胞嘧啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核 苷酸的类似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物；m是整数，并且至少为3 ；其中当m = 3时，X是尿嘧 啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或其类似物；η是1_40的整数，其 中当η = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当η > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似 物。按照一个优选实施方案，本发明还可以提供包含本发明所述的活性(免疫刺激性)组合物的疫苗。本发明的疫苗可以另外包含药用载体和/或其它辅助物质和添加剂和 /或佐剂。按照特别优选的实施方案，由包含在本发明的疫苗中的所述活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种RNA编码的抗原选自上述提及的组。本发明的疫苗典型地包括安全且有效量的如上述定义的所述活性(免疫刺激性) 组合物的所述至少一种RNA，其编码如上述定义的至少两种抗原，更优选地编码选自上述组 的任一项的至少两种抗原，最优选地以所示组合的任一种。当用于本文时，“安全且有效量” 意指所述疫苗中所述活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的量，所述量足以显 著诱导前列腺癌(PCa)，优选肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，和与其相关的疾病 或病症的积极缓和。然而，同时，“安全且有效量”是足以避免严重副作用的少量，即，足以允 许优点和风险之间的合理关系。这些限制的确定典型地在合理的医学判断的范围之内。关 于本发明的疫苗，表述“安全且有效的量”优选地意指这样的RNA量(和由此所编码的至少 两种抗原的量)，其适于以这样的方式刺激适应性免疫系统，以致不获得过量的或破坏性的 免疫反应，但是，优选地，也没有低于可测量水平的这样的免疫反应。如上文定义的疫苗中 活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA的所述“安全且有效量”还可以取决于RNA 的类型进行选择，例如，单顺反子、双_或甚至多顺反子RNA，这是因为双-或甚至多顺反子 RNA可以导致比使用等量单顺反子RNA显著更高的编码抗原的表达。包含在本发明疫苗中 的如上文定义的活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA的“安全且有效量”，还将与待 治疗的特定病症相关而不同，并且还与待治疗的患者的年龄和身体条件、病症的严重性、治 疗的持续时间、伴随治疗的性质、所用的特定药用载体、以及类似因素相关，这在陪同医师 的知识和经验范围内。按照本发明的疫苗可以按照本发明作为药物组合物或作为疫苗用于 人以及用于兽医医学目的。按照本发明的疫苗典型的包含药用载体。当用于本文时，表述“药用载体”优选 地包括基于液体或非液体的本发明的疫苗。如果本发明的疫苗以液体形式提供，则载体典 型地是无热原的水；等渗盐水或缓冲的(水性)溶液，例如，磷酸盐_、柠檬酸盐等-缓冲溶 液，等等。特别地对于本发明疫苗的注射，可以使用水，或者优选地使用缓冲液，更优选地 使用水性缓冲液，其包含钠盐，优选至少50mM的钠盐，钙盐，优选至少0，OlmM的钙盐，和任 选地钾盐，优选至少3mM的钾盐。按照优选实施方案，所述钠、钙和任选地钾盐可以以它们 的卤化物形式存在，例如，氯化物、碘化物或溴化物，以它们的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、 或硫酸盐等形式存在。不限于此，钠盐的实例包括，例如NaCl，NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4，任选地钾盐的实例包括，例如KC1，KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4，和钙盐的实例包括 例如CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)20此外，缓冲液中可以包含前述阳离子的有 机阴离子。按照更优选的实施方案，如上文定义适于注射目的的缓冲液可以包含选自氯化 钠(NaCl)，氯化钙(CaCl2)和任选地氯化钾(KCl)的盐，其中除了氯化物之外可以存在其它 阴离子。CaCl2也可以被另一种盐如KCl替换。典型地，注射缓冲液中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)，至少3mM氯化钾(KCl)和至少0，OlmM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。所述注射缓冲液可以相对于特定的参照介质是高渗的、等渗的或低渗的，即，相对于特定的参照介 质，所述缓冲液可以具有更高、相等或更低的盐含量，其中优选地可以使用前文提及的盐的 所述浓度，其不导致由于渗透或其它浓度影响引起的对细胞的损伤。参照介质为，例如，在 “体内”方法中存在的液体，如血液、淋巴、细胞质液体、或其它体液，或者例如可以在“体外” 方法中用作参照介质的液体，诸如普通缓冲剂或液体。所述普通缓冲剂或液体是技术人员 已知的。Ringer-乳酸盐溶液特别优选地用作液体基础。然而，还可以使用适用于施用给人的一种或多种相容的固体或液体填充剂或稀释 剂或包封化合物。术语“相容”用在本文意指本发明疫苗的组成能够以在典型的使用条件下 不发生显著降低本发明疫苗的药物效用的相互作用的方式与所述活性(免疫刺激性)组合 物的、编码如上文定义的至少两种抗原的所述至少一种RNA相混合。当然，药用载体、填充 剂和稀释剂具有充分高的纯度和充分低的毒性，以使得它们适用于施用给待治疗的人。可 以用作药用载体、填充剂或其组成的化合物的一些实例为糖，诸如例如，乳糖、葡萄糖和蔗 糖；淀粉，诸如例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如例如，羧甲基纤维素 钠，乙基纤维素，醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；牛脂；固体助流剂，诸如例如，硬 脂酸，硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如例如，花生油，棉籽油，芝麻油，橄榄油，玉米油和可 可油；多元醇，诸如例如，聚丙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露醇和聚乙二醇；褐藻酸。药用载体的选择主要由施用本发明疫苗的方式决定。例如，本发明的疫苗可以系 统性或口服施用。系统性施用的途径通常包括，例如，透皮、口服、肠胃外途径，包括皮下、静 脉内、肌内、动脉内、皮内和腹膜内注射和/或鼻内施用途径。局部施用途径通常包括，例 如，局部施用途径以及皮内、透皮、皮下、或肌内注射或损伤内、颅骨内、肺内、心脏内、和舌 下注射。更优选地，疫苗可以通过皮内、皮下、或肌内途径施用。因此，组合物/疫苗优选地 配制为液体或固体形式。本发明的疫苗施用的适合量可以通过用动物模型进行常规实验确 定。所述模型包括，但不暗示任何限制，兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗和非人灵长动物模型。优选 的用于注射的单位剂型包括无菌水溶液、生理盐水或它们的混合物。所述溶液的PH应该调 节为约7. 4。用于注射的合适载体包括水凝胶、可控或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。 用于局部应用的合适的药用载体包括适合用在洗液、膏剂、凝胶等中的那些。如果本发明的 疫苗应该经口施用，片剂、胶囊等是优选的单位剂型。用于制备可以用于口服施用的单位剂 型的药用载体在现有技术中是公知的。其选择取决于次要的考虑，如口味、成本和保存性， 其对于本发明的目的不是至关重要的，并且可以由本领域的技术人员不费力的确定。本发明的疫苗可以另外包含一种或多种辅助物质，以进一步增加免疫原性。由此 优选地获得如上文定义的活性(免疫刺激性)组合物的所述至少一种RNA和如上文所述 还可以任选地包含在本发明疫苗中的辅助物质的协同作用。取决于辅助物质的各种类型， 在这一方面可以考虑多种机制。例如，允许树突细胞(DCs)成熟的化合物，例如脂多糖， TNF-α或⑶40配体，形成第一类合适的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”(LPS， GP96，等)方式影响免疫系统的任何试剂或以靶向方式允许由本发明所述的免疫刺激佐剂 产生的免疫反应被增强和/或被影响的细胞因子如GM-CFS作为辅助物质。特别优选的辅 助物质为细胞因子，诸如，单核因子，淋巴因子，白介素或趋化因子，其一一除了通过所编 码的至少两种抗原诱导适应性免疫反应之外促进先天性免疫反应，诸如IL-1，IL-2，IL-3, IL-4, IL-5, IL-6， IL-7， IL-8， IL-9， IL-10， IL-12， IL-13， IL-14， IL-15， IL-16， IL-17, IL-18, IL-19, IL-20， IL-21， IL-22， IL-23， IL-24， IL-25， IL-26， IL-27， IL-28， IL-29, IL-30, IL-31, IL-32，IL-33，INF-α，IFN-β，INF- γ , GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-β 或TNF-α，生长因子，如hGH。可以包含在本发明的疫苗中的其它添加剂为乳状液，诸如例如，Tween _润剂， 诸如例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；口味赋予剂，药用载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化 剂；防腐剂。本发明的疫苗还可以另外包含任何其它化合物，已知其由于其针对人Tol 1-样受 体 TLR1，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLRlO 的结合亲和力(作为配 体)、或由于其针对鼠 Toll-样受体 TLRl，TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLRl 1，TLR12或TLR13的结合亲和力(作为配体)而是免疫刺激性的。在该情形中，可以添加到本发明疫苗中的另一类化合物可以是CpG核酸，特别 是 CpG-RNA 或 CpG-DNA。CpG-RNA 或 CpG-DNA 可以是单链 CpG-DNA (ss CpG-DNA)，双链 CpG-DNA (dsDNA)，单链 CpG-RNA (ssCpG-RNA)或双链 CpG-RNA (ds CpG-RNA)。CpG 核酸优选 地以CpG-RNA形式存在，更优选地以单链CpG-RNA (ss CpG-RNA)形式存在。CpG核酸优选地 包含至少一个或多个(促有丝分裂的)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。按照第 一个优选的备选方案，包含在这些序列中的至少一个CpG基序，即CpG基序的C(胞嘧啶) 和G(鸟嘌呤)，是未甲基化的。任选地包含在这些序列中的所有其它胞嘧啶或鸟嘌呤可以 是甲基化的或未甲基化的。然而，按照更优选的备选方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟 嘌呤)还可以以甲基化形式存在。按照本发明另一个优选的目的，本发明的活性(免疫刺激性)组合物可以(用于 制备本发明所述的疫苗)用于治疗前列腺癌(PCa)，优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性 前列腺癌，和与其相关的疾病或病症。按照本发明的另一个优选的目的，如本文定义的本发明的疫苗或编码至少两种 (优选地)不同的抗原的至少一种RNA可以用于治疗前列腺癌(PCa)，优选地肿瘤辅助治疗 和/或激素难治性前列腺癌，和与其相关的疾病或病症。在该情形中，治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺 癌和与其相关的疾病或病症的方法也包含在本发明中，所述方法通过向需要其的患者施用 药物有效量的本发明的疫苗、或药物有效量的本发明的活性(免疫刺激性)组合物进行。 所述方法典型地包括制备本发明的活性(免疫刺激性)组合物、或本发明的疫苗的任选的 第一步骤，和第二步骤，其包括向需要其的患者施用(药物有效量的)所述本发明的活性 (免疫刺激性)组合物或所述本发明的疫苗。需要其的患者典型地选自任何哺乳动物。在 本发明的情形中，哺乳动物任选地选自包括但不限于下列各项的组例如，山羊、牛、猪、狗、 猫、猴、猿，啮齿动物如小鼠、仓鼠、兔，以及特别是人，其中所述哺乳动物典型地患有前列腺 癌(PCa)，优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌和与其相关的疾病或病症。本发明还涉及如本文定义的本发明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种 (优选地)不同抗原的所述至少一种RNA (用于制备本发明的疫苗)、优选地用于在哺乳动 物中引发免疫反应、优选地用于治疗前列腺癌(PCa)、更优选地用于治疗肿瘤辅助治疗和/ 或激素难治性前列腺癌和与其相关疾病或病症的应用。
类似地，本发明还涉及如本文定义的本发明的疫苗本身或编码至少两种(优选 地)不同抗原的所述至少一种RNA用于在哺乳动物中引发适应性免疫反应、优选地用于治 疗前列腺癌(PCa)、更优选地用于治疗肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，和与其相 关疾病或病症的应用。 预防或治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，和 与其相关的疾病或病症可以通过一次性或以时间交错方式施用本发明的活性(免疫刺激 性)组合物和/或本发明的疫苗而进行，例如，作为多部件的试剂盒，每个部件包含至少一 种优选不同的抗原。对于施用，优选地可以使用如上文定义的任何施用途径。例如，人们可 以通过基于由本发明活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA编码的至少两种(特别选 择的)抗原诱导或增强适应性免疫反应而治疗前列腺癌(PCa)，优选地肿瘤辅助治疗和/或 激素难治性前列腺癌，和与其相关的疾病或病症。然后，可以在施用另一种如本文定义的本 发明的创造性活性(免疫刺激性)组合物和/或本发明的疫苗之前、同时和/或随后进行施 用本发明的创造性活性(免疫刺激性)组合物和/或本发明的疫苗，其中所述另一种本发 明的创造性活性(免疫刺激性)组合物和/或本发明的疫苗可以包含编码不同抗原的RNA 的另一种组合，其中由本发明活性(免疫刺激性)组合物的至少一种RNA编码的每种抗原 可以优选地适用于治疗前列腺癌(PCa)，更优选地适用于治疗肿瘤辅助治疗和/或激素难 治性前列腺癌，和与其相关的疾病或病症。在该情形中，如本文定义的治疗还可以包括与前 列腺癌(PCa)相关的疾病、优选肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，和与其相关疾病 或病症的调节。按照另一个实施方案，本发明还包括如本文定义的本发明活性(免疫刺激性)组 合物或编码至少两种(优选地)不同的抗原的至少一种RNA (用于制备(本发明)疫苗)用 于在哺乳动物中调节、优选诱导或增强如本文定义的免疫反应的、更优选地治疗和/或支 持前列腺癌(PCa)、特别是肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，或与其相关的疾病或 病症的应用。在该情形中，前列腺癌(PCa)的治疗的支持可以是诸如手术、放射治疗、激素 治疗、偶尔的化疗、质子治疗或者这些中的一些的组合的常规前列腺癌治疗方法的任意组 合，和使用如本文定义的本发明活性(免疫刺激性)组合物的治疗。对前列腺癌(PCa)的 治疗的支持还可以在本文定义的任意其它实施方案中讨论。如本文定义的本发明的活性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种(优选地)不 同的抗原的至少一种RNA或本发明的疫苗的施用可以在时间交错治疗中进行。时间交错的 治疗可以是，例如，在前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素_难治性前列腺癌， 和与其相关的疾病或病症的常规疗法之前、同时和/或随后施用如本文定义的本发明的活 性(免疫刺激性)组合物或编码至少两种(优选地)不同的抗原的至少一种RNA或本发明 的疫苗，例如，通过在治疗性适于治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素-难 治性前列腺癌，和与其相关的疾病或病症的治疗或施用之前、同时和/或随后施用本发明 的药物或活性本发明(免疫刺激性)组合物或疫苗。所述时间交错的治疗可以使用例如试 剂盒、优选如下文定义的多部件的试剂盒进行。时间交错的治疗可以另外或备选地还包括以这样的形式施用本发明的活性(免 疫刺激性)组合物或疫苗、优选地如上述定义的编码至少两种(优选不同的)抗原的至少 一种RNA，其中如上文定义的编码至少两种(优选不同的)抗原的至少一种RNA(其优选地形成本发明的活性(免疫刺激性)组合物或疫苗的一部分)与如上文定义的编码至少两种 (优选不同的)抗原的另一种至少一种RNA(其优选地形成同一份本发明的活性(免疫刺 激性)组合物或疫苗的一部分)平行、在其之前或之后施用。优选地，(所有至少一种RNA 的)施用在1小时内、更优选在30分钟内、甚至更优选地在15，10，5，4，3，或2分钟或者甚 至1分钟内进行。所述时间交错的治疗可以使用试剂盒、优选如下文定义的多部件的试剂 盒进行。 按照最后一个实施方案，本发明还提供试剂盒，特别是多部件的试剂盒，其包括所 述活性本发明的(免疫刺激性)组合物、和/或本发明的疫苗，和任选地具有所述本发明的 活性(免疫刺激性)组合物和/或本发明的疫苗的施用和剂量的信息的技术说明书。所述 技术说明书可以包含关于本发明的活性(免疫刺激性)组合物、和/或本发明的疫苗的施 用和剂量的信息。所述试剂盒、优选多部件的试剂盒，可以用于，例如，任何上文提及的应用 或用途，优选地用于至少一种本发明的活性(免疫刺激性)组合物(用于制备本发明的药 物，优选地疫苗)以治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌， 和与其相关的疾病或病症的应用。所述试剂盒还可以用于至少一种本发明的活性(免疫刺 激性)组合物(用于制备)治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前 列腺癌，和与其相关的疾病或病症的(的本发明的疫苗)的应用，其中本发明的活性(免疫 刺激性)组合物)和/或所述疫苗由于所编码的至少两种抗原可以能够在如上文定义的哺 乳动物中诱导或增强免疫反应。所述试剂盒还可以用于至少一种本发明的活性(免疫刺激 性)组合物(用于制备)在如上文定义的哺乳动物中调节、优选引发、例如诱导或增强免疫 反应、且优选地支持前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素难治性前列腺癌，和 与其相关的疾病或病症的支持治疗(的本发明的药物，优选疫苗)的应用。多部件的试剂 盒，作为试剂盒的特殊形式，可以在试剂盒的不同部件中包含一种或多种相同或不同的活 性本发明的(免疫刺激)组合物和/或一种或多种相同或不同的本发明的疫苗。多部件的 试剂盒还可以在试剂盒的不同部件中包含(例如一种)活性本发明的(免疫刺激性)组合 物、(例如一种)本发明的疫苗和/或如上文定义编码至少一种抗原的至少一种RNA，例如， 试剂盒的每个部件包含编码优选不同的抗原的至少一种RNA。另外，两种类型的多部件试剂 盒的组合是可以的。例如，当考虑时间交错治疗时，例如，当在同一体内治疗过程中使用不 同制剂和/或增加浓度的活性本发明的(免疫刺激性)组合物、本发明的疫苗和/或如上 文定义的编码至少一种抗原的至少一种RNA时，可以使用多部件试剂盒。还可以在考虑本 发明活性(免疫刺激性)组合物的不同抗原(例如，在部件中)的分开的配制或施用时或 有此需要时(例如，为了技术原因)，但是例如仍然实现不同抗原在体内的组合存在时，使 用多部件试剂盒。特别地，考虑作为特殊形式的试剂盒的多部件试剂盒，其中所述试剂盒的 每个部件包含如上文定义的至少一种优选不同的抗原，所述多部件试剂盒的所有部件优选 形成如本文定义的所述活性本发明的(免疫刺激性)组合物或本发明的疫苗。所述特殊的 多部件试剂盒可以特别是合适的，例如，如果不同抗原作为该试剂盒的不同部分分别配制， 但是然后一起一次性或以时间交错方式施用至需要其的哺乳动物。在后一种情形中，所述 试剂盒的所有不同部件的施用典型地在短时间限制内施用，以致所有抗原在紧随试剂盒最 后部件的施用之后几乎同时存在于哺乳动物中。上述任一种试剂盒可以用在如上文所述的 治疗中。
本发明的优点本发明提供用于治疗前列腺癌(PCa)的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述组 合物包括至少一种RNA、优选mRNA，其编码能够在哺乳动物中引发(适应性)免疫反应的至 少两种(优选不同的)抗原，其中所述抗原选自由下列各项组成的组PSA(前列腺特异性 抗原)，PSMA (前列腺特异性膜抗原)，PSCA (前列腺干细胞抗原)和STEAP (前列腺六跨膜 上皮抗原)。所述活性(免疫刺激性)组合物允许前列腺癌(PCa)的有效治疗，或者在使用 常规治疗时的补充治疗。此外，它通过利用RNA作为医疗方法的途径而进一步避免所引入 的DNA序列的不可控增殖的问题。例如，在免疫反应、免疫或接种中，用在本发明的活性(免 疫刺激性)组合物的RNA比DNA表达系统具有其它相当多的优点。这些优点特别包括引入 到细胞中的RNA不整合到基因组中。这避免该基因的突变的风险，否则所述基因可以完全 或部分被灭活或者产生错误信息。它还避免使用DNA作为诱导免疫反应的试剂(例如，作 为疫苗)的其它风险，诸如在已经引入外源DNA的患者中诱导病原性抗-DNA抗体，因此导 致(可能是致死性的)免疫反应。相反，尚未检测到抗-RNA抗体。附图下述附图意欲进一步举例说明本发明。它们不意欲另外限制本发明的主题。图 1 描述了质粒构建体 RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID NO 1), 其编码PSA (前列腺特异性抗原)(=KLK3).所述构建体包含下列序列元件关于稳定和更好密码子使用的GC最优化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ -末端的 30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；该DNA构建体对应于编码mRNA并且作为通过体外转录实验制备相应的RNA构建 体的基础。图 2 描述了 对应于 RNA 构建体 RNActiveCAP_KLK3 (GC) -muag-A70-C30 的野生 型“编码序列(SEQ IDNO 2)，其编码PSA (前列腺特异性抗原)(=KLK3)，即无GC最优化 序列的编码PSA (前列腺特异性抗原)的编码序列(CDS)。图 3 描述 RNA 构建体 RNActive CAP-KLK3 (GC) -muag-A70_C30 的 GC 最优化编码 序列(SEQ ID NO :3)，其编码PSA(前列腺特异性抗原)( = KLK3)，即具有GC最优化序列的 编码PSA (前列腺特异性抗原)的编码序列(CDS)。图 4 描述质粒构建体RNActive CAP-F0LH1 (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID N0:4)，其 编码PSMA (前列腺特异性膜抗原)(=F0LH1)。所述构建体包含下列序列元件关于稳定和更好密码子使用的GC最优化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ -末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；该DNA构建体对应于编码mRNA并且作为通过体外转录实验产生相应的RNA构建体的基础。图 5 描述对应于 RNA 构建体 RNActiveCAP-FOLHl (GC) -muag-A70_C30 野生型编码 序列(SEQ ID NO :5)，其编码PSMA (前列腺特异性膜抗原)(=F0LH1)，即编码PSMA (前列 腺特异性膜抗原)(=F0LH1)的编码序列(CDS)，无GC最优化序列。图 6 描述 RNA 构建体 RNActive CAP-F0LH1 (GC) -muag-A70_C30 的 GC-最优化编码序列(SEQ ID NO :6)，其编码PSMA (前列腺特异性膜抗原)(=F0LH1)，即编码PSMA (前 列腺特异性膜抗原)(=F0LH1)的编码序列(CDS)，其具有GC-最优化序列。图 7 描述质粒构建体 RNActive CAP-PSCA (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID NO :7)，其 编码PSCA (前列腺干细胞抗原)。所述构建体包含下列序列元件关于稳定和更好密码子使用的GC最优化序列在3，-末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；该DNA构建体对应于编码mRNA并且作为通过体外转录实验产生相应的RNA构建 体的基础。图 8 描述对应于 RNA 构建体 RNActiveCAP-PSCA(GC)-muag-A70-C30 的野生型编 码序列(SEQ IDNO :8)，其编码PSCA (前列腺干细胞抗原)，即编码PSCA (前列腺干细胞抗 原)的编码序列(CDS)，其无GC最优化序列。图 9 描述 RNA 构建体 RNActiveCAP-PSCA (GC) -muag-A70_C30GC-的 GC 最优化编 码序列(SEQ ID NO :9)，其编码PSCA (前列腺干细胞抗原)，即编码PSCA (前列腺干细胞抗 原)的编码序列(CDS)，其具有GC-最优化序列。图 10 描述质粒构建体 RNActive CAP-STEAP (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID NO: 10)， 其编码STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)。所述构建体包含下列序列元件关于稳定和更好密码子使用的GC最优化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)，在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；该DNA构建体对应于编码mRNA并且作为通过体外转录实验产生相应的RNA构建 体的基础。图 11 描述对应于 RNA 构建体 RNActiveCAP-STEAP (GC) -muag-A70_C30 的野生型 编码序列(SEQ IDNO :11)，其编码STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)，即编码STEAP (前列 腺的六跨膜上皮抗原)的编码序列(CDS)，其无GC最优化序列。图 12 描述 RNA 构建体 RNActive CAP-STEAP (GC) -muag-A70_C30 的 GC-最优化编 码序列(SEQ ID N0:12)，其编码STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)，即编码STEAP(前列腺 的六跨膜上皮抗原)的编码序列(CDS)，其具有GC-最优化序列。图13 描述通过检测抗原特异性抗体检测抗原特异性免疫反应(B-细胞免疫反 应)。如从图13可见，施用RNA-Mix，即包含分别编码PSA，PSMA, PSCA或STEAP的mRNA的 PCa-RNA混合物，显示抗原特异性免疫反应(B-细胞免疫反应)的显著减少，这是由于与包 含缓冲液或对照的样品相比针对PSA的IgG2a抗体的明显形成。图14 显示通过ELISP0T检测抗原特异性细胞免疫反应。如从图15可见，用 RNA-Mix接种小鼠，即用包含分别编码PSA，PSMA，PSCA或STEAP的mRNA的PCa-RNA混合物 接种，或用分别编码PSA，PSMA, PSCA或STEAP的mRNA接种，导致抗原特异性免疫反应(CTL) 的显著减少，这是由于与自然小鼠和接种缓冲液的小鼠相比，IFNy的明显形成。图15 描述通过使用包含5 μ g分别编码PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的本 发明PCa-RNA混合物的免疫和肿瘤攻击。如从图15可见，，用按照a)包含分别编码PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的PCa-RNA混合物以2x i. m.(肌内)免疫后，肿瘤体积明显 减少。当将按照a)的PCa-RNA混合物以4xi.m.(肌内)施用时，肿瘤体积进一步减少。图16 描述PSA-特异性IgGl抗体的诱导。图16特别显示在用mRNA疫苗接种的 小鼠中特异于肿瘤抗原PSA的IgGl抗体的存在，所述疫苗由4种成分存在，包含编码人前 列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。每一个用阳离子肽鱼精蛋白 配制。将对照小鼠用缓冲液(林格_乳酸盐)或用无关RNA(Pp Luc)进行处理对照小鼠， 所述无关RNA用鱼精蛋白类似物配制为mRNA疫苗。合并每个组中来自5只小鼠的血清并 进行滴定来进行分析。误差条表示两次重复与平均值的偏差。图17 显示PSA-特异性IgG2a抗体的诱导。图17特别显示在用mRNA疫苗接种 的小鼠中特异于肿瘤抗原PSA的IgG2a抗体的存在，所述mRNA疫苗由4种成分组成，每种 包含编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。每种用阳离子 肽鱼精蛋白配制。将对照小鼠用缓冲液(林格_乳酸盐)或用无关RNA(Pp Luc)处理，所 述无关RNA用鱼精蛋白类似物配制成mRNA疫苗。合并每个组中来自5只小鼠的血清并进 行滴定来进行分析。误差条表示两次重复与平均值的偏差。图18 描述了 PSCA-特异性IgGl抗体的诱导的结果。具体地，图18显示在用mRNA 疫苗接种的小鼠中特异于肿瘤抗原PSCA的IgGl抗体的存在，所述mRNA疫苗由4种成分组 成，每种包含编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。每种 用阳离子肽鱼精蛋白配制。将对照小鼠用缓冲液(林格_乳酸盐)处理。合并每个组中来 自5只小鼠的血清并进行滴定来进行分析。误差条表示两次重复与平均值的偏差。图19 显示PSMA-特异性细胞毒性T细胞的诱导。将每组5只小鼠用mRNA疫苗或 以鱼精蛋白类似物配制为mRNA疫苗的无关mRNA(Pp Luc)接种，所述mRNA疫苗由4种成分 组成，每种包含编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。将 来自接种和对照小鼠的脾细胞在最后一次接种后第6天分离，并且用PSMA-衍生的肽文库 或用对照肽文库进行刺激。使用ELISP0T技术离体测量IFN-γ的分泌。线表示单独分析 的每组5只小鼠的中位值和范围。用GraphPadPrism进行统计学分析，用单Mann-Whitney 检验(one-sidedMann-ffhitney test)计算 ρ 值。图20 显示PSMA-特异性细胞毒性T细胞的体内诱导。用mRNA疫苗以三次接种周期皮内接种C57BL/6小鼠，所述mRNA疫苗由4种成分组成，每种包含编码人前列腺分化 抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。将对照小鼠用对照mRNA Pp Luc接种 或用缓冲液(林格_乳酸盐)处理。在最后一次注射后第6天，将30xl06差异标记的脾细 胞(用PSMA-衍生的或对照肽文库加载的，以1 1的比率混合的低群和高群)静脉内输 注。16小时后，分离来自受体小鼠的脾细胞并通过流式细胞术分析。图显示每只小鼠的单 个数据点。线表示数值的中位值和范围。分析每组5只小鼠。用GraphPad Prism进行统 计学分析，用Marm-Whitney检验计算ρ值。图21 显示在最后一次接种后10周，PSA-特异性记忆细胞毒性T细胞的诱导。将 C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以两个接种周期接种，所述mRNA疫苗由4种成分组成，每种包含 编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。将对照小鼠用缓 冲液(林格-乳酸盐)处理。在最后一次注射后10周，将30xl06差异标记的脾细胞(用 PSA-衍生的或对照肽文库加载的，以1 1的比率混合的低群和高群)静脉内移植。16小时后，分离来自受体小鼠的脾细胞并通过流式细胞术分析。图显示单个数据点，线表示单独 分析的每组6只小鼠的中位值。用GraphPad Prism进行统计学分析，用Mann-Whitney检 验计算P值。图22 显示最后一次接种后10周PSCA-特异性记忆细胞毒性T细胞的诱导。将 C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以两次接种周期接种，所述mRNA疫苗由4种成分组成，每种包含 编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。将对照小鼠用缓 冲液(林格-乳酸盐)处理。在最后一次注射后10周，将30xl06差异标记的脾细胞(用 PSCA-衍生的或对照肽文库加载的，以1 1的比率混合的低群和高群)静脉内移植。16小 时后，分离来自受体小鼠的脾细胞并通过流式细胞术分析。图显示单个数据点，并且线表示 单独分析的每组6只小鼠的中位值。用GraphPad Prism进行统计学分析，用Mann-Whitney 检验计算P值。图23 显示在接种了 mRNA疫苗的小鼠中的肿瘤生长抑制，所述mRNA疫苗由4种 成分组成，每种包含编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAPjPSA和PSCA的GC-最优化mRNAs。 将C57BL/6小鼠用mRNA疫苗以两次接种周期皮内接种。将对照小鼠用缓冲液处理。最后 一次接种后15天，将小鼠用1x106同源TRAMP-Cl肿瘤细胞皮下攻击。监测肿瘤生长。图 显示在肿瘤攻击后第5 2天测量的肿瘤体积的对数值。用GraphPadPrism进行统计学分析， 用Mann-Whitney检验计算ρ值。
实施例下述实施例意欲进一步举例说明本发明。它们不意欲另外限制本发明的主题。1.制备编码的质粒在下述实验中，分别制备对应于编码下述抗原的各自mRNA序列末端的DNA序列· PSA (前列腺特异性抗原)，· PSMA (前列腺特异性膜抗原)，· PSCA (前列腺干细胞抗原)，和· STEAP (前列腺六跨膜上皮抗原)，并且用于体外转录和转染实验。其中，对对应于天然抗原编码mRNA的DNA序列 (包含图2，5，8和11所述的编码序列的序列，即SEQ ID NOs :2，5，8和11)关于更好密码子 使用进行GC-最优化，从而获得包含图3，6，9和12所述的编码序列的序列，即SEQ ID NOs 3，6，9和12。接着，将编码序列转移到GC-最优化构建体(CureVac GmbH, Tubingen,德国)， 将其用聚腺苷酸标记和聚胞苷酸标记(A70-C30)进行修饰。将最终的构建体分别称为RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30(SEQ ID NO 1),RNActive CAP-F0LH1 (GC)-muag-A70_C30(SEQ ID NO 4),RNActive CAP-PSCA (GC)-muag_A70-C30 (SEQ ID N0:7)，和RNActive CAP-STEAP (GC)-muag-A70_C30 (SEQ ID NO: 10)。最终的构建体分别包含根据显示在图1，4，7和10中的序列的序列(SEQID NOs 1，4，7和10)，其包含下列序列元件关于稳定和更好密码子使用的GC-最优化序列在3’ -末端的 70X腺苷(聚腺苷酸尾)
在3’ _末端的30X胞嘧啶(聚胞苷酸尾)；2.体外转录基于在实施例1中获得的重组质粒DNA，通过体外转录制备RNA序列。因此，将所 述重组质粒DNA线性化，并且随后使用T7RNA聚合酶在体外转录。然后通过DNA酶I消化 降解DNA模板，并且通过LiCl沉淀回收RNA，并且通过HPLC提取(PUREMessenger , CureVac GmbH, Tubingen，德国)进一步纯化。3.与龟 精蛋白复合为了将所述RNA转染至细胞和生物体中，将通过体外转录获得的RNA优选地复合， 更优选地当将所述RNA与鱼精蛋白混合时与鱼精蛋白复合。4.免疫实验对于免疫，将通过如上述体外转录实验获得的RNA(见实验2)转染到小鼠(小鼠 C57BL/6)中，优选地在与鱼精蛋白复合时。接种发生在不同组中，其中一组(对照组)小鼠 用缓冲液作为对照进行注射。将每组4只小鼠用20 μ g与鱼精蛋白复合的mRNA(5 μ g/基 因)皮内免疫四次，其中所述RNA编码PSA、PSMA、PSCA和STEAP。5.检测丨杭原-特异件免,疮反应(B-细胞为鹿反应)抗原-特异性免疫反应(B-细胞免疫反应)的检测通过检测抗原_特异性抗体进 行。因此，在最后一次接种后一周从接种的小鼠采集血液样品，并且制备血清。将MaxiSorb 板(Nalgene Nunc International)用人 PSA 蛋白(0. 5 μ g/孔)包被。在用包含 0.05%吐 温-20和BSA的IXPBS封闭之后，将板用稀释的小鼠血清(1 30，1 90，1 270， 1 810)温育。随后，加入生物素-偶联的二抗(抗-小鼠_IgG2a Pharmingen)。洗涤 后，将板用辣根过氧化物酶_链霉抗生物素蛋白温育，并且随后测量ABTS底物(2，2’-连氮 基-二(3-乙基-苯噻唑啉-6-磺酸)的转化。如从图13可见，施用RNA-Miχ，即包含分别编码PSA，PSMA, PSCA或STEAP的 mRNA(如分别在图1，4，7禾口 10中显示的序列(SEQ ID NOs :1，4，7禾口 10))的PCa-RNA混合 物，与来自对照小鼠的样品比较，显示出由于显著形成针对PSA的IgG2a抗体所导致的抗原 特异性免疫反应(B-细胞免疫反应)的显著减少。6.通过ELISP0T检测抗原-特异性细胞免疫反应在最后一次接种后2个月，将小鼠处死，移去脾并分离脾细胞。在存在IL-4的情 况下，将脾细胞温育7天从而选择树突细胞。为了确定抗原_特异性免疫反应，在再刺激 后测量INFy分泌。作为靶细胞，使用来自天然小鼠的脾细胞，将其用PCa-mRNA-混合物 (Mix)或用编码PSA，PSMA，PSCA或STEAP的mRNA (分别如在图1，4，7和10显示的序列(SEQ IDNOs :1，4，7和10))进行电穿孔。为了检测INFy，将包被多筛选板(Millipore)用包括针对INFy的抗体(BD Pharmingen, Heidelberg，德国)的包被缓冲液0. IM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH 9.6， 10. 59g/l Na2CO3,8. 4g/l NaHCO3)温育过夜。在所述板中以1 20的比率一起温育靶细 胞和效应器细胞24小时。将板用IXPBS洗涤，并且用生物素-偶联的二抗温育。在用 1XPBS/0. 05%吐温-20洗涤后，向板中加入底物(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四 唑液体底物系统，来自Sigma Aldrich(西格玛奥德里奇)，Taufkirchen，德国)，并且可以 视觉检测底物的转化。
如从图14可见，与天然小鼠和用缓冲液接种的小鼠比较，用编码PSA，PSMA, PSCA或STEAP (分别如在图1，4，7和10中显示的序列(SEQ IDNOs :1，4，7和10))的PCaiRNA-混 合物接种小鼠导致针对所有四种抗原的抗原特异性免疫反应(CTL)的显著减少，该减少是 由于INFy的显著形成所导致的。7.肿瘤攻击a)免疫将20 μ g mRNA (包含 5 μ g 分另Ij 编码 PSA, PSMA, PSCA 禾口 STEAP 的 mRNA,例如构 建体 RNActive CAP-KLK3 (GC)-muag_A70-C30，RNActiveCAP-FOLHl(GC)-muag-A70_C30， RNActive CAP-PSCA(GC)-muag_A70-C30，和 RNActive CAP-STEAP(GC)-muag-A70_C30(如图 1，4，7和10显示的序列，即SEQ ID NOs :1，4，7和10)的PCa-RNA混合物)肌内注射在小 鼠中。在7周内，重复免疫1或3次。在最后一次免疫后40天，将IMioTramp-Cl肿瘤细胞 皮下注射到小鼠中。在50天内，测定肿瘤体积。b)结果如从图15可见，在用根据a)包含分别编码PSA，PSMA, PSCA和STEAP的mRNA的 PCa-RNA混合物以2x i. m(肌内)免疫后，肿瘤体积被显著减少。当将根据a)的PCa-RNA 混合物以4x i.m.(肌内)施用时，肿瘤体积进一步减少。8.
Iij8. 1 制备 mRNA 疫苗所述mRNA疫苗由编码人前列腺分化抗原PSMA，STEAP, PSA和PSCA (按照SEQ ID NOs :3，6，9和12)的GC-最优化mRNAs组成，每种抗原用溶解在80% (ν/ν)林格-乳酸盐 溶液中的阳离子肽鱼精蛋白以4 1的质量比率(RNA 鱼精蛋白)配制。8. 2 接种将C57BL/6小鼠用64 μ g(16 μ g/抗原)如在上述8. 1中所述的mRNA疫苗皮内接 种。将对照小鼠用缓冲液(林格_乳酸盐)或用无关RNA(编码Photinus pyralis萤光素 酶的富含GC的mRNA)处理，所述无关RNA用鱼精蛋白类似物配制成mRNA疫苗。接种在第 1，3(和7)周包括2或3个免疫周期。每个周期由在一周的第1，2，3和4天进行的4次注 射组成。8. 3肿瘤攻击在结束接种后15天，皮下移植1x106TRAMP_C1细胞(小鼠前列腺细胞系1的转基 因腺癌，表达人PSMA，PSCA和STEAP的小鼠同源物)/每只小鼠。在肿瘤细胞接种后4周， 肿瘤是可触及的。通过用测径器测量肿瘤大小来监测肿瘤生长。8. 4监测抗原特异性抗体最后一次接种后14天，后眼窝采集血液样品(200 μ 1)，并且使用下列ELISA方法 分析血清中抗原特异性抗体亚型IgGl和IgG2a的存在。将96-孔ELISA板用重组蛋白PSCA 或人纯化的PSA(均在包被缓冲液中10yg/ml)包被，并且(在封闭和洗涤后)用血清在 37°C温育4小时。在用针对小鼠IgGl或IgG2a的生物素标记的抗体温育再用HRP-链霉抗 生物素蛋白温育后，加入TMB-底物。使用Tecan ELISA读数仪在450nm处测量比色反应。8. 5ELISP0T-检测CTL (细胞毒性T细胞)反应
为了检测CTL (细胞毒性T细胞)反应，使用ELISP0T技术，可以在单细胞水平显 现响应特定刺激的IFN-Y的分泌的分析。在第三个接种周期的最后一次接种后6天分离用如8. 1所述的mRNA疫苗接种的小鼠和对照小鼠的脾细胞，接着将其转移到用a-IFN-γ捕捉抗体包被的96-孔ELISP0T 板。接着将细胞在37°C用PSMA-衍生的肽文库或用HIV-衍生的文库作为对照刺激24小时。 两种文库以Iyg/肽/ml的浓度使用。在温育周期后，将细胞从板上洗下并且使用针对鼠 IFN- γ的生物素化的二次抗体，随后用链霉抗生物素蛋白-AKP检测由细胞分泌的IFN- γ。 使用BCIP/NBT底物显现斑点并且使用自动的ELISP0T读数仪(Immunospot Analyzer，CTL Analyzers LLC)计数。8. 6体内细胞毒性为了检测细胞毒性T细胞的活性，分析接种和对照小鼠中的特异性靶细胞的体内 裂解。在最后一次免疫后一周以及10周进行测定法从而检测记忆细胞毒性T淋巴细胞的 诱导。分离来自首次用于实验的供体小鼠的脾细胞并将其用两个不同浓度的荧光染料 CFSE标记。其中产生高和低荧光强度的两个群。将具有低荧光的细胞在37°C用PSMA-， PSA-或PSCA-衍生的限制性肽文库(lyg/ml/肽)加载3小时。相应地，将具有高荧光的 对照细胞用HIV Pol-衍生的肽文库(1 μ g/ml/肽)加载。将两个群以1 1的细胞细 胞比率混合并将其静脉内移植到首次用于实验的或接种的受体小鼠。16小时后，分离来自 受体小鼠的脾细胞，并且通过流式细胞术分析荧光细胞的存在。在接种的小鼠中低和高荧 光细胞之间比率的改变代表体内靶细胞的特异性杀伤。将观察到的特异性靶细胞数和观察 到的对照细胞数之间的精确比率估计为所有对照小鼠中的平均值。该比率容许在接种小鼠 中基于观察到的对照细胞的预测预期的特异性靶标。在特异性靶标的观察数和预测数之间 的比率代表存活(未被杀死)的特异性靶标的百分比。应用下列公式比率=在对照小鼠中的特异性靶标(观察到的)/在对照小鼠中的对照靶标(观察到的)比率χ在接种小鼠中的观察到的对照靶标数=在接种的小鼠中特异性靶标的预测数%杀伤=(1_(观察到的特异性靶标/预测的特异性靶标)8. 7统计学分析使用GraphPad Prism软件，5. 01版本进行统计学分析。由于缺少样品群体的正态 分布和小的样品尺寸，将非参数Marm Whitney检验用于分析在测试组之间的差异，显著水 平为5%。8. 9结果和讨论将小鼠用mRNA疫苗接种小鼠，所述mRNA疫苗由编码人前列腺分化抗原PSMA， STEAP, PSA和PSCA的GC-最优化mRNAs组成，其中每种分别用阳离子肽鱼精蛋白以4 1 的质量比率(RNA 鱼精蛋白)配制。用缓冲液(林格_乳酸盐)或用无关RNA(Pp Luc) 处理对照小鼠，将所述无关RNA用鱼精蛋白类似物配制成mRNA疫苗。a)响应于用mRNA疫龙的接种 秀导抗 Φ寺异+牛抗体
受到检测抗体所需要的重组蛋白的可用性的限制，检测关于四种抗原中的两种的 特异性抗体的诱导。对于两种分析的蛋白质PSA和PSCA，在用mRNA疫苗接种的小鼠血清中 检测到抗原特异性抗体，这证实两种mRNAs在体内是功能性和免疫原性的(见图16-18)。b) 口_刊1^離贞細漏，_漏、,鼎麵謝牛1~麵另外，应用下述两个独立的功能测定来分析响应于mRNA疫苗的施用的细胞毒性T 细胞的活化=IFN-Y的分泌和体内细胞毒性测定法。IFN-Y是Thl反应的主要指示物并 且由激活的CTLs分泌。因此，使用ELISP0T技术来研究在来自接种的小鼠的脾细胞中抗原 特异性细胞毒性T细胞的存在。使用限制性的PSMA-衍生的肽文库作为脾细胞的抗原刺激 物。用该文库刺激导致高IFN-γ分泌，但 是仅在来自用mRNA疫苗接种的小鼠的脾细胞中， 而不在用编码无关蛋白萤光素酶(Pp Luc)的mRNA接种的对照小鼠中。没有脾细胞与HIV 衍生的对照肽文库反应(图19)。可以通过体内细胞毒性测定法来证实针对PSMA的抗原特异性细胞免疫性。在所 有的5只接种mRNA疫苗的小鼠中观察到用限制性PSMA-衍生的肽文库加载的靶细胞的特 异性杀伤，然而，细胞毒性作用在12和90%之间。用对照RNA(Pp Luc)或注射溶液(林 格_乳酸盐溶液)接种的小鼠不能消除输注的靶细胞(见图20)。在另一个实验中，研究用mRNA疫苗进行的接种是否在体内诱导持续的记忆作用。 为了解决这个问题，在接种结束后10周通过体内细胞毒性测试确定抗原-特异性记忆细胞 毒性τ细胞的存在。在用PSA以及PSCA接种后观察到靶细胞的特异性杀伤(图21-22)。 总之，mRNA疫苗在小鼠中诱导持续长久(至少10周)的细胞免疫性。最终，在小鼠中测试mRNA疫苗诱导抗肿瘤反应的能力。为了解决这个问题，我们 使用TRAMP-Cl肿瘤细胞系。TRAMP-Cl表达人抗原PSMA，PSCA和STEAP的小鼠同源物，所述 人抗原PSMA，PSCA和STEAP包含在作为抗原编码mRNAs的mRNA疫苗中。在小鼠和人之间 的同源性关于不同抗原在50-80%之间改变。由于小鼠用编码人蛋白的mRNAs接种的事实， 可以仅通过交叉反应性来介导针对TRAMP-Cl肿瘤细胞的保护。如在图23中可见，用mRNA 疫苗接种小鼠介导针对移植的TRAMP-Cl肿瘤生长的保护。这种观察指示mRNA疫苗在小鼠 中诱导交叉反应性的能力。
权利要求
活性(免疫刺激性)组合物，其包括编码至少两种、三种或四种不同抗原的至少一种RNA，a)其中至少一种抗原选自·STEAP(前列腺的六跨膜上皮抗原)；和b)其中其它的抗原选自任意下列抗原或其特定组合的至少一种抗原·PSA(前列腺特异性抗原)，或·PSMA(前列腺特异性膜抗原)，或·PSCA(前列腺干细胞抗原)；或·PSA和PSMA，或·PSA和PSCA，或·PSMA和PSCA；或·PSA，PSMA和PSCA。
2.根据权利要求1的活性(免疫刺激性)组合物，其包括编码选自PSA，PSMA，PSCA和 STEAP的四种不同抗原的至少一种RNA。
3.根据权利要求1-2任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA包 括250-20000个核苷酸的长度。
4.根据权利要求1-3任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA是 mRNA。
5.按照权利要求1-4中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 为单顺反子、双顺反子或甚至是多顺反子RNA。
6.按照权利要求5的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少两种抗原每种由单顺 反子RNA编码。
7.按照权利要求5的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少两种抗原由双顺反子 或多顺反子RNA编码。
8.按照权利要求5的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少两种抗原由单顺反子、 双顺反子和/或甚至多顺反子RNAs的混合物编码。
9.按照权利要求1-8中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 包括编码权利要求1或2中任一项定义的抗原的片段、变体或表位的RNA序列。
10.按照权利要求1-9中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中至少一种RNA包括 选自与图2，5，8或11(SEQ ID而8:2，5，8或11)的1 離序列相同或至少5%，10%，20%， 30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNAs 的 RNA。
11.按照权利要求1-10中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。
12.按照权利要求11的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA编码区的 G/C含量与野生型RNA编码区的G/C含量相比增加，与野生型RNA编码的氨基酸序列相比 较，所述至少一种RNA编码的氨基酸序列优选地不被改变。
13.按照权利要求11-12中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含量与野生型RNA的核糖体结合位点环境中的A/U含 量相比较增加。
14.按照权利要求11-12中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述修饰的mRNA 的编码区和/或5'和/或3'非翻译区与野生型RNA相比较被修饰，以致其不包含促降解 序列元件，与野生型RNA相比较，所述修饰的mRNA编码的氨基酸序列优选地不被改变。
15.按照权利要求11-14中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述修饰的mRNA 具有5'帽结构和/或聚腺苷酸尾，优选地为10-200个腺苷核苷酸，和/或聚胞苷酸尾，优 选地为10-200个胞嘧啶核苷酸，和/或至少一个IRES和/或至少一个5 ‘和/或3 ‘稳定 序列。
16.按照权利要求1-15中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中至少一种RNA包 括选自与图 1，3，4，6，7，9，10 或 12(SEQ ID NOs 1，3，4，6，7，9，10 或 12)的 RNA 序列相同或 至少 5%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，或 80%相同的 RNAs 的 RNA。
17.按照权利要求1-16中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种RNA 与一种或多种聚阳离子复合，优选地与鱼精蛋白或oligofectamine、最优选与鱼精蛋白复口 O
18.按照权利要求1-17中任一项的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述活性组合物 另外包括至少一种佐剂。
19.按照权利要求18的活性(免疫刺激性)组合物，其中所述至少一种佐剂选自由下 列各项组成的组阳离子或聚阳离子化合物，其包括阳离子或聚阳离子肽或蛋白，包括鱼精蛋白，核仁蛋 白，精胺或亚精胺，聚-L-赖氨酸(PLL)，聚-精氨酸，碱性多肽，穿透细胞的肽(CPPs)，其包 括HIV-结合肽，Tat, HIV-1 Tat (HIV)，Tat-衍生的肽，Penetratin，VP22来源的或类似物 肽，HSV VP22(单纯疱疹)，MAP, KALA或蛋白转导结构域(PTDs，PpT620,富含脯氨酸的肽， 富含精氨酸的肽，富含赖氨酸的肽，MPG-肽，P印-1，L-寡聚物，降钙素肽，触角足来源的肽 (特别是来自 Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF,乳铁转运蛋白，Transportan, Buforin-2, Bac715_24，SynB, SynB (1)，pVEC，hCT-来源的肽，SAP,鱼精蛋白，精胺，亚精胺， 或组蛋白，阳离子多糖，其包括脱乙酰壳多糖，聚凝胺(polybrene)，阳离子聚合物，其包括 聚氮丙啶肿1)，阳离子脂质，其包括0(^獻[1-(2，3-&01巧1(^)丙基)]-N，N，N-三甲基 氯化铵，DMRIE，二 -C14-脒，D0TIM，SAINT, DC-Chol，BGTC，CTAP, D0PC, D0DAP, DOPE 二油基 磷脂酰乙醇胺，D0SPA，D0DAB,D0IC,DMEPC,DOGS :Dioctadecylamidoglicylspermin,DIMRI 二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵，D0TAP:二油酰氧基-3-(三甲基氨溶)丙 烷，DC-6-14 :0，0_双十四烷酰-N-(a-三甲基氨溶乙酰基)二乙醇胺氯化物，CLIP1 外消 旋-[(2，3_双十八烷基氧基丙基)(2-羟基乙基)]-二甲基氯化铵，CLIP6 外消旋_[2(2， 3-双十六烷基氧基丙基-羟甲基氧基)乙基]三甲基铵，11 9:外消旋-[2(2，3-双十六 烷基氧基丙基-羟基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离 子聚合物，其包括改性聚氨基酸，包括3 “氨基酸_聚合物或反转聚酰胺，改性聚乙烯，包括 PVP (聚(N-乙基-4-乙烯基溴化吡啶鐺))，改性丙烯酸脂，包括pDMAEMA (聚(二甲基氨基 乙基甲基丙烯酸酯))，改性酰氨基胺(Amidoamines)，包括pAMAM(聚(酰氨基胺))，改性聚 3氨基酯(PBAE)，包括二胺末端改性的1，4 丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物，树状聚体，包括聚丙胺树状聚体或基于pAMAM的树状聚体，聚亚胺，包括PEI 聚(乙烯 亚胺)，聚(丙烯亚胺)，聚烯丙基胺，基于糖骨架的聚合物，包括基于环糊精的聚合物，基于 葡萄糖的聚合物，脱乙酰壳多糖，等，基于硅烷(silan)骨架的聚合物，诸如PM0XA-PDMS共 聚物，等，嵌段聚合物，其由选自如前文提及的阳离子聚合物的一个或多个阳离子嵌段的组 合与一个或多个亲水_或疏水嵌段(例如，聚乙二醇)的组合组成；或阳离子或聚阳离子蛋白或肽，其选自具有下述总式(I)的蛋白或肽(Arg)1;(LyS)m; (His)n;(0rn)。；(Xaa)x，其中1+m+n+o+x = 8-15，并且l，m，n或o彼此独立地可以是选自0， 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14 或 15 的任一数字，条件是 Arg，Lys，His 和 Orn 的总 含量占该寡肽的所有氨基酸的至少50% ；并且Xaa可以是选自除Arg，Lys, His或Orn外的 天然(=天然存在的)或非天然氨基酸的任何氨基酸；并且x可以是选自0，1，2，3或4的 任一数字，条件是Xaa的总含量不超过该寡肽所有氨基酸的50% ；或具有式(II)的核酸 GiXfn，其中G是鸟苷，尿嘧啶或是鸟苷或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、 胞嘧啶或上述提及的核苷酸的类似物；1是1-40的整数，其中当1 = 1时，G是鸟苷或其类 似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸是鸟苷或其类似物；m是整数，并且至少为3 ；其中当m =3时，X是尿嘧啶或其类似物，当m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物； n是1-40的整数，其中当n= 1时，G是鸟苷或其类似物，当11> 1时，至少50%的核苷酸 是鸟苷或其类似物；或具有式(III)的核酸，其中C是胞嘧啶、尿嘧啶或者是胞嘧啶 或尿嘧啶的类似物；X是鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上述提及的核苷酸的类似物；1 是1-40的整数，其中当1 = 1时，C是胞嘧啶或其类似物，当1 > 1时，至少50%的核苷酸 是胞嘧啶或其类似物；m是整数，并且至少为3 ;其中当m = 3时，X是尿嘧啶或其类似物，当 m > 3时，存在至少3个连续的尿嘧啶或尿嘧啶类似物；n是1_40的整数，其中当n = 1时， C是胞嘧啶或其类似物，当n > 1时，至少50%的核苷酸是胞嘧啶或其类似物。
20.疫苗，其包括按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合物。
21.按照权利要求20的疫苗，其中按照要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合 物引发适应性免疫反应。
22.按照权利要求20和21中任一项的疫苗，其中所述疫苗还包括药用载体。
23.按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺激性)组合物用于制备疫苗的应用， 所述疫苗用于治疗前列腺癌(PCa)，优选地肿瘤辅助治疗和/或激素_难治性前列腺癌，和 与其相关的疾病或病症。
24.试剂盒，优选多部件的试剂盒，其包括按照权利要求1-19中任一项的活性(免疫刺 激性)组合物，和/或按照权利要求20-22中任一项的疫苗，和任选地具有关于所述活性组 合物和/或所述疫苗的施用和剂量的信息的技术说明书。
全文摘要
本发明涉及活性(免疫刺激性)组合物，其包括至少一种RNA，优选mRNA，其编码至少两种(优选不同的)能够在哺乳动物中引发(适应性)免疫反应的抗原，其中所述抗原选自由PSA(前列腺特异性抗原)，PSMA(前列腺特异性膜抗原)，PSCA(前列腺干细胞抗原)和STEAP(前列腺六跨膜上皮抗原)组成的组。本发明还涉及包括所述活性(免疫刺激性)组合物的疫苗，涉及所述活性(免疫刺激性)组合物(用于制备疫苗)的应用和/或所述疫苗用于引发(适应性)免疫反应以用于治疗前列腺癌(PCa)、优选地肿瘤辅助治疗和/或激素-难治性前列腺癌，和与其相关的疾病或病症的应用。最后，本发明涉及试剂盒，特别是多部件的试剂盒，其包含所述活性(免疫刺激性)组合物和/或所述疫苗。
文档编号A61K39/00GK101820900SQ200880110986
公开日2010年9月1日 申请日期2008年10月8日 优先权日2007年10月9日
发明者托马斯·兰德尔, 约亨·普罗布斯特, 英马尔·霍伊尔 申请人:库瑞瓦格有限责任公司