专利名称：一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，本发明还涉及该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，本发明还涉及该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的用途。_
背景技术：
多肽(peptide)是a -氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，也是蛋白水解的中间产物。多肽涉及人体的激素、神经、免疫调节、细胞生长和生殖各领域，其可以调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。现有研究表明，来源于生物体的多肽具有抗肿瘤、 抗炎、抗病毒、抗衰老、抗菌、抗高血压等多种活性功能，尤其是抗肿瘤活性己受到各国研究人员的极大关注。赤魟(Zksja(is j'ei)为我国沿海常见软骨鱼类,俗称鯆鱼,草帽鱼,蒲扇鱼,黄貂鱼，属软骨鱼纲，下孔总目，鲼形目，魟科，魟属。赤魟软骨中含有多种活性显著抗肿瘤因子，其分子量处于10-100 kDa之间的血管生成抑制因子备受关注。但是，该类物质具有蛋白类药物类似的缺点，即分子量大不能透过半透膜、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、半衰期短、清除率高、生物利用度低等。因此，寻找抗肿瘤活性显著和稳定性强的低分子量多肽类物质成为软骨活性物质研究的重点。已有的研究证明蛋白质的生理功能取决于其特定的氨基酸序列，用合适的蛋白酶水解，就能释放出天然、高效、新颖的生物活性肽。基于此，以赤魟软骨为实验材料，通过对酶解和制备工艺的综合应用，将有可能获得活性显著的抗肿瘤多肽类物质，为海洋抗肿瘤药物的开发提供候选药物。但是，申请人研究发现，以赤魟软骨为原料，利用酶解技术制备抗肿瘤多肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗肿瘤多肽及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，该抗肿瘤多肽对前列腺癌细胞DU-145和PC-3具有显著的增值抑制作用。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，工该艺科学合理、易于操作。本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽在制备抗前列腺癌药物中的应用。本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，其特征在于该抗肿瘤肽的氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-Hi s (IEPH)，ES I/MS检测给出分子离子峰ffi/z 495.96 Da ([M+H] + )。本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
1)以赤魟软骨作为原料，按固液比Ig:3 8mL加入抽提液(含0.02 mol/L 2_N_吗啡啉乙磺酸和质量体积分数为0.02%EDTA的1.0 mol/L盐酸胍溶液)，于18 20 1:振荡抽提48^72 h，抽提溶液于4 °C以下，以9 000 r/min离心15 25 min，去除沉淀，得赤魟软骨蛋白粗提液；
2)赤魟软骨蛋白粗提液加入丙酮至丙酮浓度达30%，静置0.5 1h后，于4 °C以下，9
000r/min离心15 25 min，取离心上清液加入丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5 I h后，4°C以下,9 000 r/min离心15 25 min,取沉淀于截留分子量为3 kDa的透析袋内透析24 36h，透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；
3)取赤魟软骨蛋白，按照料液比1:3加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH 7.5 8.5)，按照软骨粗蛋白质量的1.5^2.5%加入胰蛋白酶，于温度35 45°C下酶解3 5 h，得酶解产物；
4)将制备的赤魟软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得赤魟软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱 盐和层析，得到抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽。作为优选，所述步骤3)中的胰蛋白酶的酶活力> 2.5X IO4 U/g。作为改进，所述步骤4)中的灭酶处理为:将赤魟软骨蛋白酶解产物升温至90 V 95°C，并于此温度保持l(Tl5min后，冷却至室温，然后离心，得赤魟软骨蛋白酶解液。再改进，所述步骤3)的超滤、脱盐和层析的具体过程为:
超滤:将赤魟软骨蛋白酶解液于0.f0.15 MPa的工作压力和2(T25 °C的工作温度下采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液；
脱盐:将得到的超滤酶解液制成浓度为1(T20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度7(T80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液。脱盐酶解液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；
层析:将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为1(T20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45^0.55 mol/L 和 0.90 1.10 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8 12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 u g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率得I个高活性抗前列腺癌多肽Ile-Glu-Pr0-His (IEPH)0优选,所述大孔树脂为DlOl。再优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G_25 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量19 21 u g ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相:A水，B乙腈；梯度洗脱:0 6 min为100%水，6 25 min乙腈浓度从0匀速升至40% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的应用，其特征在于Ile-Glu-Pro-His (IEPH)在lmg/mL浓度下，作用72h后对DU-145 和 PC-3 细胞的增殖抑制率分别为 98.6 ± 3.5% 和 96.5±2.9% ；IIe-Glu-Pro-His(IEPH)具有安全无毒副作用和抗肿瘤活性强等优点，可用于制备抗前列腺癌药物。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明工艺科学合理，选用胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合膜超滤分级、大孔树脂脱盐和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗前列腺癌多肽具有较高的活性；与化学合成的抗肿瘤多肽相比较，本发明制得的抗前列腺癌多肽具有安全无毒副作用和抗肿瘤活性强等优点，可用于前列腺癌的治疗。_
图1是本发明的阴离子交换树脂DEAE-52纤维素层析 图2是本发明的葡聚糖凝胶G-25层析 图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析 图4是本发明的Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的反相高效液相色谱(RP-HPLC);
图 5 是本发明的 Ile-Glu-Pro-His (IEPH)的质谱图(ESI/MS)。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明 作进一步详细描述。一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，制备工艺流程如下:赤魟软骨〃蛋白抽提〃酶解〃酶解物〃超滤〃大孔树脂脱盐〃离子交换层析〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备"抗前列腺癌多肽。实施例1:
1)取洗净除杂的赤魟软骨，按固液比Ig:3 8mL加入抽提液(含0.02 mol/L 2_N_吗啡啉乙磺酸和质量体积分数为0.02%EDT的1.0 mol/L盐酸胍溶液)，于20 °C下振荡抽提72h,于4 °C以下，以9 000 r/min离心20 min,得赤魟软骨蛋白粗提液；
2)赤魟软骨蛋白粗提液内加入丙酮至丙酮浓度达30%，静置Ih后，4 °C以下，于9 000r/min离心20 min，取离心上清液加入丙酮至丙酮浓度达60%，静置I h后，4 °C以下，9 000r/min离心25 min,取沉淀于截留分子量为3 kDa的透析袋内透析24 h,透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白；
3)取赤魟软骨蛋白，按照料液比1:3加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH 8.0)，按照软骨粗蛋白质量的2.0%加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5X104U/g)，于温度40 °C下酶解4 h，得酶解产物；
4)将步骤3)所得的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到抗前列腺癌多肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为:
①灭酶:酶解产物升温至90 95°C，并于此温度保持15min后，冷却至室温，然后离心，得酶解液；
②脱盐:将得到的酶解液制成浓度为10mg/mL溶液，加入到DlOl大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用75%乙醇进行解析，40 °C以下低压旋蒸除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；
③超滤:将上述脱盐酶解物干粉溶于磷酸盐缓冲液(pH6.0)配成10 mg/mL的溶液，于
0.1 0.15 MPa的工作压力和25 °C的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液；
④阴离子交换层析:将上述超滤酶解液用双蒸水配成15mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为离子交换酶解液(F4)(图1);
⑤凝胶色谱层析:将所述离子交换酶解液(F4)用双蒸水配成10mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为凝胶制备酶解物(F41)(图 2)。⑥高效液相色谱精制:将上述凝胶制备酶解物(F41)用双蒸水配成50 u g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:进样量20 ii g ;色谱柱为ZorbaxC18 (250 mm X 4.6 mm, 5 Pm);流动相:A水，B乙腈；梯度洗脱:0 6 min为100%水，6 25min乙腈浓度从0勻速升至40% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm,根据对人前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率得I个高活性抗前列腺癌多肽(见图3)。⑦结构检测:收集活性最高的I个抗前列腺癌多肽经检测为单一峰(见图4)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-His (IEPH)，ESI/MS检测给出分子离子峰 495.96Da ([M+H] + )。将上述制得的赤魟软 骨蛋白抗肿瘤多肽Ile-Glu-Pro-His (IEPH)进行人前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制实验。实验结果表明:该多肽在lmg/mL浓度下，作用72h后对人前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率分别为98.6 ± 3.5%和96.5±2.9%。最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽，其特征在于该抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-His (IEPH), ESI/MS检测给出分子离子峰495.96 Da([M+H]+)。
2.—种权利要求1所述的一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以赤魟软骨作为原料，按固液比Ig:3 8mL加入抽提液(含0.02 mol/L 2_N_吗啡啉乙磺酸和质量体积分数为0.02%EDTA的1.0 mol/L盐酸胍溶液)，于18 20 1:振荡抽提48^72 h，抽提溶液于4 °C以下，以9 000 r/min离心15 25 min，去除沉淀，得赤魟软骨蛋白粗提液； 2)赤魟软骨蛋白粗提液内加入丙酮至丙酮浓度达30%，静置0.5 1h后，于4 °C以下，9 000 r/min离心15 25 min,取离心上清液加入丙酮至丙酮浓度达60%,静置0.5 1 h后,4°C以下,9 000 r/min离心15 25 min,取沉淀于截留分子量为3 kDa的透析袋内透析24 36h,透析液冷冻干燥，得赤魟软骨蛋白； 3)取赤魟软骨蛋白，按照料液比1:3加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH 7.5 8.5)，按照软骨粗蛋白质量的1.5^2.5%加入胰蛋白酶，于温度35 45°C下酶解3 5 h，得酶解产物； 4)将制备的赤魟软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得赤魟软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的胰蛋白酶的酶活力≥ 2.5 X IO4 U/g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的灭酶处理为:将酶解产物升温至90 VT 95°C，并于此温度保持10 mirTl5min后，冷却至室温，然后离心，得酶解液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的超滤、脱盐和层析的具体过程为: 超滤:将赤魟软骨蛋白酶解液于0.广0.15 MPa的工作压力和2(T25 °C的工作温度下采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，得超滤酶解液； 脱盐:将得到的超滤酶解液制成浓度为1(T20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度7(T80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液，脱盐酶解液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉； 层析:将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为1(T20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45^0.55 mol/L 和 0.90 1.10 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为离子交换层析酶解液；将上述离子交换层析酶解液用双蒸水配成8 12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 u g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据对前列腺癌细胞DU-145和PC-3的增殖抑制率得I个高活性抗前列腺癌多肽Ile-Glu-Pr0-His (IEPH)0
6.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为DlOl。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量19 21 u g ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相:A水，B乙腈；梯度洗脱:0 6 min为100%水，6 25 min乙腈浓度从0匀速升至40% ;洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
8.根据权利要求2所述的一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽的制备方法，其特征在于所制备的抗肿瘤肽Ile-Glu-Pro-His (IEPH)在lmg/mL浓度下，作用72h后对DU-145和PC-3细胞的增殖抑制率分别为98.6 ± 3.5%和96.5±2.9%。
9.权利要求1 所述的一种赤魟软骨蛋白抗肿瘤多肽在制备抗前列腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种抗前列腺癌赤魟软骨蛋白多肽及其制备方法和用途，该抗前列腺癌多肽的氨基酸序列为Ile-Glu-Pro-His(IEPH)，ESI/MS检测给出分子离子峰分子量m/z495.96Da([M+H]+)。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的多肽对前列腺癌细胞DU-145和PC-3具有显著的增殖抑制作用，可用于制备抗前列腺癌药物。
文档编号C07K1/34GK103204904SQ201310040289
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者王斌, 胡发远, 罗红宇, 徐银峰 申请人:浙江海洋学院