专利名称：桑黄菌中环二肽c4的分离技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
桑黄(Phellinus)，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2_12*3_21厘米，厚
1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类:一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中环二妝 C4 的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇氯仿梯度洗脱，然后进行氯甲凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，再次甲醇凝胶层析，最后是常压反相制备，经HPLC检测，ID-HNMR检测后，最终得到环二肽C4。此化合物目前已报道具有抑制鳗弧菌繁殖的作用。本发明的技术方案如下:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到
2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力
0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0.5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑 黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇凝胶层析一TLC检测一正相硅胶层析一甲醇凝胶层析一TLC检测一反相硅胶层析一HPLC检测一减压蒸干一环二肽C4。具体方法为:
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；
(3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇与氯仿溶解，氯甲凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(4)将步骤(3)中的产物再次进行一次正相硅胶层析，然后进行甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱；
(5)将步骤(4)中的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C4。
本发明由桑黄菌中环二肽C4的分离技术的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的环二肽C4。技术路线成熟明确，高效精确。
图1为环二肽C4的结构式；
图2为环二肽C4的一维核磁共振H谱。
具体实施例方式实例1:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量
0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。将上述所得粗提物称取50g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高0.5m，直径10cm，分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2用氯仿:甲醇=1: 1，溶解，进行，氯甲凝胶层析，收集洗脱液，TLC检测，适当合并，然后与等体积100目正相硅胶混合，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，10%甲醇溶解，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲·醇与水，HPLC检测，条件为Omin:0%甲醇，IOmin:100%甲醇，出峰时间为4.82min。适当合并，减压干燥，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 δ 6.64 (s, 1Η), 4.09 (dd, J = 10.2, 6.4 Hz, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 1H)，3.71-3.65 (m, 1H), 3.52 (ddd, J = 11.7, 8.8，2.6 Hz, 1H)，2.45 - 2.36 (m, 1H)，2.28 - 2.17 (m, 1H)，2.07 - 1.98 (m, 1H)，1.97 -1.75 (m, 3H)，1.04 (d, J =
6.9Hz, 3H), 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 3H).证明是(L-脑氨酸-L-纟颜氨酸)。实例2:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.1vvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。称取粗提物200g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高1.2m,直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=75:1分别洗脱3，4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。。将Fr-2经氯甲凝胶层析后，TLC检测，适当合并并减压蒸干，再次进行正相硅胶层析，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。进行甲醇凝胶柱层析。然后，进行反相硅胶层析，HPLC检测收集的洗脱液，条件为Omin:100%水，IOmin:100%甲醇，出峰时间为4.25min。适当合并，减压干燥，将洗脱液减蒸干，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 δ 6.64 (s, 1Η), 4.09 (dd, J= 10.2, 6.4 Hz, 1H), 3.77 - 3.71 (m, 1H), 3.71-3.65 (m, 1H), 3.52 (ddd, J = 11.7, 8.8，2.6 Hz, 1H)，2.45 - 2.36 (m, 1H)，
2.28 - 2.17 (m, 1H), 2.07 - 1.98 (m, 1H)，1.97 -1.75 (m, 3H)，1.04 (d, J =
6.9Hz, 3H), 0. 98 (d, J = 6.8 Hz, 3H).证明是(L-脑氨酸-L-纟颜氨酸)。
权利要求
1.桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其步骤顺序如下: (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次； (3)收集上述步骤(2)中最后一次洗脱液，减压浓缩，使用甲醇与氯仿溶解，氯甲凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (4)将步骤(3)中的产物再次进行一次正相硅胶层析，然后进行甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱； (5)将步骤(4)中的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水； (6)收集洗脱液，HPLC检测，减压干燥，即为环二肽C4。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
3.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于所述的环二肽C4为环(L-脯氨酸-L-缬氨酸)。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤⑵中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，洗脱剂为氯仿和甲醇。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的洗脱剂为甲醇与氯仿。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的正相硅胶为200-300目，凝胶为S印hadex LH-20或者S印hadex LH-25洗脱剂为甲醇。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相材料为C-18与C-8。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为甲醇:水=20%-80%。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相层析次数为2-3次。
10.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C4的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的HPLC 出锋时间为 4.12-4.87m in。
全文摘要
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中环二肽C4的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，然后是甲醇氯仿梯度洗脱，然后进行氯甲凝胶层析，再次进行正相硅胶层析，再次甲醇凝胶层析，最后是常压反相制备，经HPLC检测，1D-HNMR检测后，最终得到环二肽C4。
文档编号C07D487/04GK103073550SQ201310035900
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者宋爱荣, 赵晨, 孙效乐, 杨松, 秦丹 申请人:青岛农业大学