一种桑黄菌株及其选育方法
【专利摘要】本发明提供了一种桑黄菌株，以及该桑黄菌株的选育方法：原生质体的制备与诱变；诱变菌株的筛选；诱变菌株的鉴定。本发明选育得到的桑黄菌株摇瓶生物量达到17.92g/L，比原始出发菌株提高9.51％。黄酮产量达到0.47g/L，多糖产量达到3.57g/L分别比原始出发菌株提高52.16％和67.95％。生物产量及代谢活性物产量也显著高于亲本菌株SH1，且清除自由基的能力有显著提高。CGMCC No.1224220160421
【专利说明】
_种桑黄菌株及其选育方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术和微生物诱变育种领域，具体涉及一种桑黄菌株及其选育方 法。
【背景技术】
[0002] 桑黄是一种大型珍稀药用真菌，属真菌界、担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌科。桑黄具 有抑制肿瘤、抗衰老、抗氧化以及增强细胞免疫能力等生理功能，其主要的活性物质为桑黄 多糖和小分子的黄酮类物质。随着社会经济发展水平的提高，国内外市场对桑黄的需求量 急剧增加，而野生桑黄资源极其有限，采用液体发酵技术大规模生产桑黄菌丝体是满足国 内外市场需求的有效途径，而发酵获得的桑黄菌丝体的产量及其活性的高低在很大程度上 取决于桑黄菌种的优劣。
[0003] 与其它食用菌相比，桑黄菌株极易发生衰退，从而使其产量及菌株活性降低。桑黄 菌株多糖和黄酮产量降低，则无法满足市场的需求。
[0004] ARTP(常温常压等离子)诱变技术使用等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够 使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代 谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用ARTP能够有效造成 DNA多样性的损伤，突变率高，并易获得遗传稳定性良好的突变株。
[0005] 目前尚未见到有关采用ARTP技术诱变桑黄菌株的任何报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的首先是提供一种桑黄菌株，该菌株的保藏号为:CGMCC No. 12242,其 分类命名：桑黄，拉丁文学名:Phellinus igniarius，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月21 曰。
[0007] 本发明还提供了上述桑黄菌株的选育方法，该方法包括如下步骤：
[0008] (1)原生质体的制备与诱变：
[0009] 将SH1菌种接种于TOB液体培养基上，静置培养6~8d，获得菌丝体；
[0010] 菌丝体用1 %溶壁酶和〇. 25%崩溃酶30°C酶解2.5~3h，获得原生质体；
[0011] 原生质体稀释至1〇6个/mL，涂于载片上，置于氦气处理源下，进行ARTP诱变处理； (2)诱变菌株的筛选：
[0012] 诱变处理的菌液，放入0.6mol/L的甘露醇缓冲液中，震荡混匀，然后涂抹于再生培 养基上生长8~10d;
[0013] 挑取再生菌株于新的平板之上，通过生长速度、生长状态、摇瓶生物量、连续传代 观测实验，选取生长速度快、生物量高、遗传稳定的菌株；
[0014] 然后通过测定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶筛选出抗氧化能力强的菌株；
[0015] (3)诱变菌株的鉴定
[0016]通过拮抗实验、DNA随机引物扩增、醇提物HPLC指纹图谱分析检测，鉴定诱变菌株 是有别于SH1菌株的新菌株。
[0017]本发明具有以下优点：
[0018]本发明通过ARTP技术诱变得到的桑黄菌株，通过菌丝生长速度、摇瓶生物量、超氧 化物歧化酶和酸性磷酸酶酶活对诱变菌株进行筛选，获得新的优良变异菌株。得到的桑黄 新菌株的生物量及代谢活性物产量均有大幅度上升。黄酮产量提升52.16%，多糖产量提升 67.95%〇
【附图说明】
[0019] 图1 ARTP致死率曲线
[0020] 图2 RAPD引物序列
[0021] 图3 RATO扩增图谱
[0022] 其中Μ为Marker，CK为出发菌株SHI，bp为碱基对
[0023] 图4菌株HPLC分析
【具体实施方式】
[0024]为了对本发明有更深入的了解，现结合具体的应用实例对本发明做进一步的说 明：
[0025]亲本菌株桑黄SH1菌株来源于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心，编号 为：3249。
[0026]本实验所使用培养基配方：
[0027]固体培养基:取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸lh，过滤取上清液加入PDA(马铃薯 葡萄糖琼脂培养基购于BD公司）粉末39g，121°C灭菌20min备用。
[0028]液体培养基:取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸lh，过滤取上清液加入PDB(马铃薯 葡萄糖肉汤培养基购于BD公司）粉末24g，121°C灭菌20min备用。
[0029]原生质体再生培养基:取桑树枝20g加入蒸馏水1L，煮沸lh，过滤取上清液加入TOA 粉末39g，甘露醇109.2g，121°C灭菌20min倒平板备用。
[0030] 实施例1:原生质体的制备与诱变
[0031] (1)菌株的活化及培养将斜面菌种SH1转接到PDA平板中，26°C培养箱中培养8~ l〇d。挑取平板菌丝于匀浆器中，加入少量液体培养基，匀浆打碎，接种于100mL液体培养基 中，26 °C恒温，静置培养10d，期间每天轻微震荡菌丝2~3次。
[0032] (2)原生质体的制备过滤收集静置培养菌丝，无菌水冲洗1~2次，无菌吸水纸将菌 丝表面水分吸干。按照每〇.3g菌丝加入lmL酶液(0.12g溶壁酶(购于广东省微生物研究所）、 〇. 〇3g崩溃酶(购于Sigma)溶于12mL 0.6mol/L的甘露醇溶液中，经0.2μηι细菌过滤器过滤除 菌），30°C，80r/min，酶解3h。用G-3砂芯漏斗过滤，将收集的滤液在4°C、3000r/min条件下离 心lOmin，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤2~3次，得到纯化的原生质体。
[0033] (3)原生质体诱变按上述方法制备原生质体，通过血球计数板计数将原生质体稀 释至IX 106个/mL，取20yL原生质体均匀涂于载片上，至于氦气处理源下，处理距离2mm、功 率为120W、气流量为8SLM、处理时间1〇8、2〇8、3〇8、4〇8、5〇8。计算其在不同处理时间下的致 死率曲线。其结果见图1。图1显示，随着处理时间的增加，致死率不断提高，在50s处达到 100%。在20s~30s时菌株的诱变致死率在50%~70%内，为最适诱变剂量。
[0034]实施例2:诱变菌株的筛选
[0035] (1)诱变菌株的初筛取诱变之后菌液100yL均匀涂布于再生培养基上，26 °C培养箱 中培养7~10d后，诱变菌株再生出来，挑取菌落较大，菌丝密集的诱变菌株，用直径0.6cm打 孔器定量接种于新的PDA平板之上，培养10d后，统计菌丝生长速度。以30株未诱变原生质体 再生菌株平均生长速度为对照，选取菌丝生长速度大于出发菌株的诱变诱变菌株，进行传 代实验。每代测其菌丝生长速度，传代5次，选取菌丝生长速度快，遗传稳定的优秀菌株10 株。
[0036] (2)诱变菌株的复筛取上述步骤中筛出的10株优秀菌株，用直径0.6cm的打孔器定 量接种5~6块于100mL液体培养基内，培养10~12d，菌丝体清洗过滤冻干，测其摇瓶生物 量。选取生物量增长大于5 %的菌株共5株如下表1。
[0037]表1 5株诱变菌株的生物量值
[0039]测上述5株菌株菌丝体胞内超氧化物歧化酶(S0D)和酸性磷酸酶酶活(ACPhSOD酶 活按照NBT法测定，ACP酶活使用对硝基酚法测定。
[0040]比较菌株S0D和ACP酶活，与菌丝生长速度一起代入生物量模型：
[0041 ] Byieid = 2.68Bpda+0.052Bsod+0.399Bacp_0.894
[0042]按菌丝模拟产量大小排序，结果如下表所示2，A67>A41>A1>A54>SH1。选取最优菌 株为A67。
[0043]表2 5株诱变菌株的模拟产量
[0045]实施例3:诱变菌株的鉴定及产量测定 [0046] (1)菌株诱变鉴定
[0047]拮抗实验:拮抗实验是一种可以快速鉴定菌株之间遗传差异的方法，不仅可以用 来确定不同种菌株之间的关系，也可以用来鉴定同种的菌株是否产生了变异。结果显示， 诱变菌株A67与原始出发菌株SH1产生了明显的拮抗现象，从菌丝形态方面证实了菌株的遗 传物质发生了改变。
[0048] RAH)随机引物扩增：
[0049] 采用CTAB法提取诱变菌株和出发菌株的DNA，从52条RAPD引物中筛选出12条重复 性较好，可以反映菌株之间差异的引物（引物序列具体见图2)。
[0050] RAPD-PCR 扩增体系： l〇xPCRbu!Tcr 2.5 ,uL 2.5 mmol/L dNTPs 2 iVli 20 μηιοΙ/L RAPD，」|物 1 μL
[0051] ^ 5 Ι?/μΙ Taq DNA 聚合酶 0:.5 pL 100 ng,VL 校板 DNA i .〇 μL ddH：0 18 μL
[0052] RAPD-PCR 扩增条件：
[0054] 具体条带差异见图3。图3中可以明显看出诱变菌株A67与出发菌株SHI在S44、S39、 S35、S15几条引物下的电泳条带具有较为显著的差异，出现了多条条带的增添和消失，电泳 结果在分子水平证实了突变菌株A67与出发菌株SH1的遗传物质发生了显著地改变。
[0055] 菌丝体醇提物HPLC分析：取A67菌丝体2g，加入80 %乙醇40mL，超声提取2h，10 OOOr/min离心取上清液，离心浓缩得到其醇提物。取醇提物样品10mg，溶于lmL甲醇中，10 000r/min离心10min，过0.22μηι有机膜，上清上样。使用反相C18色谱柱，流动相由A，B两部分 组成，A相：超纯水(+0.1 %冰醋酸），B相：乙腈，流速：lmL/min;检测波长:254nm;柱温：30 °C ;进样量:20yL。按下列表3中的程序进行洗脱：
[0056] 表3HPLC洗脱程序
[0058]结果如图4所示，诱变菌株A67与出发菌株SH1的液相图谱发生了较大差异。与SHI 菌株的图谱相比，A67菌株产生多个新峰，说明与出发菌株相比，A67产生了新的次级代谢产 物。除此，从峰的高低、峰面积可以看出A67菌株次级代谢物的产量与出发菌株相比也有较 大程度的提升。此结果从代谢产物方面验证了 A67菌株是优于出发菌株的新菌株。
[0059] (2)出发菌株与A67菌株产量及活性测定
[0000 ]胞内多糖含量测定:胞内多糖含量测定采用总糖减还原糖的方法测定，胞内总糖 含量采用苯酚-硫酸法测定;胞内还原糖采用DNS法测定。
[0061 ]黄酮含量测定：分别取桑黄菌株冻干菌丝体lg加入到25ml容量瓶中，80%乙醇定 容至刻度，超声提取2_3h，醇提物1000r/min离心10min，取上清备用。采用NaN02-Al(N0 3)3比 色法，测定黄酮类化合物含量，每个样品做3次重复。
[0062]测定结果见如下表4。
[0063] 表4多糖和黄酮测量结果
[0064]
[0065]清除自由基能力测定
[0066]通过化学发光法测定诱变菌株与原始菌株菌丝体的醇提物，对超氧阴离子和过氧 化氢的清除作用。IC50值表示清除50 %自由基时，样品浓度的大小。IC50值与清除自由的 能力负正相关，即IC50值越小，其清除自由基的能力越强。结果见如下表5,表明：诱变菌株 A67的醇提物对过氧化氢和超氧阴离子的清除作用都要优于出发菌株，诱变菌株相比分别 提升 40.17% 和 29.45%。
[0067]表5清除自由基能力测定结果
[0068]
[0069]综合上述实施例结果表明，经ARTP技术诱变后得到的新菌株A67经多种鉴定方法 综合认定明显有别于亲本菌株SH1，其多糖和黄酮产量明显增高，生物产量及代谢活性物产 量也显著高于亲本菌株SH1，且清除自由基的能力有显著提高。
【主权项】
1. 一种桑黄菌株，其特征在于，所述桑黄菌的保藏编号为CGMCC No. 12242。2. -种权利要求1所述桑黄菌株的选育方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 原生质体的制备与诱变： 将SH1菌种接种于PDB液体培养基上，静置培养6~8d，获得菌丝体； 菌丝体用1 %溶壁酶和0.25 %崩溃酶30 °C酶解2.5~3h，获得原生质体； 原生质体稀释至1〇6个/mL，涂于载片上，置于氦气处理源下，进行ARTP诱变处理； (2) 诱变菌株的筛选： 诱变处理的菌液，放入0.6mol/L的甘露醇缓冲液中，震荡混匀，涂抹于再生培养基上生 长8~10d; 挑取再生菌株于新的平板之上，通过生长速度、生长状态、摇瓶生物量、连续传代观测 实验，选取生长速度快、生物量高、遗传稳定菌株； 通过测定超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶筛选出抗氧化能力强的优秀菌株； (3) 诱变菌株的鉴定 通过拮抗实验、DNA随机引物扩增、醇提物HPLC指纹图谱分析检测，鉴定诱变菌株是有 别于SH1菌株的新菌株。
【文档编号】C12N15/01GK105969670SQ201610392076
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】杨焱, 曲德辉, 唐传红, 张赫男, 张劲松, 冯杰, 刘艳芳, 吴迪, 颜梦秋, 周帅, 冯娜, 唐庆九, 张忠
【申请人】上海市农业科学院