一种裂殖壶菌的选育方法及一种裂殖壶菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种裂殖壶菌的选育方法及一种裂殖壶菌。
【背景技术】
[0002] 二十二碳六締酸值HA，C22:6n-3)是一种对人体健康非常有益的ω-3族脂肪酸。 人类的大脑皮层、视网膜、睾丸W及精子中DHA含量特别丰富，DHA是大脑结构脂肪酸不可 或缺的成分之一。DHA对治疗动脉粥样硬化、高甘油Ξ醋血症、高血压和癌症有非常良好的 效果，对婴幼儿智力及视力的发育起着重要的作用。另外，据报道DHA具有预防冠屯、病，降 低屯、脏病患者巧死几率，预防老年痴呆和延缓衰老等作用。人类由于缺少合成ω-3族脂肪 酸所需的酶，不能自身合成DHA，只能从食物中摄取。传统上DHA从深海鱼油中提取，受鱼的 品种、季节、地理位置的影响而不稳定，且鱼油中还富含胆固醇和其他不饱和脂肪酸成分， 导致DHA提取纯化成本较高，产量也有限。 阳003] 裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)又称裂壶藻，能够合成DHA，由于其繁殖方式为 裂殖，生长周期短，且细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，被认为是生产DHA较理想的菌种。 选育稳定的和油脂含量高的裂殖壶菌优良菌种是DHA高产的关键。
[0004] 植物纤维素是自然界中最为丰富的一类有机物。据估计，植物每年通过光合作用 产生的干物质高达1500~2000亿吨，是地球上唯一可超大规模再生的实物性资源。在我 国，每年产生的农业作物賴杆有7亿多吨，相当于3. 5亿吨标准煤，但每年用于工业过程或 燃烧的植物纤维素资源仅占2%左右，绝大部分还未被利用。近几十年由于化石资源短缺 日趋严峻和环境污染日益严重，W来源广泛且可再生的植物纤维素为原料转化生物能源和 生产工业化学品受到了世界各国的广泛关注。其中W生物技术为核屯、的植物纤维素的生物 转化已经成为生物能源开发、生物质资源加工和绿色化工过程的关键技术之一。 阳0化]植物纤维素酸水解后可产生大量的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和少量氮源，理论上能 够满足菌体生长代谢的需要，如果能够利用可再生的纤维素水解液作为培养基来培养裂殖 壶菌，则裂殖壶菌发酵生产DHA的成本会大大降低，节约大量能源，同时将植物纤维素变废 为宝。但是，纤维素水解液中除了细胞生长必需的碳源和氮源之外，往往还存在副产物如甲 酸、乙酸、5-径甲基慷醒等对细胞有毒性的物质，而野生型的裂殖壶菌基本无法在未脱毒的 纤维素水解液中生长。运一问题的常规解决思路和方法是将纤维素水解液进行加酶和脱毒 处理，使其满足裂殖壶菌的生长要求，但脱毒过程耗时耗力，且二次污染严重。
[0006] 菌株选育通常采用一些物理和化学诱变方法，例如紫外诱变、离子束诱变与甲基 横酸乙醋（EM巧、亚硝基脈（NTG)等诱变剂诱变等。常规的突变株的筛选方法也有很多，例 如苏丹黑B染色法、红四氮挫变色法、低溫高糖处理法、流式细胞仪筛选法等等。但是运些 方法存在毒性大、效率低、筛选过程不直观的缺点。
[0007] 因此，发明人尝试新方法选育对未脱毒的纤维素水解液具有抗性的裂殖壶菌型菌 株，期望筛选出的菌株可W直接生长在未经脱毒处理的纤维素水解液中，进而用W高效生 产DHA。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于提供一种裂殖壶菌的选育方法，该方法能够选育得到突变 型裂殖壶菌菌株，其对甘薦渣水解液中的毒性物质具有抗性，能够在未经脱毒的甘薦渣水 解液中生长代谢并生产DHA。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种对未脱毒的甘薦渣水解液具有抗性的裂殖壶菌 突变菌株，该菌株能够直接在未脱毒的甘薦渣水解液中生长代谢并生产DHA。
[0010] 本发明的采用的技术方案如下：
[0011] 本发明提供一种裂殖壶菌的选育方法，包括如下步骤：
[0012] (1)制备裂殖壶菌初始菌体的菌悬液；
[0013] (2)将所述菌悬液涂布于甘薦渣水解液固体培养基上培养；
[0014] 所述甘薦渣水解液固体培养基包括甘薦渣水解液、盐分和琼脂；所述甘薦渣水解 液的浓度使菌体的死亡率高于90% ;
[0015] 所述甘薦渣水解液为甘薦渣水解原液或由所述甘薦渣水解原液稀释得到的稀释 液；所述的甘薦渣水解原液是将甘薦渣进行酸热处理，再调节抑至5-7得到的；
[0016] (3)挑选所述甘薦渣水解液固体培养基上成活的单菌落，分别传代培养；
[0017] (4)选择能够稳定传代且菌体DHA产量高的菌株。
[0018] 根据本发明的选育方法，步骤（1)中所述裂殖壶菌初始菌体可W为市售的任何裂 殖壶菌菌体，优选为能够高产DHA的裂殖壶菌菌体。
[0019] 根据本发明的选育方法，优选地，步骤（1)所述制备裂殖壶菌菌悬液的方法是：将 裂殖壶菌初始菌体进行活化培养，得到裂殖壶菌种子菌液；将所述裂殖壶菌种子菌液采用 无菌生理盐水稀释，离屯、，菌体采用无菌生理盐水重悬，得到菌悬液。所述菌体活化培养的 方法可采用领域内已知的裂殖壶菌活化方法。根据本发明一种优选的实施方式，所述菌体 活化培养的方法为：将裂殖壶菌初始菌体接种于平板固体培养基中，于25~3(TC下培养 36~4她，得到单菌落；将单菌落接种于种子液体培养基中，25~30°C下培养24~36h，得 到所述裂殖壶菌种子菌液。所述平板固体培养基和所述种子液体培养基均可采用已知的 那些。根据本发明优选的实施方式，所述平板固体培养基的组成为：葡萄糖为30~60g/l、 蛋白腺为10~20g/l、酵母浸膏为5~15旨/1，海水晶为20~30g/l，琼脂15~20g/L。所 述种子液体培养基的组成为：葡萄糖为30~60肖/1、蛋白腺为10~20g/l、酵母浸膏为5~ 15g/l，海水晶为20~30g/L。采用上述的种子液体培养基，裂殖壶菌增殖速度快，活性高， 涂布于甘薦渣水解液固体培养基中时更容易存活和增殖。
[0020] 根据本发明的选育方法，优选地，步骤（1)中，所述菌悬液浓度为1〇6~10Sc化。
[0021] 根据本发明的选育方法，步骤（2)中，所述甘薦渣为甘薦棒糖后的废料。发明人发 现，甘薦渣水解液的营养成分适合裂殖壶菌生长并生产DHA，且甘薦渣原料丰富，价格低廉。 优选地，所述甘薦渣经过干燥处理，控制含水量在5wt%W下。根据本发明一种优选的实施 方式，所述的干燥处理的溫度为60~80°C，时间2~3天，可选地，同时增加鼓风操作，W增 强干燥效果。例如，可采用鼓风干燥箱进行干燥处理。根据本发明的选育方法，优选地，所 述甘薦渣在干燥前或干燥后进行粉碎处理，优选在干燥后进行粉碎处理。根据本发明优选 的实施方式，所述甘薦渣粉碎至粒径为2~20mm。更优选地，所述甘薦渣粉碎后利用网筛进 行筛分得到甘薦渣粉。根据本发明优选的实施方式，所述网筛的孔径小于16mm。
[0022] 根据本发明的选育方法，步骤（2)中，所述甘薦渣水解原液通过将甘薦渣与酸液 混合、加热处理，再经调节抑得到；所述的酸液可W为硫酸、盐酸、硝酸中的至少一种。更 优选为硫酸。调节piH碱液可W是氨氧化钢水溶液、氨氧化钟水溶液、氨氧化巧水溶液等，优 选为氨氧化巧水溶液。根据本发明一种优选的实施方式，步骤（2)中所述甘薦渣水解原液 的制备方法为：将甘薦渣与酸液按照固液比为1:2~8混合，于100~160°C下反应60~ 200min，过滤，加入碱液调节抑至5~7 ;所述酸液的氨离子浓度为0. 01~0. 05mol/L。 根据本发明一种更优选的实施方式，步骤（2)中，所述甘薦渣水解液固体培养基由甘薦渣 水解原液加入盐分和琼脂制成，所述甘薦渣水解原液的制备方法为：将甘薦渣与硫酸水溶 液按照固液比为1:3~6混合，于120~150°C下反应60~120min，过滤加入碱液调节至 P册~7 ;所述硫酸的浓度为0. 01~0. 02mol/L。
[0023] 根据本发明的选育方法，优选地，步骤（2)中，所述甘薦渣水解液的浓度使菌体的 死亡率高于95 %，更优选为高于99 %，再优选高于99. 9 %。不言自明，死亡率不能为100 %， 否则无法进行后续选育步骤。发明人发现，裂殖壶菌对于未脱毒且稀释倍数越小的甘薦渣 水解液耐受性较低，菌体致死率高，同时，对于在稀释倍数越小的甘薦渣水解液中能够存活 的裂殖壶菌菌株，其耐受力往往更强，也具备更高的DHA产量；而适当降低甘薦渣水解液的 浓度，则有助于提高裂殖壶菌的存活率，从而增加选育样本量。发明人发现，当采用甘薦渣 水解原液的1~2倍稀释液时，是比