一种裂殖壶菌的选育方法及一种裂殖壶菌的制作方法_3

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下干燥2. 5天,至其含水量低 于 5wt%;
[0057] 似将干燥后的甘薦渣用粉碎机粉碎,过筛,得到粒径2~15mm的甘薦渣粉;
[(K)郎]做将甘薦渣粉与0.Olmol/L的H2SO4溶液按照固液比为1:8混合,于140°C下反 应200min,过滤,滤液采用Ca(0H)2调节至抑6,静置化,过滤,得到甘薦渣水解原液。 阳0巧]制备俩I4
[0060] 甘薦渣水解液固体培养基的制备:
[0061] 由制备例1的甘薦渣水解原液,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的 (NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶、20g/L的琼脂,灭菌,得到甘薦渣水解液固体培养 基;
[0062] 甘薦渣水解液液体培养基的制备:
[0063] 由制备例1的甘薦渣水解原液,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的 (NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶,灭菌,得到甘薦渣水解液液体培养基。
[0064] 制备俩I 5 阳〇化]甘薦渣水解液固体培养基的制备:
[0066]由制备例2的甘薦渣水解原液,加水稀释1. 1倍,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶、20g/L的琼脂,灭菌,得到甘薦 渣水解液固体培养基; 阳067] 甘薦渣水解液液体培养基的制备: W側 由制备例2的甘薦渣水解原液,加水稀释1. 1倍,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的 Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶,灭菌,得到甘薦渣水解液液体 培养基。 阳0~]制备俩I6
[0070]甘薦渣水解液固体培养基的制备: 阳071]由制备例3的甘薦渣水解原液,加水稀释1. 5倍,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶、20g/L的琼脂,灭菌,得到甘薦 渣水解液固体培养基;
[0072] 甘薦渣水解液液体培养基的制备: 阳073]由制备例3的甘薦渣水解原液,加水稀释1. 5倍,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶,灭菌,得到甘薦渣水解液液体 培养基。
[0074] 制备俩I 7
[00巧]甘薦渣水解液固体培养基的制备:
[0076] 由制备例1的甘薦渣水解原液,加水稀释2倍,加入3g/L的Na2S〇4、0. 75g/L的 Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶、20g/L的琼脂,灭菌,得到甘薦 渣水解液固体培养基;
[0077] 甘薦渣水解液液体培养基的制备:
[0078] 由制备例1的甘薦渣水解原液,稀释2倍,加入3g/L的Na2S〇4、0.75g/L的Μ拆〇4、 0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶,灭菌,得到甘薦渣水解液液体培养基。 阳0巧]制备俩I8
[0080] 发酵培养基的制备:
[0081] 称取葡萄糖90g/l、蛋白腺为15g/l、酵母浸膏为15g/l,海水晶为25g/l、3g/L的 Na2S〇4、0. 75g/L的MgS〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2PO4,加水定容,灭菌,得到发酵培 养基。
[0082] 连施俩I 1
[0083] 选育裂殖壶菌的方法,包括如下步骤:
[0084] (1)取-80°C保藏的裂殖壶菌Schizoc^triumsp,划线接种于平板固体培养基 上,于25°C下活化4她,得到单菌落;将所得单菌落接种于种子液体培养基上,于25°C下摇 床培养36h,装液量为50mL/250mU摇床转速为18化/min,得到种子菌液;将所得种子菌液 用无菌水稀释,离屯、,操作2次,再用无菌生理盐水将菌体重悬稀释至106~108c化,得到菌 悬液;
[00化]其中,平板固体培养基的配方为:葡萄糖为30旨/1、蛋白腺为lOg/l、酵母浸膏为 5邑/1,海水晶为25g/l,琼脂20g/L;所述种子液体培养基的配方为:葡萄糖为30g/l、蛋白腺 为lOg/l、酵母浸膏为5g/l,海水晶为25g/L;
[0086] (2)将菌悬液涂布于制备例4的甘薦渣水解液固体培养基上,25°C下培养4天;
[0087] (3)挑选甘薦渣水解液固体培养基上成活的单菌落,分别传代培养,培养基仍采用 制备例4的甘薦渣水解液固体培养基,25°C下培养,周期为4天;
[0088] (4)选择能够稳定传代5代W上的菌株,置于制备例4的甘薦渣水解液液体培养基 中发酵培养,溫度为25°C,发酵周期为10化,接种量为lmL/50ml,摇床转速为22化/min;ii 定发酵菌体的DHA产量,选择DHA产量较高的菌株。
[0089]连施俩I2
[0090] (1)按照实施例1步骤(1)的方法制备菌悬液;
[0091] (2)将菌悬液涂布于制备例5的甘薦渣水解液固体培养基上,25°C下培养4天;
[0092] (3)挑选甘薦渣水解液固体培养基上成活的单菌落,分别传代培养,培养基仍采用 制备例5的甘薦渣水解液固体培养基,25°C下培养,周期4天;
[0093] (4)选择能够稳定传代5代W上的菌株,置于制备例5的甘薦渣水解液液体培养基 中发酵培养,溫度为25°C,发酵周期为10化,接种量为lmL/50ml,摇床转速为22化/min;ii 定发酵菌体的DHA产量,选择DHA产量较高的菌株。
[0094] 连施俩I 3 阳09引 (1)按照实施例1步骤(1)的方法制备菌悬液;
[0096] (2)将菌悬液涂布于制备例6的甘薦渣水解液固体培养基上,25°C下培养4天;
[0097] (3)挑选甘薦渣水解液固体培养基上成活的单菌落,分别传代培养,培养基仍采用 制备例6的甘薦渣水解液固体培养基,25°C下培养,周期4天;
[0098] (4)选择能够稳定传代5代W上的菌株,置于制备例6的甘薦渣水解液液体培养基 中发酵培养,溫度为25°C,发酵周期为10化,接种量为lmL/50ml,摇床转速为22化/min;ii 定发酵菌体的DHA产量,选择DHA产量较高的菌株。 阳〇巧]连施俩I 4
[0100] (1)按照实施例1步骤(1)的方法制备菌悬液; 阳101] (2)将菌悬液涂布于制备例7的甘薦渣水解液固体培养基上,25°C下培养4天; 阳102] (3)挑选甘薦渣水解液固体培养基上成活的单菌落,分别传代培养,培养基仍采用 制备例7的甘薦渣水解液固体培养基,25°C下培养,周期4天;
[0103] (4)选择能够稳定传代5代W上的菌株,置于制备例8的发酵培养基中发酵培养, 溫度为25°C,发酵周期为10化,接种量为lmL/50ml,摇床转速为22化/min;测定发酵菌体的DHA产量,选择DHA产量较高的菌株。 W04]试輪例1
[01化]实施例1~4中,步骤(2)培养后菌体致死率见表1。
[0106]表1阳107]

。…引 试輪俩I2 阳109] 实施例1-4选育得到的多个菌株中,得到了高产DHA的裂殖壶菌菌株Schizochytriumsp.FNU1,该菌株由实施例1的方法筛选得到,遗传性状和DHA产量表 现突出,申请人已将其保藏于中国典型培养物保藏中屯、(CCTCC),保藏号为CCTCCN0:M 2015636ο
[0110]突变菌株Schizoch}ft;rium sp.FNUl的抗性验证试验: 阳1?] (1)将突变菌株Schizoc^triumsp.FNU1接种于种子培养液中,于25°C下摇床 培养36h,摇床转速22化/min,装液量为50mL/250mU得到种子液;所述种子培养液配方为: 3g/L的化2S04、0. 75g/L的Μ拆〇4、0. 25g/L的(NH4)2S〇4、3g/L的KH2P〇4、20g/L的海水晶; 阳11引 似将制备例1所制备的甘薦渣水解原液灭菌、冷却后,将步骤(1)所得种子液移 种于该培养液中,接种量为lm
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