裂殖壶菌ylh70及其合成dha的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株新菌株--裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)YLH70及其在合成DHA中的应用，本发明的原料是非粮食资源菊芋及植物淀粉来源的果葡糖浆，产量大且价格低廉，可以降低DHA的生产成本；菊芋水解液和果葡糖浆含有高浓度的还原糖，且以果糖、低聚果糖和葡萄糖等易发酵糖类为主，成为裂殖壶菌生产DHA的潜在碳源；提供发酵性能优良的裂殖壶菌(Aurantiochytrium sp.)YLH70菌株，在以菊芋水解液作为唯一碳源的培养基中，发酵生物量可达54.61-76.52g/L，DHA产量可达12.56-18.78g/L；而以果葡糖浆作为唯一碳源的培养基中，发酵生物量可达70.51-79.85g/L，DHA产量可达14.1-20.1g/L。
CCTCC NO：M 2014215
20140521
【专利说明】裂殖壶菌YLH70及其合成DHA的应用 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海洋原生生物裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株，及 其利用菊芋水解液或果葡糖浆生产二十二碳六烯酸（DHA)的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] DHA (二十二碳六稀酸，Docosahexaenoic acid)，被誉为"脑黄金"，是成人及婴幼 儿视觉和大脑等神经系统发育不可缺少的重要物质；具有预防心血管疾病、抗癌、抗炎等生 理功效；在饵料中添加一定比例的DHA，可显著提高水产品及家禽的品质和生长速率。DHA 广泛应用于医药、食品和饲料领域，其广阔的市场前景受到人们的极大关注。传统的DHA 资源是鱼油，然而鱼油目前面临资源匮乏、污染、工艺繁琐、口感差及高成本等问题，制约着 DHA产业发展，人们急需寻找一种新型的DHA资源以替代传统的鱼油资源。
[0003] 研宄发现海洋微生物裂殖壶菌细胞中能积累大量DHA，而且具有培养周期短和不 易受污染等优点，能够克服鱼油资源所面临的种种问题；同时裂殖壶菌来源的DHA已通过 FDA等权威机构的安全认证，是安全的DHA新资源。国内外开展裂殖壶菌生产DHA的相关研 宄，已有相关专利的公开。申请号为 200910061419. 7、201210251850. X、201210380900. 4、 201210338013. (K200910130628. 2的专利公开了利用裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺， 培养基均使用葡萄糖、蛋白胨和酵母粉等传统碳氮源。为了降低生产成本，申请号为 201010104774. 0的专利公开了裂殖壶菌利用廉价的豆柏水解液作为氮源发酵生产DHA的 工艺，而申请号为201310571413. 0的专利则通过处理废弃秸杆生成水解液，并以此作为碳 源生产DHA，有效降低了 DHA的生产成本，而裂殖壶菌利用廉价的菊芋水解液或果葡糖浆等 富含果糖的植物质资源发酵生产DHA的方法并未见报道。
[0004] 菊芋又称鬼子姜、洋姜，是一种耐贫瘠和干旱的高产、高糖植物。菊芋产量可达1. 2 吨/亩，其块茎中的主要成分是菊糖，除此之外，还含有果胶、纤维素、蛋白质和微量元素等 成分，是一种重要的非粮食生物质能源。与传统的淀粉质原料不同，菊糖是由D-呋喃果糖 通过β -2, 1糖苷键相连而成的多聚果糖，其还原性末端通常为葡萄糖残基；与另外富含菊 糖的植物相比，菊芋中菊糖聚合度一般较低，容易实现微生物的转化。目前利用菊芋发酵生 产酒精和单细胞蛋白已有报道，但附加值较低，无法实现菊芋资源的大规模高效利用，而利 用菊芋发酵生产DHA等高值产品并未见报道。
[0005] 果葡糖浆是通过对植物来源的淀粉质进行水解和异构化处理而生产的，是一种重 要的调味剂。由于生产果葡糖浆不受季节限制，设备简单，原料及投资费用低，故其生产成 本大大降低，经常用来替代单一葡萄糖、果糖和蔗糖等作为调味剂。果葡糖浆主要成分是果 糖和葡萄糖等可发酵单糖，发酵性能好，很多微生物能够利用果葡糖浆快速生长。果葡糖浆 还原糖含量高，同时具有较好的溶解性，且抗结晶性和流动性好，适用于任何条件下高糖培 养基的配制及发酵过程。基于果葡糖浆的诸多优势，利用其生产高值产品（如DHA)的方法 尚未报道。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是基于DHA生产成本以及菊芋水解液和果葡糖浆在发酵过程中的 优势，本发明旨在提供一种以果糖为优势碳源、高产DHA的裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,及其利用菊芋水解液或果葡糖浆发酵生产DHA的方法。本发明有效降低了 DHA 生产成本，有效利用了菊芋或果葡糖浆资源，且整个工艺流程简单，设备要求低，可控性强， 适用于工业化生产。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一株新菌株一裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO !M2014215,保藏日期为2014年5月21日，保藏地 址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。本发明所述裂殖壶菌YLH70利用的碳源是葡萄糖、 果糖、鹿糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘油、橄榄油和木糖中的一种或几种；可利用的氮源是酵母 粉、蛋白胨、玉米浆和豆饼粉中的一种或几种，脂肪酸主要包括十四烷酸、十六烷酸、二十二 碳五烯酸（EPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。
[0009] 本发明还提供一种所述裂殖壶菌YLH70在合成二十二碳六烯酸中的应用，具体所 述的应用为：将裂殖壶菌YLH70接种至以菊芋水解液或果葡糖浆为唯一碳源的发酵培养基 中，在20-32°C、通气量20-100L/min、搅拌速度200-600rpm、溶氧量10-60%的条件下，培养 时间2-6天，获得发酵液；将发酵液离心，取沉淀，获得含二十二碳六烯酸的菌体，从菌体分 离提取获得二十二碳六烯酸；所述菊芋水解液制备方法为：将新鲜菊芋清洗、切片、干燥、 粉碎制成菊芋粉末，再将菊芋粉末于硫酸水溶液中，60-100°C提取30-300min，过滤，取滤液 调节pH值至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果胶酶和纤维素酶，再在30-60°C下水解5-48h，过滤， 取滤液即为菊芋水解液，所述硫酸水溶液的体积用量以菊芋粉重量计为l_15mL/g。
[0010] 进一步，优选所述发酵培养基组成为：酵母粉5-30g/L，海盐5-30g/L，硫胺素 0· 01-0. lmg/L，钴胺素 (λ 001-0. 01mg/L，七水硫酸铁 l-10mg/L，五水硫酸铜(λ 5-5mg/L，七 水硫酸锌〇. 5-5mg/L，一水硫酸锰0. 1-lmg/L，添加菊芋水解液或果葡糖浆使发酵培养基总 还原糖浓度达到40-100g/L，pH值5. 0-7. 0 (优选使用体积浓度40%的NaOH水溶液调pH 至5. 0-7. 0,115°C灭菌30min)。更优选发酵培养基组成为：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺 素0· lmg/L，钴胺素 (λ 004-0. 005mg/L，七水硫酸铁5-7mg/L，五水硫酸铜L 5mg/L，七水硫酸 锌I. 5mg/L，一水硫酸锰0. 5mg/L，添加菊芋水解液或果葡糖浆使培养基总还原糖浓度达到 60-100g/L，pH值6. 0-7. 0 (优选使用体积浓度40%的NaOH水溶液调pH至6. 0-7. 0,115°C 灭菌 30min)。
[0011] 进一步，本发明所述菊芋水解液制备方法为：将新鲜菊芋清洗、切片后在40-80°C 烘箱中烘干，粉碎过60目筛，获得菊芋粉；将菊芋粉与体积浓度1-10%的硫酸水溶液混合， 在60-100°C反应30-300min，过滤，滤液调节pH至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果胶酶和纤维素 酶，在30-60°C下水解5-48h，过滤，滤液即为菊芋水解液；所述硫酸水溶液的体积用量以菊 芋粉重量计为l_5mL/g，所述菊糖酶的用量以菊芋粉重量计为5-80U/g(优选为5-40U/g)， 果胶酶的用量以菊芋粉重量计为〇. 5-10U/g(优选为0. 5-5U/g)，纤维素酶的用量以菊芋粉 重量计为10_80U/g(优选为10-30U/g)。
[0012] 进一步，本发明发酵培养条件优选为：温度25-30°C，通气量40-100L/min，搅拌速 度200-600rpm，溶氧量40-60%的条件下，培养时间4-6天，获得发酵液。
[0013] 进一步，本发明所述裂殖壶菌YLH70在发酵培养前先进行扩大培养，所述扩大培 养的方法为：将裂殖壶菌YLH70转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天，得到单菌落； 将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2天，得一级 种子液；将一级种子液以体积浓度1 %接种量接入含150mL种子培养基的500mL三角瓶中， 28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%的接种量转入发 酵培养基进行发酵培养；所述海水平板终浓度组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨 5g/L，海盐20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值为6. 0 ;所述种子培养基终浓度组成为：酵 母粉10g/L，海盐20g/L，添加菊芋水解液或果萄糖浆使培养基还原糖浓度为40g/L，溶剂为 水，pH 值 6.0。
[0014] 本发明所述裂殖壶菌YLH70发酵培养中，当培养体系中还原糖浓度低于IOg/ L时，使用菊芋水解液或果葡糖浆按照分批补料或流加方式使培养基总还原糖浓度达到 40-100g/L进行发酵，直到结束得到裂殖壶菌发酵液。
[0015] 本发明所述菊芋（Jerusalem artichoke)，又名洋姜、五星草，是菊科、向日葵属宿 根性草本植物，菊科、管状花亚科、向日葵族、向日葵属、被子植物门、五膜草属、木兰门、菊 芋种，洋姜亚种。
[0016] 本发明所述从菌体分离提取获得二十二碳六烯酸方法为：蒋发酵液5000rpm、4°C 下离心5min，弃上清液得到菌体，然后使用蒸馏水洗涤菌体2次，-40°C冷冻干燥至菌体 恒重，即为冻干菌体；将冻干菌体在液氮下研磨至粉末状，获得裂殖壶菌YLH70干菌粉；称 取Ig干菌粉加入5mL饱和NaCl水溶液充分混匀，用5mL正己烷萃取3次，合并萃取液，在 40°C下将萃取液蒸干，获得油脂；再用正己烷将0. 592g油脂定容至10mL，取5mL并加入5mL 0. 4M的KOH甲醇水溶液，60°C皂化lh，向皂化液中加入5mL(体积浓度，v/v) 14%的三氟化 硼甲醇溶液，60°C甲酯化lh，甲酯化反应液用2mL正己烷萃取3次，合并萃取液，获得DHA粗 品。
[0017] 本发明的有益效果主要体现在：
[0018] 本发明的原料是非粮食资源菊芋及植物淀粉来源的果葡糖浆，产量大且价格低 廉，可以降低DHA的生产成本；菊芋水解液和果葡糖浆含有高浓度的还原糖，且以果糖、低 聚果糖和葡萄糖等易发酵糖类为主，成为裂殖壶菌生产DHA的潜在碳源；本发明提供发酵 性能优良的裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株，在以菊芋水解液作为唯一碳源 的培养基中，发酵生物量可达54. 61-76. 52g/L，DHA产量可达12. 56-18. 78g/L ;而以果葡糖 浆作为唯一碳源的培养基中，发酵生物量可达70. 51-79. 85g/L，DHA产量可达14. 1-20. Ig/ L0 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是裂殖壶菌YLH70的平板菌落形态。
[0020] 图2是裂殖壶菌YLH70的显微镜细胞形态（400 X)。
[0021] 图3是基于18SrDNA序列的进化树。 (五）
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0023] 实施例1裂殖壶菌YLH70的分离及鉴定
[0024] (1)菌株YLH70的分离
[0025] 在浙江省温州市乐清湾海边采集腐叶样品，洗净放于表面悬浮0. Ig松花粉的YP 培养液（lg/L酵母粉，lg/L蛋白胨，50mg/L氨苄青霉素，50mg/L链霉素，水配制，pH值6. 0) 中，30°〇黑暗培养1周，取50^培养物涂布于￥?平板（18/1酵母粉，18/1蛋白胨，5〇11^/1 氨苄青霉素，50mg/L链霉素，琼脂20g/L，水配制，pH值6. 0)上，28°C培养3天，直到长出单 菌落，重复划线纯化培养三次，得到纯的菌株，记为菌株YLH70。
[0026] ⑵菌株YLH7O的鉴定
[0027] 将菌株YLH70接种在YP平板上，28°C培养2天，菌落呈黄白色，圆形，表面湿润光 滑，微微隆起（图1);在显微镜下细胞呈圆形或椭圆形，直径5-20 μ m，细胞表面比较明亮， 有鳞片状结构，边缘清晰，细胞分裂增殖，有偶数个细胞聚集在一起的现象（图2)。
[0028] 菌株 YLH70 的 18SrDNA 序列见 SEQ ID No. 1 所不。与 Aurantiochytrium sp.菌 株KRS101、BLll和TF23的18SrDNA序列相似度可达99%，另外基于18SrDNA序列的进 化树（图3)显不菌株YLH70与Aurantiochytrium sp. KRSlOl、BLll和TF23菌株很好的 聚在一起，故将将菌株YLH70鉴定为裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp.)，命名为裂殖壶菌 (Aurantiochytrium sp.)YLH70〇
[0029] 实施例2菊芋水解液的制备
[0030] 将约5000g新鲜菊芋（Jerusalem artichoke)洗净，切片，在80°C烘箱中放置24h 烘干。将干燥的菊芋片经固体粉碎机粉碎，使用60目的网筛过滤，获得菊芋粉。称取IOOOg 菊芋粉，与3000mL的体积浓度3%硫酸水溶液混合，80°C下酸解240min，过滤得到菊芋汁 (即滤液），IM的NaOH水溶液调pH至6. 0。向滤液中添加菊糖酶40U/g菊芋粉，果胶酶2U/ g菊芋粉，纤维素酶l〇U/g菊芋粉，在温度50°C下水解24h，过滤制成菊芋水解液，其还原糖 浓度是145g/L，S卩为菊芋水解液。
[0031] 实施例3菊芋水解液的制备
[0032] 将约5000g新鲜菊芋洗净，切片，在40°C烘箱中放置48h烘干。将干燥的菊芋片经 固体粉碎机粉碎，使用60目的网筛过滤，获得菊芋粉。称取3000g菊芋粉，与3000mL的体 积浓度10%硫酸水溶液混合，l〇〇°C下酸解30min，过滤得到菊芋汁，IM的NaOH水溶液调pH 至6. 0。向菊芋汁中添加菊糖酶5U/g菊芋粉，果胶酶0. 5U/g菊芋粉，纤维素酶10U/g菊芋 粉，在温度30°C下水解48h，过滤制成菊芋水解液，其还原糖浓度是256g/L。
[0033] 实施例4菊芋水解液的制备
[0034] 将约5000g新鲜菊芋洗净，切片，在60°C烘箱中放置32h烘干。将干燥的菊芋片经 固体粉碎机粉碎，使用60目的网筛过滤，获得菊芋粉。称取600g菊芋粉，与3000mL的体积 浓度1 %硫酸水溶液混合，60°C下酸解300min，过滤得到菊芋汁，IM的NaOH水溶液调pH至 6. 0。向菊芋汁中添加菊糖酶30U/g菊芋粉，果胶酶5U/g菊芋粉，纤维素酶30U/g菊芋粉， 在温度60°C下水解5h，过滤制成菊芋水解液，其还原糖浓度是90g/L。
[0035] 实施例5裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液发酵生产 DHA
[0036] (1)裂殖壶菌YLH70利用菊芋水解液发酵生产DHA
[0037] 将_80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌株转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%的接种 量转入含发酵培养基的5L发酵罐中（装液量为3L)，发酵罐温度28°C，通气量40L/min，搅 拌转速600rpm，溶氧量40 %。当发酵液还原糖浓度低于10g/L时，通过实施例3配制的菊 芋水解液分批补料使培养基还原糖浓度达到60g/L，发酵4天停止，得到裂殖壶菌YLH70发 酵液。
[0038] 海水平板终浓度组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L，琼 脂20g/L，溶剂水，pH值6.0。
[0039] 种子培养基组成：酵母粉10g/L，海盐20g/L，添加菊芋水解液（实施例3配制）和 水使培养基还原糖浓度为40g/L，使用质量浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121°C高压 蒸汽灭菌20min待用；发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素0. lmg/L，钴胺 素0. 005mg/L，七水硫酸铁5mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/L，一水硫酸猛 0. 5mg/L，添加菊芋水解液（实施例3配制）使培养基还原糖浓度为100g/L，溶剂为水，使用 质量浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121 °C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0040] ⑵DHA的提取和分析
[0041] 取步骤（1)中裂殖壶菌发酵液40ml到50mL离心管中，5000rpm和4°C下离心5min， 弃上清液得到菌体，然后使用蒸馏水洗涤菌体2次，-40°C冷冻干燥至菌体恒重，菌体生物 量是65. 35g/L，即为冻干菌体。
[0042] 将冻干菌体在液氮下研磨至粉末状，获得裂殖壶菌YLH70干菌粉。称取Ig裂殖壶 菌YLH70干菌粉至带有螺帽的50mL离心管中，加入5mL饱和NaCl水溶液充分混匀，5mL正 己烷萃取3次，合并萃取液。使用旋转蒸发仪40°C下将萃取液蒸干，获得油脂0. 592g，占细 胞干重的59. 2%。
[0043] 使用正己烷将0. 592g油脂定容至10mL，取5mL并加入5mL 0. 4M的KOH甲醇水溶 液，60°C皂化lh，向皂化液中加入5mL(体积浓度，v/v) 14%的三氟化硼甲醇溶液，60°C甲酯 化lh，甲酯化反应液用2mL正己烷萃取3次，合并萃取液并用正己烷定容至10mL，使用安捷 伦6890N气相色谱仪分析。HP-INN0WAX毛细血管柱（30mX0. 25mmX0. 25 μπι)，氦气作为载 气，流量是lmL/min，进样口温度250°C，检测器温度250°C，进样量lyL。控温程序：100°C 以15°C /min速度升至240°C，并保持10min。以十九烷酸甲酯作为内标。测得DHA产量可 达 16. 78g/L。
[0044] 实施例6裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液发酵生产 DHA
[0045] 将_80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌株转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%的接种 量转入含发酵培养基的5L发酵罐中（装液量为3L)，发酵罐温度25°C，通气量100L/min，搅 拌转速200rpm，溶氧量40 %。当还原糖浓度低于10g/L时，通过实施例3配制的菊芋水解 液分批补料使培养基还原糖浓度达到60g/L，发酵6天停止，得到裂殖壶菌YLH70发酵液。
[0046] 种子培养基组分见实施例5,发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素 0· lmg/L，钴胺素0· 005mg/L，七水硫酸铁5mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/L， 一水硫酸锰0. 5mg/L，添加菊芋水解液（实施例3配制）使培养基还原糖浓度为80g/L，溶 剂为水，使用质量浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121°C高压蒸汽灭菌20min待用。生 物量、油脂和DHA的分析见实施例5,菌体生物量是69. 8g/L，油脂占细胞干重的49. 1 %，DHA 产量可达17. 20g/L。
[0047] 实施例7裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用菊芋水解液发酵生产 DHA
[0048] 将-80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌株转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%的接种 量转入含发酵培养基的5L发酵罐中（装液量为3L)，发酵罐温度30°C，通气量60L/min，搅 拌转速400rpm，溶氧量60 %。当还原糖浓度低于10g/L时，通过实施例3配制的菊芋水解 液分批补料使培养基还原糖浓度达到60g/L，发酵5天停止，得到裂殖壶菌YLH70发酵液。
[0049] 种子培养基组分见实施例5,发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素 0· lmg/L，钴胺素0· 005mg/L，七水硫酸铁5mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/L， 一水硫酸锰0. 5mg/L，添加菊芋水解液（实施例3配制）使培养基还原糖浓度为60g/L，溶 剂为水，使用质量浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121°C高压蒸汽灭菌20min待用。生 物量、油脂和DHA的分析见实施例5,菌体生物量是72. 14g/L，油脂占细胞干重的45. 5%， DHA产量可达15. 78g/L。
[0050] 实施例8裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用果葡糖衆发酵生产 DHA
[0051] 将_80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌种转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%转入含 发酵培养基的发酵罐中，发酵罐温度28°C，通气量60L/min，搅拌转速600rpm，溶氧量60%。 当还原糖浓度低于l〇g/L时，通过果葡糖浆分批补料使培养基还原糖浓度达到80g/L，发酵 4天停止，得到裂殖壶菌YLH70发酵液。
[0052] 种子培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，添加果葡糖浆液使培养基还原糖 浓度为40g/L，溶剂为水，使用质量浓度40 % NaOH水溶液调pH至6. 0,121 °C高压蒸汽 灭菌20min待用；发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素0. 05mg/L，钴胺素 0. 004mg/L，七水硫酸铁7mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/L，一水硫酸猛 0. 5mg/L，添加果葡糖浆液使还原糖浓度为100g/L，溶剂为水，使用质量浓度40 % NaOH水溶 液调pH至6. 0,121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0053] 生物量、油脂和DHA的分析见实施例5,菌体生物量是75. 24g/L，油脂占细胞干重 的 52. 15%，DHA 产量可达 18. 26g/L。
[0054] 实施例9裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp.) YLH70菌株利用果葡糖衆发酵生产 DHA
[0055] 将-80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌种转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%接种 量转入含发酵培养基的发酵罐中，发酵罐温度25°C，通气量100L/min，搅拌转速200rpm，溶 氧量40%。当还原糖浓度低于10g/L时，通过果葡糖浆分批补料使培养基还原糖浓度达到 80g/L，发酵5天停止，得到裂殖壶菌YLH70发酵液。
[0056] 种子培养基组分见实施例8 ;发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素 0· 05mg/L，钴胺素0· 004mg/L，七水硫酸铁7mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/ L，一水硫酸锰0. 5mg/L，添加果葡糖浆（购自湖北德安府糖业有限责任公司）使培养基还原 糖浓度为80g/L，溶剂为水，使用质量浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121 °C高压蒸汽灭 菌20min待用。
[0057] 生物量、油脂和DHA的分析见实施例5,菌体生物量是78. 15g/L，油脂占细胞干重 的 55%，DHA 产量可达 19. 52g/L。
[0058] 实施例10裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70菌株利用果葡糖衆发酵生产 DHA
[0059] 将-80°C保存的裂殖壶菌YLH70菌种转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3天， 得到单菌落。将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培养2 天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1%接种量接入含150mL种子培养基的500mL 三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5%接种 量转入含发酵培养基的发酵罐中，发酵罐温度30°C，通气量40L/min，搅拌转速400rpm，溶 氧量60%。当还原糖浓度低于10g/L时，通过果葡糖浆分批补料使培养基还原糖浓度达到 80g/L，发酵6天停止，得到裂殖壶菌YLH70发酵液。
[0060] 种子培养基组分见实施例8 ;发酵培养基组成：酵母粉20g/L，海盐20g/L，硫胺素 0· 05mg/L，钴胺素0· 004mg/L，七水硫酸铁7mg/L，五水硫酸铜I. 5mg/L，七水硫酸锌I. 5mg/ L，一水硫酸锰0. 5mg/L，添加果葡糖浆使培养基还原糖浓度为60g/L，溶剂为水，使用质量 浓度40% NaOH水溶液调pH至6. 0,121 °C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0061] 生物量、油脂和DHA的分析见实施例5,菌体生物量是70. 51g/L，油脂占细胞干重 的 43. 6%，DHA 产量可达 14. 28g/L。
【权利要求】
1. 裂殖壶菌（Aurantiochytrium sp. )YLH70,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编 号CCTCC NO :M2014215,保藏日期为2014年5月21日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮 编 430072。
2. -种权利要求1所述裂殖壶菌YLH70在合成二十二碳六烯酸中的应用。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将裂殖壶菌YLH70接种至以 菊芋水解液或果葡糖浆为唯一碳源的发酵培养基中，在20-32°C、通气量20-100L/min、搅 拌速度200-600rpm、溶氧量10-60%的条件下，培养时间2-6天，获得发酵液；将发酵液离 心，取沉淀，获得含二十二碳六烯酸的菌体，从菌体分离提取获得二十二碳六烯酸；所述菊 芋水解液制备方法为：将新鲜菊芋清洗、切片、干燥、粉碎制成菊芋粉末，再将菊芋粉末于硫 酸水溶液中，60-100°C提取30-300min，过滤，取滤液调节pH值至4. 0-7. 0后添加菊糖酶、果 胶酶和纤维素酶，再在30-60°C下水解5-48h，过滤，取滤液即为菊芋水解液，所述硫酸水溶 液的体积用量以菊芋粉重量计为l_15mL/g。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成为：酵母粉5-30g/L，海 盐5-30g/L，硫胺素0? 01-0. lmg/L，钴胺素0? 001-0. 01mg/L，七水硫酸铁l-10mg/L，五水硫 酸铜0. 5-5mg/L，七水硫酸锌0. 5-5mg/L，一水硫酸猛0. 1-lmg/L，添加菊芋水解液或果葡糖 浆使发酵培养基总还原糖浓度达到40-100g/L，溶剂为水，pH值5. 0-7. 0。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述菊芋水解液制备方法为：将新鲜菊芋 清洗、切片后在40-80°C烘箱中烘干，粉碎过60目筛，获得菊芋粉；将菊芋粉与体积浓度 1-10%的硫酸水溶液混合，在60-100°C反应30-300min，调节pH至4. 0-7. 0,添加菊糖酶、果 胶酶和纤维素酶，在30-60°C下水解5-48h，过滤，滤液即为菊芋水解液；所述硫酸水溶液的 体积用量以菊芋粉重量计为l_5mL/g，所述菊糖酶的用量以菊芋粉重量计为5-80U/g，果胶 酶的用量以菊芋粉重量计为〇. 5-10U/g，纤维素酶的用量以菊芋粉重量计为10-80U/g。
6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于添加菊芋水解液或果葡糖浆使培养基总还原 糖浓度达到60-100g/L。
7. 如权利要求4所述的应用，其特征在于发酵培养基组成为：酵母粉20g/L，海盐20g/ L，硫胺素0? lmg/L，钴胺素0? 004-0. 005mg/L，七水硫酸铁5-7mg/L，五水硫酸铜1. 5mg/L，七 水硫酸锌1. 5mg/L，一水硫酸猛0. 5mg/L，添加菊芋水解液或果葡糖衆使培养基总还原糖浓 度达到60-100g/L，溶剂为水，使用体积浓度40%的NaOH水溶液调pH至6. 0-7. 0。
8. 如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养条件为：在25-30 °C，通气量 40-100171^11，搅拌速度200-600印111，溶氧量40-60%的条件下，培养时间4-6天，获得发酵 液。
9. 如权利要求3所述的应用，其特征在于裂殖壶菌YLH70在发酵培养前先进行扩大 培养，所述扩大培养的方法为：将裂殖壶菌YLH70转接到海水平板上，28°C倒置静止培养3 天，得到单菌落；将单菌落接入含50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28°C、200rpm震荡培 养2天，得一级种子液；将一级种子液以体积浓度1 %的接种量接入含150mL种子培养基的 500mL三角瓶中，28°C，200rpm震荡培养2天，得二级种子液；将二级种子液以体积浓度5% 的接种量转入发酵培养基进行发酵培养；所述海水平板终浓度组成为：葡萄糖20g/L，酵母 粉l〇g/L，蛋白胨5g/L，海盐20g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH值为6. 0 ;所述种子培养基终 浓度组成为：酵母粉l〇g/L，海盐20g/L，添加菊芋水解液或果葡萄糖浆使培养基还原糖浓 度为40g/L，溶剂为水，pH值6. 0。
【文档编号】C12R1/645GK104498371SQ201410854830
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】于欣君, 汪钊, 郑建永, 章银军 申请人:浙江工业大学