用于中华鲟亲子鉴定的ssr荧光标记引物及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用，本发明成功筛选并合成10对荧光标记微卫星引物，该引物可以用于建立中华鲟亲子鉴定技术，并且公开了所使用的亲子鉴定的试剂盒。将所合成的不同荧光颜色的PCR产物混合后测定等位基因，进行中华鲟亲子鉴定分析。本发明所述鉴定方法操作简单、快捷、费用低廉，具有高效、经济、简便易行等特点，可以在中华鲟种质鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用，并可对人工增殖放流效果进行评估。
【专利说明】用于中华鲟亲子鉴定的SSR荧光标记引物及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖领域中的水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于中华舞亲子 鉴定的SSR荧光标记引物及应用。
【背景技术】
[0002] 中华舞（Acipenser sinensis)，隶属于舞形目，舞科，舞属，是一种在海洋中生长， 淡水中繁殖的大型海河洄游性原始古鱼类，至今存活已有1.4亿年历史。该物种主要分布 在长江和珠江水系。目前珠江水系的中华舞已基本绝迹。葛洲坝修建后，阻断了中华舞的 繁殖洄游通道，再加上过度捕捞，水域污染，生境退化，长江中华舞资源量也严重下降。2010 年，中华舞被列入濒危物种保护红皮书，是国家一级保护动物。
[0003] 微卫星 DNA (microsatellite)，又称为简单重复序列（Simple Sequence R印eats, SSR)，是指一类重复单位在2?6个碱基的重复序列。微卫星序列作为分子标记 有诸多优点：在真核基因组中分布广泛、等位基因多、杂合度高；扩增片段短、扩增率高；灵 敏度比传统的D NA指纹高得多，由于其结果可靠，方法简单，省时省力，在亲子鉴定和遗传 多样性研宄中微卫星标记技术正在逐步取代其他分子标记技术。目前国内外的科研工作者 已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠及几个植物等物种的染色体遗传图谱，并将微卫 星标记广泛应于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、繁殖育种以及进化研宄 等领域。
[0004] 目前，还没有将微卫星分子标记应用到中华舞的亲子鉴定和遗传管理的报道。本 发明旨在利用微卫星荧光标记建立中华舞亲子鉴定技术，为中华舞养殖场建立中华舞家系 谱系提供依据，以期合理的指导中华舞人工繁殖。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了用于中华舞亲子鉴定的SSR荧光标记引物，该引物可以 用于中华舞亲子鉴定。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了用于中华舞亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应 用。包括利用该引物制备成用于中华舞亲子鉴定的试剂盒，或利用该引物对中华舞进行亲 子鉴定，或利用其进行种质鉴定和家系管理。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0008] 用于中华舞亲子鉴定的SSR荧光标记引物，具体如下：
[0009] Asi-75067F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT
[0010] Asi-67648F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC
[0011] As i-67123F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R:CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG
[0012] Asi-73843F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC
[0013] As i-72040F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ； R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT
[0014] Asi-70421F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R:TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC
[0015] Asi-56700F: CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R: TGCAAAAAGGAATTGGAATCG
[0016] Asi-65194F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC
[0017] Asi-77057F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT
[0018] Asi-66034F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG ；
[0019] 以上分子标记引物的正向引物标记常用的荧光染料，包括FAM、HEX、TAMRA、ROX 等。用于中华舞亲子鉴定的SSR荧光标记引物的应用，包括制备中华舞亲子鉴定试剂盒，或 利用该引物进行中华舞的亲子鉴定。
[0020] 中华舞亲子鉴定方法包括：
[0021] 提取待鉴定样品DNA，使用本发明开发的10对SSR引物进行扩增。使用常规软件 统计等位基因数（Na)、期望杂合度（He)、排除概率（PE)以及累积排除概率（CPE)。
[0022] 本发明提供的中华舞亲子鉴定试剂盒，其试剂盒包含10对中华舞微卫星标记引 物，以及10XPCR缓冲液，MgCl 2, dNTPs，rTaq DNA聚合酶和双蒸水。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024] 1)本发明提供的SSR分子标记引物，可用于中华舞种质鉴定和家系管理，从而合 理的指导中华舞人工繁殖，保护长江中华舞的遗传多样性。对中华舞进行种质鉴定和家系 管理，指导人工繁殖，保护长江中华舞的遗传结构。
[0025] 2)本发明采用合成不同的微卫星荧光引物，进行PCR扩增，将多个PCR产物混合测 定基因型数据，从而达到在一个测序反应中得到多个基因型数据进行亲子鉴定，这样大大 减少了测序所花的时间和费用。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为引物Asi-75067测序图。
[0027] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0028] 图2为引物Asi-67648测序图
[0029] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0030] 图3为引物Asi-67123测序图
[0031] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0032] 图4为引物Asi-73843测序图
[0033] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0034] 图5为引物Asi-72040测序图
[0035] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0036] 图6为引物Asi-70421测序图
[0037] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0038] 图7为引物Asi-56700测序图
[0039] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0040] 图8为引物Asi-65194测序图
[0041] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0042] 图9为引物Asi-77057测序图
[0043] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
[0044] 图10为引物Asi-66034测序图
[0045] 从左至右依次为亲本CS-I，非亲本CS-6,子代1。
【具体实施方式】
[0046] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
[0047] 实施例1 :
[0048] 中华舞亲子鉴定微卫星标记的筛选：
[0049] 1)采用经典的高盐法提取宜昌22个野生中华舞DNA，稀释至IOOng/μ L备用。
[0050] 2)将通过Primer Premier 5. 0设计的165对微卫星标记合成非焚光标记引物， 以步骤1)中的DNA为模板，以如下PCR反应条件扩增：95°C预变性5min ;95°C变性30s，最 适退火温度下退火30s，72°C延伸lmin，共30个循环；之后72°C延伸10min，4°C保存。利 用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行初步筛选分离，获得了 24对多态性高并且能稳定扩增的 微卫星标记。
[0051] 3)将筛选出的中华舞多态引物继续以步骤1)提取的DNA为模板，进行PCR扩增后 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用软件ATetra 1.2计算各微卫星的等位基因数（Na)，期望杂 合度（He)，Shannon-Wiener多样性指数（SW)，筛选出10对微卫星引物特征如表1 :
[0052] 表110对中华舞微卫星标记特征
[0053]
【权利要求】
1. 用于中华舞亲子鉴定的SSR荧光标记引物，包括： Asi-75067 F:AGAGTTCTCGAAGCGGAAACAG ；R: CTGGTTCAAACTGGGAGCGAT Asi-67648 F:TCCGGTACTGGAAACCCTTG ；R:ATTCGCCTGGAAGAGCACAC Asi-67123 F:AGCTAACAGCAGTGCATGGTATTT ；R: CTTGAGATAAAAGGCGCTGTAGAG Asi-73843 F:GGTGTTTGAAAGACAGCGAGAA ；R:TTCCTCCAGGACAGAGTTTGC Asi-72040 F:AGCAGAGTCCACATCCCCCT ；R:GAGTGTCGCTCGAAAGCCCT Asi-70421 F:TGCCACAAATAAGATGCAGGAG ；R: TTTTGCTTTGGAAACTGTACTGC Asi-56700 F:CAACCTCTTCACTACCGCAAAC ；R:TGCAAAAAGGAATTGGAATCG Asi-65194 F:TACAAAATCGGCAGAAAGGCT ；R:GCAGGCATGATGAGAATAGGC Asi-77057 F:GGGTCCCGCACAGTTTAAAG ；R:GACGGCAAGGCAAGATAGGT Asi-66034 F:CCTACGCCAAGCTCAACCAG ；R:ACCGCAGAGTCACGGAGTTG〇
2. 权利要求1所述引物在中华舞亲子鉴定中的应用。
3. 权利要求1所述引物在制备中华舞亲子鉴定试剂盒中的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，所述的试剂盒包含： 10XPCR Buffer，MgCl2, dNTPs，10 对微卫星标记引物，rTaq Enzyme，ddH20〇
【文档编号】C12Q1/68GK104498613SQ201410854788
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】张书环, 辛苗苗, 危起伟 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所