一种解淀粉芽孢杆菌q-426及其脂肽的分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法，属于微生物代谢产物技术领域。
【背景技术】
[0002]解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，具有较强的次级代谢产物生产能力，可以产生多种具有生物活性的代谢产物，脂肽是其中一种重要的代谢产物，是由短肽和脂肪酸链组成的两性分子:多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学结构，脂肽物质具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学活性，并且具有耐热、耐酸、对蛋白酶稳定、低毒、低抗药性等优点。
[0003]脂肽除了具有抑菌活性外，还是一种生物表面活性剂，具有天然、高效及低毒的优势，在食品、医药、采油、化妆品及环境治理领域具有广泛的应用前景。目前已从微生物发酵产物中发现十多种脂肽类化合物，包括芬养素(fengycins)、表面活性素(surfactins)、达托霉素(daptomycins)、芽孢菌霉素(bacillomycins)、抗霉枯草菌素(mycosubtilins)、棘白霉素(echinocandins)、制磷脂菌素(plipstatins)和伊枯草菌素(iturins)等。现有技术中，解淀粉芽孢杆菌代谢产物单一，抗菌活性低，抗肿瘤活性低。
[0004]工业发酵生产中的后提取和产品的精制过程是保证目标代谢物达到一定纯度并投入市场的一个重要环节，下游分离纯化过程的成本约占整个发酵生产成本的三分之二以上。因此，分离纯化过程无疑是保证产品质量、决定其经济效益的关键所在。
[0005]脂肽的分离纯化主要是依据其理化性质，根据脂肽的理化性质的不同，对其粗提物通过酸沉淀、萃取、柱层析、反向高效液相色谱制备等手段进行分离纯化。利用传统的沉淀法得到的脂肽产品收率和纯度较低，单一组分纯化困难，不能满足实际应用的要求，而有机溶剂萃取法需要使用大量的有毒化学试剂如二氯甲烷、氯仿等，使产品中残留少量的有毒物，在实际应用中存在安全隐患，同时有机溶剂的加入会造成脂肽的生物活性部分丧失。近年来，根据脂肽物质的结构特点，逐渐发展了超滤、吸附法、泡沫分离法、色谱法和液膜分离法等新型分离技术，并出现了这些相关技术的组合应用，从而达到使分离纯化过程更加简单和具有针对性。
[0006]总体来说，对于脂肽的分离纯化，大多还只停留在实验室水平上的粗提，纯化方法和手段大体上是酸沉和大孔吸附树脂层析的简单组合，不能同时对多种脂肽组分进行分离。
【发明内容】
[0007]为了解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌Q-426(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0008]本发明的另一个目的是提供用于所述解淀粉芽孢杆菌Q-426(BacilluSamyloliquefaciens)脂肽的分离方法。
[0009]本发明的技术方案如下:
[0010]一种解淀粉芽孢杆菌Q-426，其保藏编号为CCTCC N0.M 2010237。
[0011]所述的解淀粉芽孢杆菌是发明人在辽宁省大连市有堆肥中分离得到的，经传统和分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
[0012]所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426已于2010年9月17日提交保藏，具体保藏信息如下:
[0013]保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心CCTCC ；
[0014]保藏单位地址:中国武汉武汉大学；
[0015]保藏日期:2010年9月17日；
[0016]保藏编号:CCTCCN0.M 2010237ο
[0017]所述的解淀粉芽孢杆菌Q-426 (Bacillus amyloliquefaciens)的形态特征为:菌体呈短杆状，具有运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，Gram染色阳性。在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。
[0018]用于所述解淀粉芽孢杆菌Q-426脂肽的分离方法，包括如下步骤:(I)发酵培养:解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液；
[0019](2)酸沉淀:发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0-3.0进行酸沉淀，离心得沉淀；
[0020](3)清洗:使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀；
[0021](4)抽提:使用100wt%甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀，离心留上清液；
[0022](5)浓缩:将步骤(4)所得上清液浓缩，得粗提样I ;
[0023](6)吸附:向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样I，用甲50wt%醇溶液洗脱；将流出液蒸发去除甲醇，调PH至2.0-3.0,离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解，得粗提样II ;
[0024](7)吸附与解吸:向色谱层析树脂中加入粗提样II，静态吸附7-10h ;将吸附粗提样II的色谱层析树脂进行装柱，用40-60被％甲醇溶液洗脱后；再用80-100被％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样III ;
[0025](8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，从而实现脂肽的分离。
[0026]进一步的，所述的分离方法包括如下步骤:
[0027](I)发酵培养:解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液；
[0028](2)酸沉淀:发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0进行酸沉淀，离心得沉淀；
[0029](3)清洗:使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀；
[0030](4)抽提:使用100wt%甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀，离心留上清液；
[0031](5)浓缩:将步骤(4)所得上清液于42°C蒸发浓缩，得粗提样I ;
[0032](6)吸附:向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗树脂；将流出液蒸发去除甲醇，调pH至2.0,离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解，得粗提样II ;
[0033](7)吸附与解吸:向色谱层析树脂中加入粗提样II，置于4°C，lOOrpm静态吸附8h ；将吸附了粗提样II的色谱层析树脂进行装柱，用50wt%甲醇溶液以6BV/h的流速洗脱；再用90wt%甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样III ;
[0034](8)半制备型高效液相色谱仪收集:将粗提样III使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，色谱柱为C18，检测波长为220nm，从而实现脂肽的分离。
[0035]本发明的分离方法以解淀粉芽孢杆菌的发酵液为样品，通过酸沉淀、甲醇抽提、双树脂联合纯化，半制备型高效液相色谱分离，构建了一套多种脂肽组分同步分离纯化的方法，该方法较以前的活性炭吸附法、大孔树脂吸附法及柱层析法有着明显的优点，能够获得单一组分，且纯度、收率均较高，纯化所需时间明显缩短。
[0036]本发明的有益效果如下:
[0037](1)本发明提供的解淀粉芽孢杆菌Q-426，易培养，对营养要求不高，在很宽的温度及pH值范围内均能很好地生长，具有广谱的抗真菌活性，对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用；
[0038](2)本发明提供的分离方法，能够同时对多种脂肽组分进行分离，终产品的纯度尚;
[0039](3)本发明提供的分离方法具有纯化产率高、分离周期短、工艺工序简便易学，操作性控制性强、环境更为友好等优势；
[0040](4)本发明提供的分离方法，只涉及甲醇一种有机溶剂，大大减少了环境污染，浓缩后的甲醇因其为单一溶剂还可回收再利用，提高了溶剂利用率。
【附图说明】
[0041]图1为粗提样I的尚效液相检测图；
[0042]图2为粗提样III的尚效液相检测图；
[0043]图3为分离纯化的脂肽a高效液相检测图；
[0044]图4为分离纯化的脂肽b高效液相检测图；
[0045]图5为分离纯化的脂肽c高效液相检测图；
[0046]图6为分离纯化的脂肽d高效液相检测图；
[0047]图7为分离纯化的脂肽e高效液相检测图；
[0048]图8为分离纯化的脂肽f高效液相检测图；
[0049]图9为分离纯化的脂肽g高效液相检测图。
【具体实施方式】
[0050]下面通过实施例对本发明做详细描述，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中如无特殊说明，所采用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂、仪器等均可从生物或化学公司购买，作为优选，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)Q-426来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC N0.Μ 2010237);旋转蒸发仪:BUCHI R-200，购于瑞士BUCHI ;阳离子交换树脂:HD-8，购于上海华震科技有限公司；色谱层析树脂:HZ-20ss，购于上海华震科技有限公司；半制备型高效液相:M8307AA，购于美国安捷伦科技公司。
[0051]实施例通过以下步骤获得发酵液:
[0052](I)解淀粉芽孢杆菌Q-426的活化:将解淀粉芽孢杆菌划板接种于20mL牛肉膏蛋白胨固体培养基中，于37 °C恒温培养箱中培养过夜；
[0053](2)解淀粉芽孢杆菌Q-426的一级种子发酵:将步骤(I)中牛肉膏蛋白胨固体培养基中长出的单菌落接种于20mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 °C，200rpm摇床培养过夜，得一级种子发酵液；
[0054](3)发酵培养:取步骤(2)中培养的一级种子发酵液1mL接种于IL的发酵培养基中，30°C，180rpm摇床培养72h，得发酵液；1L发酵培养基的组分为:胰蛋白胨:12.4g，葡萄糖:20g，氯化钠:5g，K2HPO4.3H20:1.5g，MgCl2.6H20:1.22g，MnSO4.H2O:0.04g，FeSO4.7H20:1.67go
[0055]实施例1
[0056](I)将中国典型培养物保藏中心(CCTCC N0.M 2010237)的解淀粉芽孢杆菌Q-426依次经过活化、一级种子发酵、发酵培养得发酵液；
[0057](2)酸沉淀:将发酵液10mL离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.5进行酸沉淀，离心(6000rpm，15min)去除上清液得沉淀；
[0058](3)清洗:使用20mL pH为1.8的超纯水清洗步骤⑴所得沉淀，清洗2次；
[0059](4)抽提:使用40mL 100wt%甲醇重悬步骤⑵清洗后的沉淀，摇床震荡3h，离心(12000rpm,5min)留上清液，将沉淀以100wt%甲醇重复震荡3次，合并3次抽提后离心的上清液；
[0060](5)浓缩:将步骤(3)所得上清液使用旋转蒸发仪浓缩至10mL，温度为42°C，得粗提样I，置于4°C保存；
[0061](6)阳离子交换树脂吸附杂质:向10mLHD-8阳离子交换树脂的层析柱中加入500 μ L的粗提样I，用50wt%的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗层析柱；冲洗过程中，当层析柱流出端出现白色浑浊状流出液时开始收集，当流出液变透明时停止收集与冲洗；将收集的白色浑浊流出液于42 V旋转蒸发仪中去除甲醇；取出旋转蒸发仪中的浓缩液，调pH至
2.5，离心(12000rpm，5min)去除上清液留沉淀，将沉淀用500 μ