一种合成桑黄高活性黄酮类化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵工程领域，设及一种高效合成桑黄活性黄酬类化合物的液体 发酵方法。
【背景技术】
[0002] 桑黄（Phellinus igniarius)，属于担子菌亚口（Basidiomycota)，层菌纲 (Hymenomycetes)，多孔菌目（Polyporales)，多孔菌科巧ymenochatetacae)，针层孔菌属 (化ellinus)的名贵药用真菌，又称火木层孔菌(P. igniarius)。桑黄是一种传统的中药，味 微苦，能利五脏、软坚、排毒、止血、活血和胃止泻，民间常用W治疗淋病、崩漏带下、疮窟积 聚、疲软、脾虚泄泻等。最新研究证明，桑黄具有抗氧化，抗菌消炎，抗肿瘤等一系列药理活 性，而桑黄中的活性成分主要为黄酬类化合物和多糖。其中黄酬类化合物具有抗氧化作用， 抗肿瘤，降血糖，免疫调节等作用。然而由于受到各种环境条件的限制，桑黄在自然界中形 成的子实体稀少，从其子实体中提取黄酬类化合物，产率低，活性不高，而且非常困难，因 此，通过生物工程方法高效合成高活性和高产量的黄酬类化合物对利用和开发W桑黄合成 黄酬类物质的利用非常重要。
[0003] 刘凡等人公开了一种提高桑黄菌丝体黄酬产量的液体发酵方法（申请公布号为 CN103695316A)，产量可达到0.6g/L，朱虎等人公开了一种液固两相培养桑黄黄酬的工艺 (申请公布号为CN103627728A)，得到黄酬的最高产量为2.174g/L。高兴喜等人利用真菌诱 导子来提高桑黄液体发酵中黄酬产量（申请公布号为CN101702984A)，得到黄酬的最高产量 是0.34g/L，目前，在国内也报道了许多对桑黄发酵培养基优化的文献，赵子高等人通过优 化后的培养基得到黄酬的产量为0.128056g/L，许谦等人通过优化后的培养基得到黄酬的 产量为0.21235g/L，运些都为提高桑黄黄酬类化合物产量提供了方法和发酵培养基，但是 他们的产量都很低，也都没有在合成过程中确保黄酬类化合物的生物活性。使用本发明中 的配方合成此类活性化合物，可得到高达5.9-6.5g/L的黄酬类化合物，且抗氧化活性为 5.1-6.7mmol/L，运从产量上远远高于上述专利或文献所报道或公示方法的数值，而且第一 次在合成过程中确保了合成此类化合物的生物活性，主要是因为在本配方优化研究中，除 了考虑单因素对桑黄合成黄酬类化合物产率的影响外，还从满足桑黄合成高产率和高活性 黄酬类化合物的角度出发，添加了香豆素等对确保合成过程中活性基团形成的培养基成 分，并从同时影响桑黄合成黄酬类化合物产率和生物活性的角度考虑了培养基成分之间的 交互作用，形成了同时提高桑黄黄酬类化合物的产率和生物活性的培养基条件，运是目前 报道的文献或专利中所没有的。
[0004] 虽然现在有许多利用真菌或者植物细胞合成黄酬类化合物的技术体系，但是它们 都存在W下几点缺陷：
[0005] 1、在合成过程中只关注黄酬类化合物的产量，而忽略了其生物活性的形成问题， 运不利于得到高活性的黄酬类化合物。
[0006] 2、目前报道的培养基配方中的成分较为复杂，大多W天然产物为碳源和氮源，运 使得生产过程的质量和活性存在明显批次差异，不利于黄酬类化合物的稳定合成。
[0007] 3、运些方法最终得到的黄酬类化合物产量都不高，其生物活性没有保证。
[0008] 因此，我们需要寻找一种高效合成活性黄酬类化合物的方法，本发明则通过科学 统计方法-响应面优化研究解决了桑黄发酵培养基中的上述问题。不仅合成过程操作简单， 成本低廉，还能在生产水平规模上验证可W高产量合成具备高活性的黄酬类化合物;实验 室已经证明该黄酬类化合物具有很明显的降血糖、抗氧化、抗衰老和降尿酸作用，是制备此 类保健类饮料和食品、膳食补充剂、食品添加剂W及相关药物的重要生产原料。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的在于克服现有技术所存在的缺陷，提供了一种操作简便，成本低廉， 能在生产水平高产量合成具备高活性的黄酬类化合物的方法。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案由下述步骤组成：
[0011] (1)-级种子的培养
[0012] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量 是每100ml的种子培养基中接入4~5块大小为5mmX 5mm的菌块，培养溫度为27~30°C，转速 为150~18化/min,培养时间为7~9天；
[001引上述的1L种子培养基中：葡萄糖为15.0~22.0旨、±豆为150.0~220.0 g、KH2P04为 0.5~2.5g、MgS04为0.2~0.5g，加水至1L，该种子培养基的pH为6.5;
[0014] (2)二级种子的培养
[0015] 将步骤（1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量 为5~15(V/V) %，培养溫度为27~30°C，转速为150~18化/min,培养时间为7~9天，得到培 养的二级种子；
[0016] (3)发酵培养
[0017]将步骤(2)的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为5~15(V/V)%，培养 溫度为27~30°C，转速为150~18化/min,培养4~5天向发酵培养基中加入D-101大孔树脂， 继续培养3~4天；
[0018] 1L发酵培养基中：葡萄糖为15.0~22. Og、蛋白腺为2.0~7. Og、香豆素为0.02~ 0.06旨、苯丙氨酸为0.2~0.6旨、吐溫-80为1.0~4.0旨、肉桂酸0.05~0.5旨、]\^504为1.0~ 5.0g、K出P〇4为0.5~3. Og，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5;
[0019] (4)提取桑黄活性黄酬类化合物
[0020] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵 培养基中的黄酬类化合物吸附出来，用80 %的甲醇洗脱出来，得到桑黄活性黄酬类化合物。
[0021] 上述步骤（1)中的桑黄菌种的名称为Phellinus SP.P0988,保藏号为CCTCC NO: M2012080，保藏单位是中国典型培养物保藏中屯、，地址是中国武汉武汉大学，邮编430012， 保藏日期是2012年3月14日。
[0022] 上述步骤(3)的优选配方是：1L发酵培养基中葡萄糖为18.0~20.Og、蛋白腺为3.0 ~5.0g、香豆素为0.02~0.04g、苯丙氨酸为0.25~0.5g、肉桂酸为0.05~0.3g、MgS〇4为1.0 ~3.0g、K出P〇4为0.5~2. Og、吐溫-80为1.0~3. Og，加水至1L，该发酵培养基的pH为6.5。
[0023] 本发明合成桑黄高活性黄酬类化合物的方法，主要是在对桑黄发酵合成的培养基 进行了优化，其技术优势如下所示：
[0024] (1)通过响应面设计优化方法研究了影响桑黄合成黄酬类化合物产率和生物活性 的培养基成分W及其相互之间存在的交互作用。在统计学分析基础上确定了显著影响桑黄 合成黄酬类化合物产率和活性的重要培养基成分香豆素、苯丙氨酸和吐溫-80之间的交互 作用和主体影响，从而确定了运些培养基成分最有利于桑黄合成黄酬类化合物产率和活性 形成的浓度范围。运在黄酬类化合物的合成上是从来没有被公示或报道过的。
[0025] (2)通过在其发酵培养基中加入了香豆素、苯丙氨酸等形成黄酬类化合物的骨架 前体物质，减少了桑黄合成该类物质的代谢过程，缩短了生产周期，促进了桑黄合成过程 中的高活性形成过程。
[0026] (3)本发明还加入了肉桂酸，作为次级代谢产物的刺激物，促进黄酬的合成和活性 形成过程。
[0027] (4)本方法操作简便，成本低廉，可获得高产量高活性的黄酬类化合物，在食品及 医药技术领域有广泛应用，因此，本发明对于工业化生产黄酬类化合物，具有重要意义
【具体实施方式】
[0028] W下将结合实验作出进一步说明。
[00巧]实施例1
[0030] 本实施例合成桑黄高活性黄酬类化合物的方法由W下步骤组成：
[0031] (1)-级种子培养
[0032] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量 是每100ml的种子培养基中接入4块大小为5mmX 5mm的菌块，培养溫度28°C，转速16化/min， 培养时间9天。
[0033] 桑黄菌种是按照常规方法活化，具体是将桑黄菌种接种在PDA培养基上，25~30 °C，有氧避光培养至桑黄菌种长满斜面;该桑黄菌种的名称为化el 1 inus SP.P0988，保藏单 位为中国典型培养物保藏中屯、，地址是中国武汉武汉大学，邮编430012,保藏编号为CCTCC N0:M 2012080,保藏日期是2012年3月14日。
[0034] 上述的化种子培养基中：葡萄糖20.0邑、±豆200.0邑、1(出口04 1邑、1邑504 0.5邑，余量 为水，该种子培养基的pH为6.5。
[0035] (2)二级种子培养
[0036] 将步骤(1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量 为10(V/V)%，即每lOOmL的种子培养基中接种lOmL的一级种子，培养溫度为28°C，转速为 16化/min,培养时间为9天，得到的二级种子。
[0037] (3)发酵培养
[0038] 将步骤(2)中的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为10(V/V) %，即每 1 OOmL的发酵培养基中接种lOmL的二级种子，培养溫度为28°C，转速为16化/min，培养4天， 向发酵培养基中加入D-101大孔树脂进行吸附，继续培养4天；
[0039] 上述的1L发酵培养基中：葡萄糖20.0g、蛋白腺4g、香豆素0.03g、苯丙氨酸0.35邑、 肉桂酸〇.1旨、1旨5〇4 1.5旨、皿2?〇4 1.0旨、吐溫-80 2.0旨，加水至化，该发酵培养基的抑为6.5。
[0040] (4)提取桑黄活性黄酬类化合物
[0041] 在步骤(3)的发酵培养完成后过滤出D-101大孔树脂，利用D-101大孔树脂将发酵 培养基中生成的黄酬类化合物吸附出来，用80%的甲醇洗脱出来，获得桑黄活性黄酬类化 合物，并测定出黄酬类化合物的含量为5.76g/L，总抗氧化活性为5.15mmol/L。
[0042] 实施例2
[0043] 本实施例合成桑黄高活性黄酬类化合物的方法由W下步骤组成：
[0044] (1)-级种子培养
[0045] 将斜面保藏的活化好的桑黄菌种接种到种子培养基中进行一级种子培养，接种量 是每100ml的种子培养基中接入5块大小为5mmX 5mm的菌块，培养溫度27 °C，转速18化/min， 培养时间8天；
[0046] 上述的化种子培养基中：葡萄糖18.0邑、±豆180.0邑、1(出口〇4 1邑、1邑5〇4〇.5邑，加水 至1L，该种子培养基的抑为6.5。
[0047] (2)二级种子培养
[0048] 将步骤（1)中的培养好的一级种子接到种子培养基中进行二级种子培养，接种量 为15(V/V)%，即每lOOmL的种子培养基中接种15mL的一级种子，培养溫度为27°C，转速为 18化/min，培养时间为8天，得到二级种子。
[0049] (3)发酵培养
[0050] 将步骤(2)中的培养好的二级种子接到发酵培养基中，接种量为15(V/V) %，即每 lOOmL的发酵培养基中接种15mL的二级种子，培养溫度为27 °C，转速为15化/min,培养5天， 向发酵培养基中加入D-101大孔树脂进行吸附，继续培养3天；
[0051] 上述的1L发酵培养基中：葡萄糖18.0g、蛋白腺3g、香豆素0.04g、苯丙氨酸0.4g、肉 桂酸0.3旨、1旨504 4.0旨、皿2?04 0.5旨、吐溫-80 1.0旨，加