专利名称：一种含有从桑黄中提取的活性物质的药物组合物、制备方法及其在制备药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物组合物、制备方法及其在制备药物中的应用，具体讲涉及一种含有从桑黄中提取的活性物质的药物组合物、制备方法及其在制备抗癌药物、免疫调节药物、降血压药物及降血糖药物中的应用。
背景技术：
桑黄作为中药材在中国早有记载，其子实体入药，味微苦，能利五脏，软坚，排毒，止血，活血；多用于和胃止泻，淋病，崩漏带下，脾虚泄泻等症。在韩国、日本和东南亚国家也作为汗方治疗肠胃病、淋巴疾病及各种癌症。日本最早对桑黄的抗肿瘤作用进行了研究，Ikekawa T，Nakanishi等人(Chem.Pharm.Bull.1995.43(12)2105-2108)在1968年进行的真菌抗肿瘤的研究中，对包括云芝Coriolus versicolor和桑黄等在内的担子纲真菌用肉瘤180对ICR小鼠进行了抗肿瘤实验，发现在11种担子纲真菌中，桑黄提取物对肿瘤的抑制率最强，达到96.7％，而且这种水萃取物对肉瘤180细胞不表现细胞毒性。韩国在80年代开始对桑黄进行正式研究并在菌种培养、分离纯化、成分分析、药效、药理作用及作用机制等方面取得了丰硕的成果，1984年，韩国制药公司成功取得桑黄菌丝体的培养许可；1993年韩国政府正式许可桑黄成为菌类抗癌药品。
国际专利申请WO0151070公开了通过分子筛法处理木层孔菌属菌类的热水或低级醇萃取物，收集分子量6,000-60,000部分的活性物质，该活性物质显示抗癌作用、免疫激活作用、抗氧化作用、降低血压和血糖作用等生理作用。但并未给出这种活性物质的物理化学性质，也未给出其药效学实验数据。
国际专利申请WO0160385公开了从裂蹄木层孔菌属(Phellinus linteus)提取的多糖PL用于治疗糖尿病的新用途。PL是对桑黄菌丝体培养物的热水萃取物进行了醇沉、二乙氨基乙基-纤维素柱层析和凝胶渗透柱层析的提纯(Chem.Pharm.Bull.，43(12)，2105-2108，1995)。用凝胶渗透HPLC法分析，发现其为含13.2％肽和82.5％糖的基本纯物质，其中6.8％的多糖为糖醛酸。凝胶色谱显示PL的分子量为153KD。PL含有7.0％阿拉伯糖，3.7％木糖，21.1％葡萄糖，24.1％半乳糖，44.2％甘露糖，同时含有以谷氨酸和天冬氨酸为主的十种氨基酸。此杂多糖对B淋巴细胞的激活浓度为3μg/ml，此化合物保持完整结构和其多糖部分对活性是至关重要的。PL具有增强免疫，抗肿瘤、抗病毒及抗氧化的作用是已知的(Journal of biochemistry and molecular biology34(2001)2144-149；Carcinogenesis 23(2002)71163-1169；Internationalimmunopharmacology 3(2003)91281-1292；Biotechnology Letters25(2003)242093-2096；Biotechnology Letters25(2003)2167-172；Biological&pharmaceuticalbulletin26(2003)101418-1423；Biological&pharmaceuticalbulletin26(2003)6823-831；)。但从桑黄菌丝体中提取的杂多糖药效活性有待提高。
发明内容
本发明提供一种药物组合物，含有从桑黄子实体中提取的活性物质及药学上可接受的载体，此活性物质具有抗肿瘤、抗病毒及增强免疫的活性。
本发明的另一目的是提供所述药物组合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述组合物在制备抗癌药物、免疫调节药物、降血压药物或降血糖药物中的应用。
本发明的药用组合物，所述组合物包含从桑黄中提取的活性物质以及药学上可接受的载体；所述活性物质是由分子量11～15千道尔顿的多糖PT1与分子量17～23千道尔顿的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黄是指针层孔菌Phellinus igniarius以及其同属的Phellinus vaninii；Pheliinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子实体。
本发明通过将从桑黄中提取的分子量11～15千道尔顿的多糖PT1和分子量17～23千道尔顿的蛋白多糖PT2按比例混合，配以药学上可接受的载体，成功的发明了一种抗肿瘤、抗病毒及增强免疫的药物组合物。
本发明的药用组合物，所述多糖PT1中按重量百分比计总多糖为94～98％，其中还原糖为5～10％，酸性多糖为20～25％；多糖PT1的主要组分为葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比为60-64∶1；痕量的氨基酸组成为天门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸。
本发明的药用组合物，所述多糖PT1红外吸收的最大波数为3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
本发明的药用组合物，所述蛋白多糖PT2中按重量百分比计总多糖为67～90％，其中酸性多糖为30～40％，还原糖含量为10～14％；蛋白多糖PT2中构成多糖的主要组分为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比为70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中氨基酸的组成为缬氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸。
本发明的药用组合物，所述蛋白多糖PT2红外吸收的最大波数为3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
本发明的药用组合物，所述活性物质与药学上可接受载体按制剂领域中的技术制成的口服制剂或非肠道给药制剂。
例如，本发明的药物组合物可以按常规制剂方法制备成胶囊剂，其中所述药学上可接受载体包括微晶纤维素、淀粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基淀粉钠、微粉硅胶或40CP-100CP乙基纤维素、硬醋酸钠等中的一种或几种。本发明胶囊剂的制备方法是取桑黄活性物质和所述药学上可接受载体分别研细过筛，混合均匀，装胶囊，或用粘合剂制成软材，筛滤制粒，置50-60℃条件下干燥，再筛滤整粒后加入润滑剂，混合均匀，装胶囊。
例如，本发明的药物组合物可以按常规制剂方法制备成颗粒剂，其中所述药学上可接受载体包括成型剂，可选用如β-环糊精、乳糖和糊精等中的至少一种，矫味剂可选用，如蔗糖、碳酸钠、椰子香精等中的至少一种，崩解剂可选用，如可溶性淀粉、羧甲基淀粉钠等中的一种；粘合剂可选用，如聚维酮K30或其它临床上可接受的结构类似物。本发明颗粒剂的制备方法为按配方量取主药与上述辅料混合后，喷雾干燥，干式制粒，整粒即得产品；或将原辅料混合按配方量加入粘合剂，制成软材，将上述软材经12目筛制粒，再于30-75℃干燥，12目筛整粒，将整粒好的颗粒加入已过80目筛的椰子香精混合均匀，分装即得颗粒剂。
例如，本发明的药物组合物可以按常规制剂方法制备成片剂，其中所述药学上可接受载体包括药用片剂的稀释剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂；其中稀释剂可选择微晶纤维素、淀粉、乳糖、糊精、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇等中的一种或多种。粘合剂可选择淀粉浆、PVP胶浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素和明胶浆等中的一种。崩解剂可选择淀粉、羧甲基淀粉钠、微粉硅胶等中的一种。润滑剂可选择滑石粉、硬脂酸镁等中的一种。本发明片剂的制备方法是取桑黄活性物质和稀释剂、崩解剂分别研细过筛，混合均匀，用粘合剂制成软材，筛滤制粒，置50-60℃条件下干燥，再筛滤整拉后加入润滑剂，混合均匀，压片。
例如，本发明的药物组合物可以按常规制剂方法制备成注射液，赋形剂为甘露醇、山梨醇、或低分子右旋糖酐等中的一种。抗氧剂为氮气、二氧化碳气、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸二钠等。本发明注射剂是通过下述方法实现的在洁净条件下，将活性物质与药学允许的赋性剂和抗氧剂按配方量充分混合均匀，加入适量的注射用水，加热搅拌使之完全溶解，粗滤，超滤得到无热源的澄清液，置于安瓿瓶或西林瓶中，按水针工艺或冻干工艺制作即得产品。
本发明药物组合物的制备方法，所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通过下述方法得到将桑黄子实体的水萃取物溶于pH为7.1-7.8的磷酸钠缓冲液中，上载所述磷酸钠缓冲液平衡的乙二氨基乙基纤维素柱，用所述磷酸盐缓冲液洗脱后，再用pH为7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化钠磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，最后用pH为7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化钠磷酸盐缓冲液洗脱，其中将对糖含量和蛋白含量的检测方法均呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只对糖含量检测方法呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述多糖PT1。
本发明的药物组合物的制备方法，所述得到的多糖PT1、蛋白多糖PT2再分别通过seveg法和/或凝胶渗透方法纯化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
本发明所述的活性物质更具体的制备方法是所述桑黄子实体的水萃取物以1∶1.5～8重量比溶于pH为7.7的磷酸钠缓冲液中，上载所述磷酸钠缓冲液平衡的4×60厘米的乙二氨基乙基纤维素柱，以流速5毫升/分钟先后用以下洗脱液洗脱(1)pH为7.7的磷酸钠缓冲液500毫升洗脱；(2)再用0.1-1.0M的氯化钠磷酸盐缓冲液溶液(pH为7.7)1000毫升进行梯度洗脱；(3)最后用1.0M的氯化钠磷酸盐缓冲液溶液(pH为7.7)500毫升洗脱；其中将对糖含量的检测方法和蛋白含量的检测方法均呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只对测糖含量的检测方法呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述多糖PT1。进一步通过seveg法除游离蛋白，也可再用凝胶柱G200去游离蛋白和其他杂质得到所述多糖PT1和蛋白多糖PT2；上述糖含量的检测方法是指苯酚-硫酸检测法，蛋白含量的检测方法为Folin酚试剂法或考马斯亮蓝法。
本发明的药物组合物的制备方法，所述桑黄子实体的水萃取物通过下述方法得到将桑黄子实体粉碎，过20～60目筛后用4～30倍体积的水在70～100℃的温度下回流萃取2～10小时，萃取液过滤后减压浓缩，加入乙醇沉淀，过滤得沉淀，沉淀用丙酮和乙醇先后洗涤，冷冻干燥。
本发明组合物在制备抗癌药物、免疫调节药物、降血压药物或降血糖药物中的应用。
桑黄子实体的水萃取物、多糖PT1和蛋白多糖PT2的分子量的测定和纯度研究采用凝胶渗透色谱，多糖分子量的测定都是以分子量已知的标准多糖在高效凝胶渗透色谱(HPGPC)系统中研究LgM与保留时间之间的线性关系从而确定所研究多糖的分子量，通过该色谱条件可获得多糖纯度的信息；活性多糖组合物、多糖PT1和蛋白多糖PT2中总糖含量采用硫酸苯酚法测定；酸性多糖含量采用硫酸咔唑法测定；还原糖含量采用DNS法测定；多糖PT1和蛋白多糖PT2中蛋白含量可采用Folin-酚试剂法、BCA法或Bradford法测定。
本发明的有意效果在于1.本发明从桑黄提取的活性物质中多糖PT1与蛋白多糖PT2按比例组合表现很好的协同作用，使本发明从桑黄提取的活性物质具有显著的抗肿瘤活性和增强免疫活性。
2.本发明从桑黄提取的活性物质工艺简单，产量高。
图1桑黄多糖PT1红外线吸收图谱图2桑黄多糖PT1H-NMR图谱图3桑黄多糖PT1C-NMR图谱图4桑黄蛋白多糖PT2红外线吸收图谱图5桑黄蛋白多糖PT2H-NMR图谱图6桑黄蛋白多糖PT2C-NMR图谱下面实施例对本发明进行更具体说明，并不是对本发明的具体限制。
实施例1一种制备桑黄中提取的活性物质的方法包括以下步骤i.桑黄子实体的水萃取物的制备方法将桑黄子实体400g粉碎，过60目筛后用3000ml水在90℃的温度下回流萃取8小时，过滤，固体残渣再重复上述提取过程3次后，合并滤液，减压浓缩至50ml体积，加入乙醇200ml，置4℃环境下放置24小时，过滤，固体用丙酮和乙醇先各30ml洗涤后，冷冻干燥，得28g；硫酸苯酚法测得多糖含量为65％。
ii.多糖PT1和蛋白多糖PT2的制备方法取桑黄子实体的水萃取物经醇沉后所得样品5g加15ml pH为7.7的磷酸钠(5m mol)缓冲液，溶液用DEAE-cellulose柱(4×60cm)层析进行初步分离。首先以缓冲液500ml作为洗脱液，再用0.1-1.0M的氯化钠磷酸盐缓冲液溶液(pH为7.7)1000ml作梯度洗脱液进行梯度洗脱，最后用1.0M的氯化钠-磷酸盐缓冲液溶液(pH为7.7)500毫升洗脱，其中将对测糖含量的苯酚-硫酸检测法和测蛋白含量的考马斯亮兰检测方法均呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只对苯酚硫酸法检测呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述多糖PT1。进一步通过seveg法除游离蛋白，冷冻干燥，得到粗品PT10.6g和PT21.7g。再通过凝胶渗透方法纯化PT1，选用Sephadex-G200(1.6×40cm)，上样粗品PT160mg，250mlNaCl溶液(20mmol)冲洗，流速0.2ml/min，去游离蛋白和其他杂质，自动收集仪分别收取各流分，冷冻干燥后得到所述多糖PT130mg；PT2无需通过此步纯化步骤；PT1和PT2总收率2.8％，占水萃取物的40％。
多糖PT1的物理化学性质(1)分子量11～15千道尔顿(2)糖含量总糖为95％，还原糖为7％，酸性多糖为22％(3)主要糖构成比葡萄糖∶甘露糖＝62∶1；(4)氨基酸组成天门冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、赖氨酸；(5)红外光谱见图1(6)1H-NMR图谱见图2(7)13C-NMR图谱见图3蛋白多糖PT2的物理化学性质(1)分子量17～23千道尔顿(2)糖含量总糖为69％，还原糖为12％，酸性多糖为37％(3)蛋白含量10％；(4)主要糖构成比葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖＝72∶1∶0.7；(5)氨基酸组成缬氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、甘氨酸；(6)红外光谱见图4
(7)1H-NMR图谱见图5(8)13C-NMR图谱见图6iii.PT1和PT2以1∶3重量比相混合。
实施例2制备桑黄中提取的活性物质的方法基本同实施例1，所不同之处在于所用测蛋白含量的检测方法为Folin酚试剂法。
实施例3一种含有从桑黄提取的活性物质的混合物制成的片剂，活性物质是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2制备方法如实施例1)，处方如下桑黄活性物质200g乳糖200g淀粉浆 适量羧甲基淀粉纳10g硬脂酸镁6g共制的1000片制备方法桑黄活性物质，乳糖，羧甲基淀粉钠，分别研细过60目筛，按上述处方称重、配料并混合均匀，在搅拌下，用淀粉浆制成软材，过18目筛制成湿颗粒并在60℃的温度下干燥4小时，再筛滤整粒后加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。
本发明的用法与用量口服，饭间服用；每日两次，每次两片。
实施例4一种药物组合物制成的抗癌的颗粒剂，活性物质是PT1和PT2按重量比1∶3的混合物(PT1和PT2制备方法如实施例1)，处方如下桑黄活性物质200g乳糖400g蔗糖1000g椰子香精30g
聚维酮K3030g共制的1000袋制备方法取桑黄活性提取物、乳糖、蔗糖、椰子香精、聚维酮K30，分别研细过60目筛，按处方量取主药与上述辅料混合后，喷雾干燥，干式制粒，整粒即得产品；或将原辅料混合按处方量加入粘合剂，制成软材，将上述软材经12目筛制粒，再于60℃干燥，12目筛整粒，将整粒好的颗粒加入已过80目筛的椰子香精混合均匀，分装即得颗粒剂。
本发明的用法与用量口服，饭间服用；每日两次，每次一袋。
实施例5一种药物组合物制成提高免疫的胶囊剂，活性物质是PT1、PT2重量比为1∶2.5的混合物(PT1和PT2制备方法如实施例1)，处方如下桑黄活性物质200g微晶纤维素 150g乳糖150g羧甲基淀粉钠30g2％羟丙基纤维素 适量硬脂酸镁6g共制的1000袋制备方法取桑黄活性物质、微晶纤维素、乳糖、羧甲基淀粉钠，别研细过60目筛，按处方量取主药与上述辅料，混合均匀，用黏合剂2％羟丙基纤维素制成软材，18目筛筛滤制粒，置60℃条件下干燥，整粒后加入硬脂酸镁，混合均匀，装胶囊。
本发明的用法与用量口服，饭间服用；每日两次，每次一粒。
实施例6一种药物组合物制成的治疗癌症的注射剂，活性物质是PT1、PT2重量比为1∶3的混合物(PT1和PT2制备方法如实施例1)，处方如下
桑黄活性物质200g甘油50g亚硫酸钠2g氯化钠 4g共制的1000支制备方法在洁净条件下，将活性物质与甘油、亚硫酸钠、氯化钠溶于注射用水，用0.2μm的微孔滤膜过滤，分装于2ml安剖瓶中，封口、灭菌，制成0.2g的产品。
本发明的用法与用量注射，每次一支。
实施例7小鼠体内抗肿瘤作用实验1实验材料及方法1.1动物瑞士种昆明远交系小鼠，雌性，由军事医学科学院实验动物中心提供，二级动物，合格证SCXK-(军)2002-001。选择健康状况良好、发育正常的3-4周龄、体重为17□22g的小鼠。每个剂量组小鼠混养在一个大的饲养缸中，自由摄食、饮水，饲料由军事医学科学院实验动物中心提供。动物房温度控制在25℃，相对湿度50-60％。
1.2药物桑黄多糖PT1桑黄蛋白多糖PT2桑黄中提取的活性物质(桑黄多糖PT1∶桑黄蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)注射用环磷酰胺(CTX)，购于解放军307医院，江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号苏卫药准字(1996)第403501号，生产日期2003年11月，临用前，准确称100mg，加入10ml生理盐水溶解混匀，按0.1ml/10g.bw腹腔注射给药，给药剂量100mg/kg.bw。
1.3小鼠肿瘤肝癌(H22)；肉瘤(S180)；肺癌(Lewis)
1.4实验方法1.4.1 H22和S180小鼠实体瘤模型选择接种传代后第7天健康状况较好的H22和S180腹水型瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，腹部皮肤用碘酊、酒精消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，无菌抽取乳白色腹水，置于放置在冰块上的无菌小烧杯内，加适量生理盐水稀释成1∶3的瘤组织悬液，使浓度为2×106个/ml活的癌细胞。立即接种于小鼠右前肢腋窝处皮下，每只接种细胞悬液0.2ml，制成局灶性实体瘤试验模型。
1.4.2 Lewis肺癌小鼠实体瘤模型选择接种后10天，肿瘤生长旺盛而动物健康状况较好的瘤源动物，颈椎脱臼，用碘酊、酒精消毒操作部位皮肤。切开皮肤、选择生长良好的重量大约1克左右的Lewis肺癌肿瘤，剔除包膜和坏死部分，选取数个完好的瘤块混合，放入含少许无菌生理盐水的无菌平皿内保存瘤块，将瘤块剪成2-3cm3的小块，置于玻璃匀浆器内，加入适量的生理盐水，按1∶5的比例配制成瘤细胞悬液。每只小鼠右前肢腋窝处皮下注射细胞悬液0.2ml，制成局灶性肿瘤模型。
1.4.3动物分组及给药方法小鼠接种24小时后，随机分组，每组10-15只动物，所述药物给药剂量定为500mg/kg.bw，按0.2ml/10g.bw灌胃给药；环磷酰胺组(阳性对照)100mg/kg.bw一次性腹腔注射给药；肿瘤模型对照组(阴性对照)，每天灌胃蒸馏水0.4ml。每天给药一次，连续10-13天。肿瘤对照组小鼠平均瘤重达1-2g时，停止给药。
1.4.4样本处理和观察方法于末次给药后24小时，各组小鼠称体重后，脱颈处死，剖取肿瘤称重。按照公式(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)×100％/对照组平均瘤重，求出抑瘤率，进行组间比较。所用小鼠均为雌性。
2结果列于表1表1.本发明从桑黄中提取的活性物质对小鼠肿瘤的抑制作用不同提取成分对肿瘤的抑制率(％)
表中数字为3次实验的平均数±标准差由表1可知，本发明从桑黄中提取的活性物质对小鼠肝癌H22、小鼠肉瘤S180以及小鼠肺癌Lewis具有一定的生长抑制作用。
实施例8本发明从桑黄中提取的活性物质对小鼠免疫功能的影响1实验材料1.1药物桑黄中提取的活性物质(桑黄多糖PT1∶桑黄蛋白多糖PT2＝1∶3，w/w)用培养液(RMPI1640)配成25mg/ml的母液，0.2μm滤器过滤除菌后，4℃保存。临用时用培养液配成所需浓度。
1.2阳性药脂多糖(LPS)，购自Sigma公司，具有多方面的免疫刺激作用。用培养液配成1mg/ml保存液，-20℃保存。临用取出，用培养液配成所需浓度。
1.3动物瑞士种昆明远交系小鼠，6-8周龄，♀，购自本院实验动物中心。
1.4细胞小鼠黑色素瘤B16细胞，引自医科院药物所。
2方法和结果
2.1巨噬细胞(MФ)对肿瘤细胞的细胞毒反应取小鼠腹腔巨噬细胞，2×105个/孔接种于U型底96孔组织培养板。分别加LPS1μg/ml，所述药物各组加入50μg、100μg、200μg、300μg、500μg、1000μg/ml，作用24h后，加小鼠黑色素瘤B16细胞5000个/孔共同孵育6h。以LDH释放法测巨噬细胞介导的细胞毒作用。细胞毒％＝(实验孔-MФ自然释放孔-B16自然释放孔)/(B16最大释放孔-B16自然释放孔)100，结果见表2。
表2桑黄粗提物诱导巨噬细胞对小鼠肿瘤细胞的细胞毒反应
从表2对细胞毒性的结果可以看到本发明从桑黄中提取的活性物质对肿瘤细胞有一定的抑制作用，最小有效剂量为100μg/ml。
2.2肿瘤坏死因子(TNF-α)的测定药物对MФ分泌肿瘤坏死因子-α的测定。小鼠MФ经粘附培养纯化后，以2×105个/孔接种于96孔板。药物处理24h后，吸取培养液上清，ELISA法测TNF-α，每个样品测两个孔。以吸光值对应于标准曲线的点计算其浓度，结果见表3。
表3.从桑黄中提取的活性物质对MФ分泌肿瘤坏死因子-α的测定
从表3的结果可以看到本发明从桑黄中提取的活性物质能促进小鼠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子，并有一定的剂量效应关系，实验中本发明从桑黄中提取的活性物质100μg/ml产生TNF是阴性对照组的4倍。
3小结初步的试验结果表明本发明从桑黄中提取的活性物质对小鼠有免疫调节作用，可促进巨噬细胞杀伤肿瘤细胞，并促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子。
权利要求
1.一种药用组合物，其特征在于所述组合物包含从桑黄中提取的活性物质以及药学上可接受的载体；所述活性物质是由分子量11～15千道尔顿的多糖PT1与分子量17～23千道尔顿的蛋白多糖PT2以1∶1～1∶4的重量比相混合，所述桑黄是指针层孔菌Phellinus igniarius以及其同属的Phellinus vaninii；Phellinusbaumii；Phellinus linteus；Phellinus hartigii；Phellinus pini真菌的子实体。
2.按照权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述多糖PT1中按重量百分比计总多糖为94～98％，其中还原糖为5～10％，酸性多糖为20～25％；多糖PT1的主要组分为葡萄糖和甘露糖，其中葡萄糖∶甘露糖重量比为60-64∶1；痕量的氨基酸组成为天门冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸和赖氨酸。
3.按照权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述多糖PT1红外吸收的最大波数为3410.2cm-1±50cm-1、2895.0cm-1±50cm-1、1635.3cm-1±50cm-1、1418.8cm-1±50cm-1、1374.7cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、894.4cm-1±50cm-1和579.8cm-1±50cm-1。
4.按照权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述蛋白多糖PT2中按重量百分比计总多糖为67～90％，其中酸性多糖为30～40％，还原糖含量为10～14％；蛋白多糖PT2中构成多糖的主要组分为葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，其中葡萄糖∶甘露糖∶鼠李糖重量比为70-73∶1∶0.5-0.8；蛋白多糖PT2中蛋白含量是10～33％，其中氨基酸的组成为缬氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸。
5.按照权利要求1所述的药用组合物，其特征在于所述蛋白多糖PT2红外吸收的最大波数为3388.4cm-1±50cm-1、2895.7cm-1±50cm-1、1612.1cm-1±50cm-1、1413.5cm-1±50cm-1、1298.3cm-1±50cm-1、1155.4cm-1±50cm-1、1073.6cm-1±50cm-1、896.8cm-1±50cm-1、627.7cm-1±50cm-1和585.2cm-1±50cm-1。
6.按照权利要求1、2、3、4或5所述的药用组合物，其特征在于所述活性物质与药学上可接受载体按制剂领域中的技术制成的口服制剂或非肠道给药制剂。
7.按照权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于所述多糖PT1和蛋白多糖PT2是通过下述方法得到将桑黄子实体的水萃取物溶于pH为7.1-7.8的磷酸钠缓冲液中，上载所述磷酸钠缓冲液平衡的乙二氨基乙基纤维素柱，用所述磷酸盐缓冲液洗脱后，再用pH为7.1-7.8的0.1～1.0M的氯化钠磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，最后用pH为7.1-7.8的0.9-1.1M的氯化钠磷酸盐缓冲液洗脱，其中将对糖含量和蛋白含量的检测方法均呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述蛋白多糖PT2；其中只对糖含量检测方法呈阳性的洗脱液合并，冷冻干燥，得到所述多糖PT1。
8.按照权利要求7所述的药物组合物的制备方法，其特征在于本发明的药物组合物的制备方法，所述得到多糖PT1、蛋白多糖PT2再分别通过seveg法和/或凝胶渗透方法纯化，得到精提的多糖PT1、蛋白多糖PT2。
9.按照权利要求1所述组合物在制备抗癌药物、免疫调节药物、降血压药物或降血糖药物中的应用。
全文摘要
一种含有从桑黄中提取的活性物质的药物组合物、制备方法及其在制备抗癌药物、免疫调节药物、降血压药物或降血糖药物中的应用。所述组合物包含从桑黄中提取的活性物质以及药学上可接受的载体；所述活性物质是由分子量11～15千道尔顿的多糖PT
文档编号A61P37/00GK101032532SQ20071009759
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者王洪权, 王毅民, 窦媛媛, 丁建新, 窦茜茜, 王京燕, 王海燕, 张敏, 郑成贵, 纪晓光, 何伟庭, 郑文俊 申请人:北京鸿华新康生物技术有限公司