桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用。该桑黄提取物的制备方法如下:（1）桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，合并三次提取液得总提取液；（2）总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；（3）将乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。本发明从桑黄子实体中分离提取得到的桑黄提取物，能够有效地用于制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌的药物，且提取工艺简单易行，操作方便，能够有效提取多种有效成分，提取效率高，产品质量稳定，对桑黄资源的综合利用和产业化发展具有重要意义。
【专利说明】桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用，属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]肝癌、子宫颈癌、乳腺癌是目前比较常见的三种恶性肿瘤，不仅严重影响患者的生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，也是困扰全球的重大社会问题，癌症的治疗和预防始终是全球范围类最为迫切的问题之一。目前，化学药物治疗是抗击肿瘤的主要手段，虽然有较好的疗效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应，使患者难以坚持治疗，并且化疗药物在治疗过程中出现的耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一。近年来，全球抗肿瘤药物市场呈快速增长态势，据美国FDA统计数据，全球抗癌药物市场销售总额由2004年的240亿美元，激增至2007年的396亿美元。虽然全球每年都不断有新型抗肿瘤药物问世，但至今人类仍然没有一种有效的手段战胜癌症，同时不断发现新的癌症种类，以及肿瘤抗/耐药性的产生和增强，使得对发现新型有效抗癌药物的需要显得尤为迫切。纵观全球1981至2002年期间所开发的抗癌药物，约60%直接或间接来自于天然产物，充分表明自然界是人类获取抗肿瘤药物的最重要的源泉。我国中药资源丰富，从传统的药用资源中筛选寻找抗癌天然活性部位是完全可行的。
[0003]桑黄，基原为多孔菌科针层孔菌的子实体，拉丁学名:phellinus igniarius(L.exFr.)QUel。又名:火木层孔菌，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形。现代研究证实桑黄含有黄酮、多糖等有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤等多方面的药理活性，因此，从桑黄中寻找高活性的抗肿瘤活性部位是可行的。
【发明内容】
·
[0004]本发明的目的是提供一种桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0006]桑黄提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。
[0007]桑黄提取物在制备治疗子宫颈癌药物中的应用。
[0008]桑黄提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0009]所述的药物剂型可以是片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、糖浆、冻干粉针、水针等剂型。
[0010]所述的桑黄提取物的制备方法如下:
[0011 ] (I)桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小时，提取温度为75-85°C，合并三次提取液得总提取液；
[0012](2)总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0013](3)将乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。
[0014]本发明的有益效果:
[0015]本发明从桑黄子实体中分离提取得到的桑黄提取物，能够有效地用于制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌的药物，且提取工艺简单易行，操作方便，能够有效提取多种有效成分，提取效率高，产品质量稳定，对桑黄资源的综合利用和产业化发展具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为桑黄提取物对肝癌!fepG2细胞体外增殖抑制活性显微图；其中，a、对照组，b、阳性药物组，C、实验组(200 μ g/ml)。
[0017]图2为桑黄提取物对宫颈癌HeLa体外增殖抑制活性显微图；其中，a、对照组，b、阳性药物组，C、实验组(200 μ g/ml)。
[0018]图3为桑黄提取物对乳腺癌MCF-7体外增殖抑制活性显微图；其中，a、对照组，b、阳性药物组，C、实验组(150 μ g/ml), d、实验组(200 μ g/ml)。
[0019]图4为桑黄提取物对肝癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*P〈0.05，**Ρ〈0.01vs.模型组；#Ρ〈0.05, ##P<0.01vs.正常组。
[0020]图5为桑黄提取物对肝癌荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.0 1vs.模型组。
[0021]图6为桑黄提取物对肝癌荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型组;##P<0.01vs.正常组。
[0022]图7为桑黄提取物对宫颈癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型组；#Ρ〈0.05, ##P<0.01vs.正常组。
[0023]图8为桑黄提取物对宫颈癌荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型组。
[0024]图9为桑黄提取物对宫颈癌荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响分析图；其中，*p<0.05，**P<0.01vs.模型组;##P<0.01vs.正常组。
[0025]图10为桑黄提取物对乳腺癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影响分析图；其中，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01vs.模型组；#P<0.05，##P<0.01vs.正常组。
[0026]图11为桑黄提取物对乳腺癌荷瘤裸鼠NK细胞杀伤活性的影响分析图；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型组。
[0027]图12为桑黄提取物对乳腺癌荷瘤裸鼠ConA诱导脾淋巴细胞增殖反应的影响分析图；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型组;##P<0.01vs.正常组。
【具体实施方式】
[0028]下面举出实施例对本发明的制备方法进行说明，但本发明的制备方法并不限于此。
[0029]实施例
[0030]一种桑黄提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0031](I)取桑黄子实体10kg，粉碎，用95%乙醇回流提取三次(6倍量、5倍量、4倍量)，每次提取2小时，提取温度为80°C，合并三次提取液得总提取液；
[0032](2)总提取液回收乙醇后，浓缩至1.5g生药/ml，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0033](3)将得到的乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物462g。
[0034]下面通过试验证明本发明的桑黄提取物的抗肿瘤活性。
[0035]细胞毒实验:
[0036]一、实验材料:
[0037]1、细胞株
[0038]肝癌细胞株H印G2 ;宫颈癌细胞株HeLa ;乳腺癌细胞株MCF-7 ;安徽医科大学药学院提供。
[0039]2、药物与试剂
[0040]桑黄乙醇提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物；
[0041]DMEM培养粉:购自美国Gibco公司；
[0042]小牛血清，胎牛血清:购自杭州四季青生物材料研究所。置于_20°C冰箱保存，4°C冰箱过夜融化，在56°C水浴30min灭活后使用；
[0043]氟尿嘧啶:购自齐鲁制药有限公司；
[0044]青霉素:购自哈药集团制药总厂；
[0045]链霉素:购自深圳华南南方制药有限公司；
[0046]二甲基亚讽(DMSO):购自Sigma公司；
[0047]噻唑蓝(MTT):购自Sigma公司；
[0048]50mm2细胞培养瓶，96孔板:购自康宁公司
[0049]3、主要溶液配制
[0050]DMEM细胞培养液:DMEM粉末一包，丙酮酸钠0.Hg,谷氨酰胺0.58g，碳酸氢钠
2.0g，加入三蒸水定容至1000ml，0.22μπι过滤除菌，分装后置于-20°C保存备用。临用前37°C水浴融化，后加入105IU/L青霉素，100mg/L链霉素，10%小牛血清(10%胎牛血清用于培养乳腺癌细胞)。
[0051]磷酸盐缓冲液(PBS):8.0g NaCl, 0.2g KCl, 2.9g Na2HPO412H20,0.2g KH2PO4 ；
[0052]溶解于适量三蒸水，调节PH值至7.2，定容至1L，过滤分装，高压灭菌后，_20°C保
存备用。
[0053]MTT溶液:MTT粉剂溶于PH为7.4的PBS溶液中，浓度5mg/ml，避光、超声助溶，过滤除菌，现配现用，4°C保存。
[0054]4、仪器与设备
[0055]40C，_20°C低温冰箱:日本三洋公司；
[0056]MDF-U40865型_80°C超低温冰箱:日本三洋公司；
[0057]SB25-12DTD型超声波清洗机:宁波新芝公司； [0058]DHG-9243BS-1II型电热恒温鼓风干燥箱:上海新苗；
[0059]DK-8D三孔电热恒温水槽:合肥科隆公司；
[0060]3-16K型冷冻离心机:Sigma公司；[0061]TGL高速冷冻离心机:长沙湘智离心仪器有限公司；
[0062]2306-Z型CO2培养箱:美国Shellab公司；
[0063]立式压力蒸汽灭菌器:
[0064]Sff-CJ-1F型净化工作台:苏州净化公司产品；
[0065]Rios83olPE超纯水机:美国密理博公司产品；
[0066]MULISKAN MK3 酶标仪:Thermo forma 仪器有限公司；
[0067]移液器:法国PIPETMA公司；
[0068]XD-202倒置显微镜:合肥科隆；
[0069]二、实验方法
[0070]2.1细胞培养
[0071]本实验所用的肝癌细胞！fepG2，宫颈癌细Hela，乳腺癌细胞MCF-7。均为贴壁生长的细胞株，除了乳腺癌细胞用含10%的胎牛血清DMEM培养液，其余两种细胞株用含有10%的小牛血清DMEM培养液，并加入青霉素10IU/mL和链霉素100 μ g/mL的培养体系培养。培养环境为37°C，5%的CO2培养箱，每2天更换培养液一次，细胞长满培养瓶时消化传代，(细胞种类不同，传代比例不同)，取处于对数生长期的细胞进行实验。
[0072]2.2MTT法检测细胞增殖情况
·[0073]活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在492nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值A，来判断活细胞数量，A值越大，细胞活性越强。
[0074]肝癌，宫颈癌，乳腺癌细胞以5X IO5个/ml的浓度接种于96孔培养板中，每孔接种量为100 μ Lo待细胞贴壁后，分为空白对照组，溶剂对照组(1%DMS0)，阳性对照5-FU组，每组设5个复孔组，每孔总体积为200 μ L,分别于48h、72h后，弃去孔内液体，用PBS清洗2便，之后加入180 μ L无血清培养液，并加入MTT (浓度为5mg/mL) 20 μ L，继续在培养箱培养4h后，弃上清，每孔加入150yL的DMS0，震荡摇匀，使甲瓒颗粒充分溶解。于酶联免疫检测仪上，以波长492nm，试剂对照组调零，测吸光度(A492)值，重复3次，取其平均值。用SPSS17.0计算细胞IC50值，按照下列公式计算细胞生长抑制率:
[0075]细胞生长抑制率=〔(对照组平均A492值-空白组平均A492值)-实验组平均A492值-空白组平均A492值)/对照组平均A492值-空白组平均A492值〕X 100%。
[0076]三、实验结果
[0077]表1桑黄提取物对肝癌HepG2细胞的抑制作用
[0078]
【权利要求】
1.桑黄提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。
2.桑黄提取物在制备治疗子宫颈癌药物中的应用。
3.桑黄提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
4.根据权利要求1或2或3所述的桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的药物剂型可以是片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、糖浆、冻干粉针、水针等剂型。
5.根据权利要求1或2或3所述的桑黄提取物在制备治疗肝癌、子宫颈癌、乳腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的桑黄提取物的制备方法如下: (O桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小时，提取温度为75-85°C，合并三次提取液得总提取液； (2)总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取； (3)将乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，`回收溶`剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。
【文档编号】A61K36/06GK103860602SQ201410023184
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】李宁, 陈刚, 贾鹏鹏, 王开金, 余春富 申请人:六安市丹皇生物科技有限责任公司, 安徽医科大学