桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用，该桑黄提取物的制备方法如下:（1）桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，合并三次提取液得总提取液；（2）总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；（3）将乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。本发明桑黄提取物能够显著提高机体免疫力，且对人体无毒无害，即使长期大剂量服用亦无任何毒副作用；同时制备方法简单易行，操作方便，能够有效提取多种有效成分，提取效率高，产品质量稳定。
【专利说明】桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用，属于医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]桑黄,基原为多孔菌科针层孔菌的子实体,拉丁学名:phellinus igniarius(L.exFr.)Quel。又名:火木层孔菌，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层。菌肉深咖啡色，硬，木质。菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝。管口锈褐色至酱色，圆形。子近球形，光滑，无色。刚毛顶端尖锐，基部膨大。菌丝不分枝，无横隔。生于杨、柳、桦、栎等树干上。分布东北、华北、西北及四川、云南等地。桑黄具有利五脏、软坚、排毒、止血、活血和胃止泻之功效，主治淋病，崩漏带下，症瘕积聚，癖饮，脾虚泄泻。
[0003]现代研究证实桑黄含有黄酮、多糖等有效成分，具有免疫调节、抗肿瘤等多方面的药理活性，本发明提供了一种桑黄提取物的制备方法，并以小鼠为实验研究对象，进一步验证该桑黄提取物的增强免疫力作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于在于提供一种桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:·[0006]桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用。
[0007]所述的药物剂型可以是片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、糖浆、冻干粉针、水针等剂型。
[0008]所述的桑黄提取物的制备方法如下:
[0009](I)桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小时，提取温度为75-85°C，合并三次提取液得总提取液；
[0010](2)总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0011](3)将乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。
[0012]本发明的有益效果:
[0013]本发明桑黄提取物能够活化人体免疫系统，能够配合手术、放、化疗患者提高免疫力，提早伤口愈合，减轻放、化疗毒性，提高红细胞、白细胞的数量，减小癌症复发、癌细胞转移的风险，同时能够减少并发症，且对人体无毒无害，即使长期大剂量服用亦无任何毒副作用；同时制备方法简单易行，操作方便，能够有效提取多种有效成分，提取效率高，产品质量稳定。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为桑黄乙酸乙酯提取物对小鼠脾脏指数的影响分析图；其中，Vs.正常组*P〈0.05，**P〈0.01(左旋咪唑为阳性药);模型组的小鼠脾脏指数跟正常组有明显的差异性，说明造模成功。
[0015]图2为桑黄乙酸乙酯提取物对小鼠胸腺指数的影响分析图；其中，Vs.正常组*P〈0.05, #P〈0.01 (左旋咪唑为阳性药)。
[0016]图3为桑黄乙酸乙酯提取物刺激脾细胞增殖实验分析图；其中，Vs.对照组*P〈0.05 ;各组药物对小鼠的脾淋巴细胞都有刺激作用，药物处理组跟对照组比较有显著性差异(P〈0.05)，说明桑黄的乙酸乙酯提取物能够刺激小鼠脾细胞的增殖。
[0017]图4为桑黄乙酸乙酯提取物协同ConA (刀豆蛋白)刺激脾细胞的增值实验分析图；其中，Vs.对照组(刀豆蛋白);*P〈0.05，Vs.ConA (刀豆蛋白，5 μ g/ml);^ Ρ〈0.05 ;桑黄乙酸乙酯提取物协同ConA对小鼠的脾细胞的刺激作用跟对照组的刺激作用相比较有差异；桑黄乙酸乙酯提取物协同ConA对小鼠的脾细胞的刺激作用跟ConA单独的刺激作用相比较，在12.5μ g/ml时没有显著性差异，其余组别有显著性差异。[0018]图5为桑黄乙酸乙酯提取物协同LPS (脂多糖)刺激脾细胞的增值实验分析图；其中，Vs.LPS组(脂多糖，10 μ g/ml) ;☆ Ρ〈0.05Vs.对照组;*P〈0.05 ;桑黄乙酸乙酯提取物协同LPS对小鼠的脾细胞的刺激作用跟对照组的刺激作用相比较有差异；桑黄乙酸乙酯提取物协同LPS对小鼠的脾细胞的刺激作用跟LPS单独的刺激作用相比较，在12.5 μ g/ml时没有显著性差异，其余组别有显著性差异。
[0019]图6为巨噬细胞吞噬中性红能力分析图，其中，Vs.对照组*Ρ〈0.05, #Ρ〈0.01，LPS为脂多糖；药物刺激巨噬细胞后，细胞的吞噬作用跟对照组相比较，吞噬作用都增加了，药物在低浓度6.25 μ g/ml跟对照组的吞噬活性没有显著性差异，其余的药物浓度跟对照组比较都有显著性差异。
【具体实施方式】
[0020]下面举出实施例对本发明的制备方法进行说明，但本发明的制备方法并不限于此。
[0021]实施例
[0022]一种桑黄提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0023](I)取桑黄子实体10kg，粉碎，用95%乙醇回流提取三次(6倍量、5倍量、4倍量)，每次提取2小时，提取温度为80°C，合并三次提取液得总提取液；
[0024](2)总提取液回收乙醇后，浓缩至1.5g生药/ml，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0025](3)将得到的乙酸乙酯萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物462g。
[0026]下面通过试验证明本发明桑黄提取物对免疫力提高的作用。
[0027]1、免疫力低下模型的建立
[0028]SPF级别的昆明种小鼠，18_22g，雄性，70只。[0029]腹腔注射环磷酰胺(CTX)60mg/kg/day,0.lml/10g,每天注射一次,两天暂停一次，连续5次；(腹腔注射过程中可能有死亡的小鼠，本实验处理腹腔注射过程中，死了 4只，灌胃过程中死I只)；末次腹腔注射第二天，开始灌胃给药，连续7天。按照体积为0.lml/10g,
0.5%的CMC-Na作为药物的混悬剂制备药物。
[0030]2、实验分组:n=12
[0031 ] (I)正常组(不做任何处理，灌胃生理盐水)
[0032](2)模型组(免疫力低下模型，灌胃生理盐水)
[0033](3)阳性药组(盐酸左旋咪唑，20mg/kg.d)
[0034](4)低剂量组:50mg/kg.d
[0035](5)中剂量组:100mg/kg.d
[0036](6)高剂量组:200mg/kg.d
[0037]3、体内实验 [0038]实验观察指标:
[0039](1)灌胃前后称量小鼠的体重，脏器指数，胸腺、脾脏的重量；
[0040](2)末次灌胃后禁食不禁水，次日眼球取血，离心，取上层的血清，-20°C保存，ELISA法测量血清中的IL-2，TNF-α的含量。
[0041]4、体外实验
[0042]4.1提取腹腔巨噬细胞，种96孔板；吞噬中性红能力(正常小鼠的巨噬细胞，用药物刺激)
[0043]脱臼处死小鼠，浸入75%的乙醇中l_2min即可，于超净台中操作，剪开腹部的皮毛，腹腔注射预冷的PBS5ml左右，用镊子轻轻揉小鼠腹部，时间不能超过Imin ;然后用镊子提起腹膜，剪开一个小口子，用Iml的枪头吸出PBS，沿着皮吸，注意不要吸到内脏和血液；40C，500rpm, IOmin;弃掉上清液，用PBS清洗2遍，用RPM1-1640培养液重悬细胞，细胞计数后，调节细胞浓度为lXlOVml，接种于96孔板中，100μ I/孔；完全RPM1-1640为空白对照组；贴壁4h后，用PBS清洗2遍后，(若有血细胞，贴壁时间减少为2h左右，冲洗细胞)去除非贴壁细胞，即为小鼠腹腔巨噬细胞。
[0044]药物刺激巨噬细胞后24h，倾去上清液，每孔加入0.1%的中性红生理盐水100 μ I,继续培养20min，倾去上清液，用37°C预热的PBS清洗3遍，用注射器吸干净，每孔加入细胞溶解液(乙酸:无水乙醇=1:1)0.2ml，室温下放置2-3h，待细胞溶解后，即在酶联免疫检测仪上测490nm处的吸光度。每个浓度设置6个复孔，重复3次试验，取其平均值。
[0045]巨噬细胞的酸性磷酸酶活性测定；
[0046]巨噬细胞分泌NO的作用；
[0047]4.2提取脾脏巨噬细胞；YAC-1细胞；NK细胞的自然杀伤能力
[0048](I)效应细胞:
[0049]常规无菌取小鼠脾淋巴细胞，无菌取出脾脏，置于5ml的PBS液体的小培养皿中(冰上操作)，脾脏上用小剪刀剪开几个小口子，用镊子在4层纱布中，将脾脏轻轻研碎，制成单细胞悬液，收集细胞混悬液于离心管中，lOOOrpm，lOmin，离心，弃掉上清液，余留固体在离心管底部，加入红细胞裂解液，量为细胞体积的3-5倍，混均匀，静止3-5min ;补充1640离心，得到沉淀为脾细胞，用10%FBS的RPM1-1640培养液培养细胞，制成为I X 107/ml的细胞悬液；
[0050] (2)制备靶细胞:
[0051 ] 取传代培养24-48h的YAC-1细胞，10%的RPM1-1640，洗涤两次后，用0.5%的BSA-RPM1-1640培养液洗涤一次，调节细胞浓度为3 X 105/ml，台盼蓝染色存活率>95% ；
[0052](3)活性测定:
[0053]96孔板，实验孔加效应细胞，靶细胞各100 μ I;
[0054]靶细胞对照孔:靶细胞+培养液各100 μ I ;
[0055]效应细胞对照孔:效应细胞+培养液各100 μ I ;
[0056]每个标本有3各复孔；
[0057]培养液孵育4h后，各孔加入MTTlO μ 1，在孵育4h ;结束后，DMSO150 μ 1，
0.05mol (ρΗΙΟ.5)甘氨酸缓冲液20 μ 1，微型震荡lOmin，570nm测量OD值;
[0058]5、实验结果
[0059]表1桑黄乙酸乙酯提取物对小鼠体重的影响(X 土 s，n=10)
【权利要求】
1.桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用，其特征在于，所述的药物剂型可以是片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、糖浆、冻干粉针、水针等剂型。
3.根据权利要求1所述的桑黄提取物在制备提高免疫力作用的药物中的应用其特征在于，所述的桑黄提取物的制备方法如下: (O桑黄子实体粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小时，提取温度为75-85°C，合并三次提取液得总提取液； (2)总提取液回收乙醇后，浓缩至适量，加蒸馏水制成悬浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取； (3)将乙酸乙酯 萃取液减压蒸馏，回收溶剂，浓缩至干，即得桑黄提取物。
【文档编号】A61K36/06GK103845369SQ201410022879
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】李宁, 尹维龙, 黄河, 王开金, 余春富 申请人:安徽省康美来大别山生物科技有限公司, 六安市丹皇生物科技有限责任公司, 安徽医科大学