Caseabalansin E在制备治疗前列腺癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物CaseabalansinE的新用途，具体涉及CaseabalansinE在制 备治疗前列腺癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002] BoWang等人首次分离纯化出化合物CaseabalansinE，并将成果发表在著名天然 产物杂志（CytotoxicClerodaneDiterpenoidsfromtheLeavesandTwigsofCasearia balansae，J.Nat.Prod.，2013, 76,1573-1579) 〇
[0003]目前尚未有该化合物关于治疗前列腺癌的活性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种CaseabalansinE的医药用途。
[0005] 上述目的是通过如下技术方案实现的：
[0006]CaseabalansinE在制备治疗前列腺癌药物中的应用，所述CaseabalansinE化学 结构式如下，
[0007]
[0008] 进一步地，所述前列腺癌为前列腺癌PC3和DU145。
【附图说明】
[0009] 图1 :不同浓度CaseabalansinE作用72h后PC3和DU145存活率；
[0010] 图 2 :10. 0mg/LCaseabalansinE作用不同时间后PC3 和DU145 存活率。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容。
[0012] 实施例1:CaseabalansinE的分离制备及结构确证
[0013] CaseabalansinE的制备方法同文献报道的制备方法（CytotoxicClerodane DiterpenoidsfromtheLeavesandTwigsofCaseariabalansae，J.Nat.Prod.，2013， 76,1573-1579)。
[0014] 结构确证：白色无定形固体，分子式为C27H4206，不饱和度为7。核磁共振氢谱数 据SH(ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-1 (1.79,d，J= 14.5)，H-1 (1.91，m)，H-2 (5.35,br，s)， H-3(5. 89,d，J= 4. 1)，H-6(3. 31，m)，H-7(l. 74,dt，J= 12. 6,3. 1)，H-7(l. 38,q，J= 12.6)，H-8 (1.65,m)，H-10 (2.33,dd，J= 14. 5, 3.2)，H-ll(1.41，m)，H-12 (2.46,m)， H-12 (1. 87,m)，H-14 (6. 32,dd，J= 17. 6,10. 8)，H-15 (5. 14,d，J= 17. 6)，H-15 (4. 44,d， J= 10. 8)，H-16(5. 00,s)，H-16(4. 92,s)，H-17(0. 89,d，J= 7. 7)，H-18(5. 31，br，s)， H-19(5.46，s)，H-20(0.88，s)，H-2'（2.41，m)，H-3，（1.62，m)，H-3，（1.42，m)，H-4，（0.90， t，J= 7.4)，H-5'（1.35,d，J= 6.9)，6-0Me(3. 17,s)，18-0Me(3.20,s);核磁共振碳谱 数据Sc (ppm，DMS0-d6,150Hz) :27. 8 (CH2,1-C)，68. 1 (CH，2-C)，121. 1 (CH，3-C)，149. 2 (C， 4-C)，54. 8 (C，5-C)，83. 2 (CH，6-C)，32. 0 (CH2, 7-C)，37. 6 (CH，8-C)，38. 2 (C，9-C)，37. 0 (CH， 10-C)，31. 4(CH2,11-C)，25. 1 (CH2,12-C)，148. 6(C，13-C)，140. 5(CH，14-C)，112. 3(CH2， 15-C)，115. 5(CH2,16-C)，15. 6(CH3,17-C)，104. 7(CH，18-C)，99. 3(CH，19-C)，25. 9(CH3， 20-C)，177. 7(C，1' -C)，42. 0(CH，2' -C)，27. 2(CH2,3' -C)，11. 6(CH3,4' -C)，16. 3(CH3， 5' -C)，57. 4 (CH3,6-0Me)，55. 5 (CH3,18-0Me)。结构确证数据与文献报道一致，因此可以确 定本发明制备的化合物即为文献报道的CaseabalansinE。
[0015] 实施例2:CaseabalansinE的药理作用试验
[0016] -、材料和仪器
[0017] 前列腺癌细胞株PC3(ArCC-CRL-1435)、前列腺癌细胞株DU145(ATCC-HTB-81)。 CaseabalansinE自制，HPLC归一化纯度大于98%，用二甲基亚矾（DMS0)配制成浓度为 1.〇g/L的储存液备用。CCK-8试剂盒为日本同仁化学研究所产品。RPMI-1640培养基购自 Gibco公司。胎牛血清（FBS)购自Hyelone公司。青/链霉素为上海先锋药业产品。胰 蛋白酶购自华美生物工程公司。二甲基亚砜（DMS0)购自上海华舜生物工程公司。琼脂 (Agarose)、二硫苏糖醇（DTT)、苯甲基磺酞氟（PMSF)、四甲基乙二胺（TEMED)为Sigma公司 产品。十二烷基磺酸钠（SDs)、三氯甲基烷基甲烧（Tris)Tris-Hcl、Tritonx_100为Promega 公司产品。丙烯酞胺、过硫酸钱（AP)购于苏州化学试剂厂产品。
[0018] C02细胞培养箱（ShellLab)，倒置相差显微镜（Nikon)，超净工作台（苏州净化 设备厂），流式细胞仪（BD)，F039300A型酶标仪（Sunrise)，高压蒸汽灭菌器（Hirayama HA-300MD)，低温超速离心机（Kubota3740)，万向摇床（江苏麒麟医用仪器厂TS-92)，电泳 仪（Gibco公司），LXJ-II型离心机（上海医用分析仪器厂），DK600型电热恒温水浴箱（上 海精密试验设备公司），电子天平（METTLERTOLEDO)，台式干燥箱（上海森信实验仪器有限 公司），紫外分光光度仪（Beckman)。
[0019] 二、试验方法
[0020] 1、细胞培养与养护
[0021] 1.1细胞培养
[0022] 细胞株培养于肿瘤医院中心实验室。培养于含10 %胎牛血清的RPMI-1640培养基 中，另添加谷氨酞胺（2mmol/L)和抗生素（100U/青霉素和lOOmg/L链霉素），置37°C、饱和 湿度、含5% 0)2气体的培养箱中培养。
[0023] 1. 2细胞传代
[0024] ①于倒置相差显微镜下观察细胞长满贴壁，即可传代。传代前用75%酒精擦拭经 过紫外线照射的超净工作台和双手。②用吸管吸去培养瓶中的旧培养液，用PBS清洗3次。 ③加入0. 02 %EDTA-0. 25 %胰蛋白酶液2mL进行消化，静置约5分钟，并不时在倒置相差显 微镜下观察，当胞质回缩，细胞之间不再连接成片时，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰 蛋白酶的作用。④用滴管将已经消化的细胞吹打成细胞悬液，吸入10mL离心管中平衡离心 (1000转/分）5分钟。⑤弃去上清液，加入2mL培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬 液，1:2~3分装入新培养瓶，添加培养液适量于孵箱中继续培养。
[0025] 2、细胞形态学观察
[0026] 倒置显微镜观察：将对数生长期PC3和DU145细胞接种于6cm培养皿，培养24h后 加入10.Omg.L\CaseabalansinE处理24,48, 72h后分别在倒置相差显微镜下观察细胞形 态改变并记录。
[0027] 3、细胞毒试验（CCK-8法）
[0028] ①培养瓶中的细胞消化成单细胞悬液，细胞计数后按照3X104个细胞/孔接种 于96孔板，每孔加0.lmL培养基，常规培养于37°C、含5 % 0)2气体的培养箱中。②试验 分组：设阴性对照组（有细胞但不加药，0. 1 %DMS0)，空白对照组（无细胞仅有培养液）， CaseabalansinE分别 2. 5mg/L，5. 0mg/L，10. 0mg/L和 20. 0mg/L共 6 组。③ 24 小时后观察 细胞贴壁生长良好，分别按上述试验分组向96孔板内加药，每组设6-8个重复孔。④加药 后将96孔板移入37°C、含5% 0)2气体的培养箱中继续分别培养24、48和72小时。⑤每 组试验结束时每孔加入CCK-810yL，37°C培养箱中继续培养4小时后酶标仪检测450每孔 的吸光度（0D)值，测定波长为450nm，参考波长为600nm。⑥按照以下公式计算出细胞存活 率（cellviability)，然后绘制成图表，存活率为50%时的值即为IC5。。细胞存活率（％) =[(As-Ab)/(Ac_Ab)]X100%。其中As为试验孔，Ac为对照孔，Ab为空白孔。
[0029] 4、集落形成试验
[0030] ①取对数生长期细胞，计数后以3X102个接种于6孔板，每孔加2mL培养基，常规 培养于37°C、含5% 0)2气体的培养箱中。②24h后观察细胞贴壁生长良好，分别加入不同 浓度（0,2. 5, 5.0,10. 0, 20. 0mg/L)CaseabalansinE处理，每组设3个重复孔。③加药后将 6孔板移入37°C、含5%C02气体的培养箱中继续14天。④10%甲醇固定，Giemsa染色，计 算每孔集落数（多50个细胞的计为一个集落）。⑤计算集落形成率：集落总数/接种细胞 数X100%。
[0031] 三、结果及结论
[0032] 1、CaseabalansinE对PC3 和DU145 细胞形态的影响
[0033] 镜下见对照组细胞贴壁生长，相邻细胞融合成片，细胞呈类圆形或梭形，体积较 大，排列紧密，边缘光滑，胞质饱满，核膜、核仁等结构轮廓明显，细胞生长迅速；经10.〇mg/L CaseabalansinE处理后，细胞密度逐渐降低，生长速度明显减慢至几乎停滞，细胞逐渐脱 落并漂浮于培养液中。细胞体积缩小，胞膜皱缩，成小圆形或不规则形态，胞内多见小颗粒 状物质。药物作用时间越长，细胞形态学改变越明显。
[0034] 2、细胞毒试验
[0035] 不同浓度CaseabalansinE对前列腺癌细胞株PC3和DU145的生长均有抑制作用。 2. 5, 5. 0,10. 0, 20.Omg/LCaseabalansinE作用两种细胞24,48和72h后的存活率如下表 所示（表 1 及表 2)。其中，10.0mg/LCaseabalansinE作用于PC3 和DU145 细胞 24,45,72h 后的细胞存活率分别为 56. 2%，42. 5%，24. 3%和 50. 8%，32. 6%，20. 7% ;2. 5, 5. 0,10. 0， 20.Omg/L，CaseabalansinE作用两种细胞 72h后的存活率分别为 54. 3%，37. 7%，24. 3%， 13. 2%和52. 4%，32. 8%，20. 7%，11.2% (见图1及图2)。两因素方差分析示不同浓度与 不同时间处理组之间差别具有统计学意义（P〈〇. 05)，提示CaseabalansinE对PC3和DU145 的生长抑制作用呈时间浓度依赖。
[0036] 3、集落形成试验
[0037] 试验显示，对照组PC3和DU145的集落形成率分别为67. 7和64%，而2. 5, 5. 0， 10. 0,20.Omg/LCaseabalansinE处理组分别为 60. 7%，51. 3,39. 3%，27. 0%和 49. 7%， 34.0%，27.7%，15.7% (见表 3)。这进一步证实了CaseabalansinE对PC3 和DU145 细胞 具有增殖抑制作用。
[0038] 结论，本试验中通过CCK-8法和集落形成试验来验证CaseabalansinE对前列腺 癌细胞株PC3和DU145的作用，且抑制作用具有浓度--时间依赖性关系。Caseabalansin E可能成为晚期前列腺癌治疗中的一个具有潜力的选择。
[0039] 表1不同浓度CaseabalansinE作用于PC3后的细胞存活率
[0040]
[0041] 表2不同浓度CaseabalansinE作用于DU145后的细胞存活率
[0042]
[0043] 表3不同浓度CaseabalansinE作用下PC3和DU145的集落形成率
[0044]
【主权项】
1. CaseabalansinE在制备治疗前列腺癌药物中的应用，所述CaseabalansinE化学结 构式如下，2. 根据权利要求1所述的CaseabalansinE在制备治疗前列腺癌药物中的应用，其特 征在于：所述前列腺癌为前列腺癌PC3和DU145。
【专利摘要】本发明公开了Caseabalansin？E在制备治疗前列腺癌药物中的应用，属于药物领域。研究发现Caseabalansin？E对前列腺癌细胞株PC3和DU145有抑制作用，且抑制作用具有浓度—时间依赖性关系，可以进一步研究开发成制备治疗前列腺癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, A61K31/343, A61P13/08
【公开号】CN105106195
【申请号】CN201510590357
【发明人】潘光贤
【申请人】潘光贤
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月16日