专利名称：桑黄菌中环二肽c2的分离技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
桑黄(Phellinus)，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2_12*3_21厘米，厚
1.5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类:一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (All esch et Schnabl) Imaz)中环二妝 C2 的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿甲醇梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，经HPLC检测，即得环二肽C2，即六氢-7 -羟基-3 -(苯基甲基)批咯并[l，2-a〕吡嗪-1，4 - 二酮。此化合物具有抑制鳗弧菌繁殖作用。本发明的技术方案如下:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到
2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力
0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0.5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；
(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。分离环二肽C2的方法:
桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一正相硅胶层析一甲醇凝胶层析一TLC检测一反相硅胶层析一甲醇凝胶层析HPLC检测一减压蒸干一环二肽C2。具体方法为: (1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-5次；
(3)收集步骤(2)中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱；
(4)收集上述步骤(3)中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；
(5)对步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水；
(6)收集洗脱液，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析。(7)HPLC检测，适度合并洗脱液，减压干燥，即为环二肽C2。本发明由桑黄菌中环二肽C2的分离技术的显著优势:本方法采用多种层析技术相结合，可以精致到结构明确，纯度大于95%的环二肽C2。技术路线成熟明确，高效精确。
图1为环二肽C2的结构式；
图2为环二肽C2的一维核磁共振H谱。
具体实施例方式实例1:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 0.1%酵母膏 0.1%
硫酸镁 0.1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量
0.5-1.lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
将上述粗提物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高lm，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=100:1,50:1,10:1,5:1分别洗脱3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr_l，Fr_2，Fr-3，Fr-4，Fr_5。。将Fr_5等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇。使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇:水=15%，TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，将洗脱液减压蒸干，进行HPLC检测,Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，适当合并洗脱液,减压干燥,得到环二肽C2,进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7.35 - 7.13 (m, 5H)，4.45 (t,J = 4.1 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 10.9, 5.2 Hz, 1H)，4.24 (d, J = 4.7 Hz, 1H)，
3.66 (dd, J = 13.0, 5.0 Hz, 1H)，3.12 (d, J = 5.0 Hz, 2H)，2.02 (dd, J = 13.0,
5.9Hz, 1H),1.36 -1.26 (m, 1H).证明是六氢_7 -羟基-3 -(苯基甲基)卩比咯并[I, 2-a)吡嗪-1，4 - 二酮。实例2:
桑黄粗提物，由下述方法制得:
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是:
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.lvvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。将上述粗提物称取150g与等体积正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200目正相硅胶，柱高0.Sm，直径14cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿:甲醇=100:1，50:1,10:1,5:1分别洗脱2个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1，Fr_2，Fr_3，Fr_4，Fr-5。。将Fr-5等体积硅胶拌样，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200目正相硅胶。洗脱剂为氯仿与甲醇。收集洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，进行甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇。使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇:水=15%，TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，用甲醇洗脱，将洗脱液减压蒸干，进行HPLC检测，Omin, 100%A水一IOmin, 100%甲醇，出峰时间为
5.45min，适当合并洗脱液，减压干燥，得到环二肽C2，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 δ 7.35 - 7.13 (m, 5H)，4.45 (t, J = 4.1 Hz, 1H)，4.32 (dd,J = 10.9, 5.2 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 4.7 Hz, 1H)，3.66 (dd, J = 13.0, 5.0 Hz,1H), 3.12 (d, J = 5.0 Hz·, 2H)，2.02 (dd, J = 13.0, 5.9 Hz, 1H)，1.36 -1.26(m, 1H).证明是六氢-7 -羟基-3 -(苯基甲基)卩比咯并[l，2-a〕吡嗪_1，4 - 二酮。
权利要求
1.桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其步骤顺序如下: (1)制备桑黄菌粗提物； (2)将上述步骤(I)所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，使用洗脱剂洗脱3-5次； (3)收集步骤(2)中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，使用洗脱剂洗脱； (4)收集上述步骤(3)中得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥； (5)对步骤(4)得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇和水； (6)收集洗脱液，减压蒸干，进行甲醇凝胶层析； (7)HPLC检测，适度合并洗脱液，减压干燥，即为环二肽C2。
2.如权利要求1所述的一种从桑黄菌中分离苯乙醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得: (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是: 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0.1-0.5%磷酸二氢钾0.01-0.05% (2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35 °C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力0.1 0.2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0.5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于所述的环二肽C2为六氢-7 -羟基-3 -(苯基甲基)吡咯并[1，2-a)吡嗪-1，4 - 二酮。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤⑵中所述的层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿或甲醇。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为氯仿与甲醇。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为S印hadex LH-20或者S印hadex LH-25，洗脱剂为甲醇。
8.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的反相材料为C-18或者C-8。
9.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的洗脱剂为甲醇:水=15%-70%。
10.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(6)所述的凝胶为甲醇凝胶。
11.如权利要求1所述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(7)所述的HPLC 条件为，Omin, 100%A 水一1Omin, 100% 甲醇。
12.如权利要求1所 述的桑黄菌中环二肽C2的分离方法，其特征在于，步骤(J)所述的HPLC出锋时间为5.3-5.9min。
全文摘要
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中环二肽C2的分离方法。首先制备桑黄菌粗提物，然后进行正相硅胶层析，采用氯仿甲醇梯度洗脱，进行TLC检测，再次使用正相硅胶层析，然后是甲醇凝胶层析，经PLC检测后，进行反相硅胶层析，适当合并洗脱液，减压干燥，再次进行甲醇凝胶层析，经HPLC检测，既得环二肽C2。
文档编号C07D487/04GK103073551SQ20131003597
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者宋爱荣, 赵晨, 孙效乐, 田雪梅, 孔超 申请人:青岛农业大学