肾脏疾病诊断用试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于诊断肾脏疾病的尿液检查用组合物、用于诊断肾脏疾病的尿液检查试剂盒、检测从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的方法以及肾脏疾病的发病或经过的诊断方法。
【背景技术】
[0002]肾脏是排泄血液中的废物并以尿液的形态将其排出的脊椎动物的排泄器官，大体分为三个部分。即，由外侧的皮质部分、位于该皮质部分内侧的髓质部分和髓质内侧的肾盂构成。其中，髓质部分由肾小管和将这些肾小管汇合在一起的集合管构成，集合管的末端向肾盂敞开。在此，肾脏的肾小管根据划分由彼此不同类型的细胞构成，从接近肾小球的部位起依次称为近端肾小管、髓袢降支细段、髓袢升支细段、远端肾小管和集合管。尿液是从肾小球排泄的肾小球滤过液经过这些肾小管时经吸收或排泄过程而形成，并且进入到膀胱而储存后通过尿道排出。这些肾小管会呈现出如缺血/再灌注等对肾脏损伤的彼此不同的敏感特性。由于肾脏不间断地履行着其作用，因此在出现暂时性干扰或疾病的情况下会带来致命结果。因此，要求开发一种能够迅速且简便地诊断出肾脏疾病的技术。
[0003]另外，初级纤毛是以从哺乳动物细胞表面伸出的微管(microtubule)为基础的非运动性细胞内小器官。在肾脏中，初级纤毛可见于除集合小管的闰细胞(intercalatedcell)之外的构成肾小管的所有上皮细胞、肾小球和肾小球囊细胞的内腔侧细胞表面。上述初级纤毛对流体流动及化学因子有反应，作为肾脏结构和功能维持中必不可少的化学和机械感觉性细胞内器官来发挥作用。初级纤毛被认为在包含多囊性肾病在内的多种病态生理性条件下与肾脏上皮细胞的增殖及分化相关联，但尚未发现是否可作为通过尿液诊断出肾脏疾病的指标来使用。
【发明内容】
[0004]摘要
[0005]本发明人为了开发出迅速、简便且对肾脏具有独特性、敏感性的肾脏疾病诊断方法而精心努力的结果，通过检测初级纤毛的组成成分和初级纤毛断片，最先发现了初级纤毛、组成初级纤毛的蛋白质以及初级纤毛基体通过多种肾脏疾病患者的尿液排出的现象，并查明上述初级纤毛或初级纤毛基体在正常对照组中不会被发现。特别是，查明了也可以在10 μ 1左右的少量尿液中确认肾脏疾病与否。尤其，所谓在尿液中检测从肾脏分离出的初级纤毛断片和组成该初级纤毛的因子(因包含乙酰化微管蛋白(acetylated tubulin)而包含组成初级纤毛的蛋白质的因子)仅表示其从肾脏的肾小管细胞脱落的情况，因此确认出这对于肾脏疾病的诊断具有高敏感度及特异性，从而完成了本发明。
[0006]技术方案
[0007]本发明的目的之一是提供一种用于诊断肾脏疾病的尿液检查用组合物，该组合物包含用于特异性地检测从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的制剂。
[0008]本发明的另一目的在于提供一种用于诊断肾脏疾病的尿液检查用试剂盒，该试剂盒包含用于吸附或收容从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分，或者用于分离从肾脏组织分离出的初级纤毛或初级纤毛基体的衬底。
[0009]本发明的又一目的在于提供一种检测从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的方法，该方法包括从分离出的尿液样品中确认初级纤毛或其组成成分或者初级纤毛基体或其组成成分的存在与否的步骤。
[0010]本发明的又一个目的在于提供一种诊断肾脏疾病的发病或经过的方法，该方法包括以下步骤:从分离出的尿液样品中确认从肾脏组织分离出的初级纤毛或其组成成分或者从肾脏组织分离出的初级纤毛基体或其组成成分的存在与否、浓度或初级纤毛的长度。
[0011]有益效果
[0012]本发明的尿液检查用组合物及试剂盒具有通过从肾脏疾病患者的尿液中检测出初级纤毛或其基体或者组成该初级纤毛或其基体的蛋白质而迅速且简便地检测患有肾脏疾病与否的优点。
【附图说明】
[0013]图1是表示初级纤毛的形态和初级纤维蛋白质的图。
[0014]图2是表示利用作为初级纤毛基体的组成成分的Arll3b抗体对缺血/再灌注(1/R)损伤24小时后的尿液样本进行免疫荧光染色并通过显微镜观察到的结果(左侧-对照组；右侧-缺血/再灌注损伤组)的图。
[0015]图3是表示在缺血/再灌注损伤之后测定肾脏形态的结果和测定血浆内肌酸酐浓度的结果的图。在第0日对鼷鼠的两侧肾脏执行了 30分钟的缺血处理和假手术(sham operat1n)。(A)确认了上述鼷鼠的按时间经过的血楽内肌酸酐浓度(n = 6pertime point，每一时间点)。其结果用平均土标准偏差来表示。*，P<0.0Olvs.各自0天(respective Oday) (before surgery，手术前)。(B)为表示经PAS染色的肾脏薄片的照片，不出了相当于假手术(Sham)、缺血后1日(lday after ischemia)、缺血后8日(8dayafter ischemia)和缺血后 16 日(16day after ischemia)的肾脏薄片。
[0016]图4a至4e是表示在缺血/再灌注损伤之后初级纤毛的变化的照片和图表。
[0017]具体来讲，对鼷鼠的两侧肾脏进行了 30分钟的缺血处理，在缺血处理之前及在缺血处理之后经过1日、8日及16日的时间点进行了肾脏摘除。(a)利用抗-乙酰化微管蛋白抗体和其它抗体(抗-Na+-K+_ATPase抗体(b，d)、抗_AQP_1抗体(c)或抗_AQP_2抗体(e))对肾脏薄片进行了双重染色。此时，PI表示经染色的细胞核(蓝色)。在测定长度的情况下，对每个肾脏测定了 30个初级纤毛的长度(η = 3)，并求出了其平均值。其结果用平均土标准偏差来表示。在各图中，箭头表示初级纤毛。
[0018](b)表示分别拍摄皮质部(cortex)和外侧髓质部(outer medulla)的图。与近端肾小管(proximal tubule)相比在远端肾小管(distal tubule)Na/K-ATPase (绿色)表现得更强烈。具体来讲，在缺血后经过1日的时间点，呈现出与髓质部相比肾小管细胞在外侧髓质部损伤得更加严重的结果。初级纤毛(绿色)在内腔中能被观察到，并且上述纤毛的长度根据地域(肾小管)不同。与皮质部相比，上述纤毛的长度在外侧髓质部变化更加显著。
[0019](c)表示分别拍摄外侧髓质部(outer medulla)和内侧髓质部(inner medulla)的图。在缺血之后，AQP-1-培养(红色))Henle细胞的薄下行支初级纤毛长度在内侧或外侧髓质部不会根据位置发生变化。在缺血之后经过1日的时间点纤毛长度为正常，并在缺血之后经过8日的时间点变长，在缺血之后经过16日的时间点又恢复正常。
[0020](d)是拍摄皮质部及外侧髓质部中的远端肾小管细胞的图。Na/K-ATPase (绿色)在远端肾小管细胞中表现得强烈。初级纤毛(绿色)在内腔中能被观察到。在缺血之后经过1日的时间点上述纤毛的长度为正常，并在缺血后经过8日的时间点有所增加，在缺血之后经过16日的时间点又恢复正常。
[0021](e)是拍摄内侧髓质部、外侧髓质部及皮质部的图。AQP2(红色)作为集合管细胞的标记来使用。初级纤毛的长度在集合管细胞中依赖于它们的位置及缺血后的经过时间而发生变化。在缺血之后经过一日的时间点，初级纤毛的长度在皮质部和外侧髓质部的集合管细胞中减少，在缺血之后经过8日的时间点，初级纤毛的长度在上皮质部、外侧髓质部及内侧髓质部的集合管细胞中增加，在缺血之后经过16日的时间点，初级纤毛的长度在皮质部、外侧髓质部及内侧髓质部的集合管细胞中又恢复正常。*，p〈0.05vs.day 0；#, p<0.05vs.其它组经过 1 日(other groups at day 1) ；$, p<0.05vs.其它组经过 8 或 16日(other groups at day 8orl6)。
[0022]图5的㈧是表示在缺血之后所显示的时间进行尿液收集后，利用抗-乙酰化微管蛋白抗体、抗_arll3b抗体、抗-GAPDH抗体、抗-CP1-17抗体和抗-β -肌动蛋白抗体对10 μ 1尿液进行蛋白免疫印迹的结果(η = 4)的图。乙酰化微管蛋白和arll3b的表现在尿液中随着肾脏损伤情况的加重而增加。但是，几乎未检测到其它组成细胞骨架的蛋白质。
[0023]图5的(B)是表示血楽肌酐(plasma creatinine, PCr)浓度的图表。肾脏损伤越增加，则血浆肌酐的浓度越会增加。
[0024]图5的(C)是表示初级纤毛量与血楽:肌酐(PCr)相关性的图表。由于尿液内的初级纤毛的排泄与血浆肌酐的增加具有相关性，因此可通过初级纤毛的检测量的变化判断出疾病的进行程度。
[0025]图6是表示在具备BrdU (5_溴脱氧尿啼啶核苷，5’ -bromo_2’ -deoxyuridine)的再生性(增殖的)肾小管上皮细胞中初级纤毛的长度的照片及图表(照片-A及图表-B)。在第0日对鼷鼠的两侧肾脏执行了 30分钟的缺血处理，并在经过8日的时间点摘除了肾脏。在摘除肾脏的20小时之前通过腹腔向鼷鼠给药BrdU。利用抗-BrdU抗体(红色)及抗-乙酰化微管蛋白(绿色)对肾脏薄片进行了双重染色。利用DAPI (蓝色)染色了细胞核。BrdU表示再生出的细胞。
[0026]图7a至7c是表示在缺血之后MnTMPyP (meso-四-(3_N_甲基吡啶基)卟啉合锰)处理对初级纤毛长度变化的效果的照片及图表。在第0日对鼷鼠的两侧肾脏执行了 30分钟的缺血处理。对部分鼷鼠从实施手术第2日起每日注射MnTMPyP (MnT，5mg/kg体重(bodyweight, Bff),过氧化物生成抑制剂)或生理盐水。在实施手术之后经过8日的时间点摘除了肾脏。(a和b)利用抗-乙酰化微管蛋白(a，b)和另一种抗体(抗-Na+_K+_ATPase抗体(a, b)、抗-AQP-1抗体(a)或抗-AQP-2抗体(b))对肾脏薄片进行了双重染色。DAPI (蓝色)表示被染色的细胞核。(C)对每个肾测定30个初级纤毛的长度，并求出了其平均值。其结果用平均土标准偏差来表示(η = 3)。*，p〈0.05vs.赋形剂(vehicle)。
[0027]图8是表示在缺血/再灌注损伤之后MnTMPyP处理对肾脏中的过氧化物(A)及脂质过氧化(B)的效果的图标。在第0日对鼷鼠的两侧肾脏执行了 30分钟的缺血(ischemia)处理或假手术(sham)。对部分鼷鼠从实施手术第2日起每日注射MnTMPyP (5mg/kg bodyweight)或生理盐水。在实施手术之后经过8日的时间点摘除了肾脏，并测定了过氧化物及脂质过氧化。测定值用平均土标准偏差来表示(η = 4)。*，p〈0.05vs.sham。
[0028]图9是表示在缺血/再灌注损伤之后MnTMPyP处理对肾脏中的ERK活性的效果的图标。在第0日对鼷鼠的两侧肾脏执行了 30分钟的缺血处理。对部分鼷鼠从实施手术第2日起每日注射MnTMPyP (MnT, 5mg/kg体重)或生理盐水。在实施手术之后经过8日的时间点摘除了肾脏，并确认了经磷酸化的ERK及总ERK标准。GAPDH表现作为对