[0185] 金组
[0186] 使用血液中的前列腺特异性抗原（PSA)对前列腺癌（PC)的早期检测减少了未筛 过的人中的PC死亡。然而，由于通常使用的临界值PSA的中度特异性，对有助于在具有中度 升高的PSA的人中增强风险分类的另外的生物标志物有迫切的需求。在本研究中，应用了 重组抗体微阵列用于来自常规PSA测量的80个血浆样品的蛋白表达概况分析，所述样品基 于总PSA和％游离PSA的水平，先验分为四个风险组。结果表明，可W鉴定准确指出PC(恶 性生物标志物签名）的血浆蛋白概况并且最重要的是，其表现出与生化确定的PC风险组中 度到高度的相关性。值得注意的是，运些数据也暗示具有中等范围PSA和低％游离PSA的 风险组（其先验已知是异质性的）可W进一步分层为两个亚组，分别更像最低和最高风险 组。总么在运一概念验证研究中，因此我们已经表明与PC风险组相关的血浆蛋白生物标 志物签名可W使用亲和蛋白组学从粗制血浆样品中鉴定。运一方法从长远的角度来看可W 提供改进PC患者的风险分类的新的机会。
[0187] 材料巧方法 [018引临床样品
[0189] 我们使用来自80个年龄50-70岁的人的去鉴定的邸TA抗凝血液样品，运些人 指引进行在Sk&ne化iversityHospital,Malm0，Sweden的临床化学科室值ept.of Clinical化emistry)常规进行的PSA测试。对于运些样品没有保留临床信息或患者标 识，且样品使用前储存于-80°C(表3)。使用双重标记的DELFIAPiOSi-atus'朽，总/游离PSA 测定（Perkin-Elmer,Turku,Finland,其针对WHO96/670 (PSA-WH0)和WHO68/668 (游 离PSA-W册）校准）校准器测定游离和巧SA的水平。对于巧SA，可检测范围为从0. 10至 250ng/ml，和游离PSA为从0. 04至250ng/ml。对于测量巧SA的变异系数为《10. 6 %，和 游离PSA《7. 3%。基于％游离和总PSA的水平，所述样品分为四个组:A(n= 20)具有 巧SA《0. 70ng/ml;B(η= 20)具有巧SA为 2. 1-8.Ong/ml和 ％ 巧5八 > 27. 9 %;C(η= 20) 具有巧SA为 5. 0-10-3ng/ml和 ％ ^SA《12. 6 %;W及D(η= 20)具有巧SA为 24. 6-724ng/ ml。运四个去鉴定的样品组反映了高度不同类别的PC诊断风险或结果，其中组A具有非常 低的显著PC的长期风险，组B具有中度增加的前列腺疾病风险，但临床上有意义PC的较低 可能性，组C具有大量增加的PC风险，W及组D具有非常高的临床上有意义或晚期PC的风 险巧8-41]。遵循的方案与1975年的赫尔辛基宣言化elsinkiDeclaration) -致。
[0190] 血浆样品的标记
[0191] 根据W前优化的用于血清蛋白组的步骤巧8,29]并进行一个稍微调整，标记邸TA 抗凝血浆样品。为了防止血浆样品凝结，将邸TA添加到在整个方案中使用的PBS缓冲液 至终浓度为4mM。简单的说，所述样品在4°C，16000Xg离屯、20分钟，接着将5μ1样品稀 释45倍到4mM邸ΤΑ PBS中，得到总蛋白浓度为约2mg/ml。稀释的样品与0. 6mMEZ-Link Sul化-NHS-LC-生物素（Pierce, Rock化rd,比，USA)在冰上解育2小时，之后通过相对4mM 邸TA-PBS在4°C透析72小时，移除未反应的生物素。最终，分装样品并在用于微阵列实验 前储存于-20°C。
[0192]ScFv的生产和纯化
[0193] 从n-CoDeR库[42]选择针对62种不同的分析物（主要设及免疫调节）的 一百六十二种人重组scFv抗体片段，，并由BioinventInternationalAB(157种 scFv克隆；Lund,Sweden)和Prof.Μ. 0hlin(5 种Mucine-1 特异性克隆，Dept,of Immunotechnology,LundUniversity,Lund,Sweden)友情提供（支持信息表 3)。通 过使用ω严格隧菌体展示选择方案[42]，（ii)每种目标分析物多个克隆（《4) 和（iii)适用于微阵列应用的分子设计[26,27]确保运些隧菌体展示衍生的scFv抗 体的特异性，亲和力（在1-lOnM范围内），W及忍片上的功能。另外，几种抗体的特 异性/反应性模式W前已经使用良好表征的血清样品W及正交方法验证，所述方法 例如ELISA，MesoScaleDiscove巧(MSD)，细胞计数珠阵列（CBA)和质谱法（M巧， W及使用强化和阻断实验（spikingandblockingexperiments)(支持信息表3) 巧1，33, 34, 36]。所有的scFv在100ml大肠杆菌培养物中产生，并使用亲和层析在Ni2+-NTA 琼脂糖（Qiagen,Hilden,Germany)上从表达上清中纯化。使用250ml咪挫（Saveen Werner,Ma!m0，Sweden)洗脱结合的分子，相对PBS透析，然后在用于微阵列实验中之前 储存在 4°C。通过 10%SDS-PAGE(Invitrogen，Carlsbad,CA,USA)评价scFvs的完整性和 纯度。通过测量280nm处的吸光度确定蛋白浓度。
[0194] 抗体微阵列的生产和处理
[019引 简单的说，使用非接触式分配器（SciFlexarrayerS11,Scienion,Berlin,German y)产生scFv微阵列并根据W前优化的配置处理巧8,29]。将总共180种scFv和对照W8 个重复排列到BlankPolymerMaxiso;rp载玻片上（NUNCA/S,Roskilde,Denmark),每个位 置一滴（300pL)，scFv浓度为0. 05-0. 4mg/ml。所述180种探针排列为Ξ列，每一列包含60 行（图1Α)。AlexaFlou;r-647标记的链霉亲合素（lOug/mD印制（print)为阳性对照，并包 括印制缓冲液（PB巧作为阴性对照。印制后，允许所述载玻片干燥并在溶于PBSo/n的5% (w/v)脱脂牛奶（SemperAB,Sun化yberg,Sweden)中封闭。然后将所述载玻片置于蛋白阵列 工作站（PerkinElmerLifeMnal}fticalSciences,Wellesley,MA,USA)上并使用溶于PBS 的0. 5 % (w/v)Tween-20 (PBS-T)洗涂四分钟。接着，注入W1:2稀释于溶于PBS的1 % (w/v) 的脱脂牛奶粉末W及1% (v/v)Tween-20中（PBS-MT)的70μ1的标记的样品，并随揽拌解 育60分钟。第二次洗涂后，将所述阵列与350μ1溶于PBS-MT的1μg/mlAlexa-647缀合的 链霉亲合素溫育60分钟。洗涂后，所述阵列在氮气流下干燥，并使用共聚焦微阵列扫描仪 (ScanArrayExpress,PerkinElmerLife&AnalyticalSciences)WSym的分辨率扫描， 使用五种不同的扫描仪设置（50 %PMT增益和70 %激光功率巧0/70)，70/70, 80/80, 80/90， 和 90/90)。使用ScanArrayExpress软件版本 4.0(PerkinElmerLifeMnal}ftical Sciences)量化信号强度。减去局部背景，并为了补偿任意可能的局部缺陷，自动排除两个 最高的和最低的重复。呈现的信号强度代表剩下的四个重复点的均值。仅考虑未饱和的点 用于分析。
[0196] 微阵列数据标准化
[0197] 使用半全局标准化方法巧2, 33]进行了数据组的忍片对忍片标准化，其与对DNA 微阵列开发的标准化相似。首先对于每个分析物计算变异系数（CV)并排名。鉴定了在所 有样品中展现出最低CV值的百分之十五的分析物，对应24种分析物，并用于计算每个样品 的忍片对忍片标准化系数。通过公式Ni=Si/μ计算标准化系数Ni，其中Si是对于每份 样品的所述24种分析物的信号强度的和，而1是对所有样品平均的24种分析物的信号强 度的和。从一个样品生成的每个数据集除W标准化系数Ni。将信号强度的Log2值用于进 一步的分析。
[0198] 数据分析
[0199] 基于巧SA和％ ^SA的值将80个患者样品分为四组（η= 20)。对于初始分类分 析，四个风险组的每一个分为训练集（η= 15)和测试集（η= 5)。为了将样品分类，我们 使用了支持向量机（SVM)，一种R中的监督学习方法。使用线性核函数进行监督分类，将约 束成本（costofconstraint)设置为1，其为R函数SVM的默认值，且没有为了避免过度 拟合进行尝试来调整它。使用训练集训练SVM模型接着冻结，接着应用到测试集。在训练 SVM之前没有进行数据的过滤，即来自阵列上的所有抗体的数据都纳入分析中。此外，使用 SVM判定值，构建了接受者工作特征（R0C)曲线，并计算了所述曲线下的面积（AUC)。使用 Cluster和Treeview[44]中的无监督层次聚类，可W将C组分为两个亚组，表示为C1(η= 10)和C2(η= 10)。由于较小的样品数量，在运种情况下不可能分为训练和测试集，因此使 用留一法交叉验证方案训练SVM。基于相对蛋白水平限定并使用威尔科克森符号秩检验鉴 定了显著上或下调的血浆蛋白（Ρ<〇.〇5)。使用主成分分析（PC)软件程序（QlucoreOmics Explorer,Lund,Sweden)和 / 或ClusterandTreeview使样品可视化。
[0200] 验证实验
[0201] 为了验证抗体微阵列结果，在所有80个邸ΤΑ-血浆样品上运行人化1 /化210-P1ex MSD(MesoScaleDiscoveiy,Gaithersburg,MD,USA)测定。MSD96-板的每个孔在空间上 不同的电极点已经使用针对TFN-屯IL-!过，IL-2,比-4,IL-5,比-8,IL-10,比-1化70,比-13 的抗体预功能化。根据制造商提供的方法运行所述测定，并在MSDSECTOR饭仪器中进行 基于电化学发光的读出。检测限定义为标准曲线中标准偏差超过零点的2. 5倍的信号。
[0202] 结果
[020引在本研究中，我们进行了来自80个不同水平的患PC风险的患者的未分级的，生物 素化的邸TA-血浆样品的蛋白表达概况分析，使用我们内部研发的重组抗体微阵列。所述 样品已经基于巧54和％ ^SA先验分为四个组，反应不同种类的PC诊断或结果风险（表 3)。
[0204]scFv微阵列评价
[0205] 代表性的微阵列图像示于图1A中，证明得到了均质的点形态，高信噪比，W及动 态信号强度。所有的80个样品都成功的进行了概况分析；因此，来自所有80个样品的阵列 数据可W用于后续的统计分析。通过分析点对点变化评估了测定内重复性，得到了平均判 定系数巧2)为0.95(图1B)。分析间重复性，即阵列对阵列变化，通过在独立的阵列上分析 单个样品评价，得到R2值为0. 96 (图1C)。
[0206] 风险组分类
[0207] 首先，我们确定了四个前列腺癌风险组的聚焦的（62种分析物）血浆蛋白组概况， 所述四个组表示为A-D(表3)，其中组A显示出最低的风险而组D显示出最高的风险。使用 威尔科克森符号秩检验，鉴定了 3至44种差异表达（p<0. 05)的血浆分析物，其示于图2A 中的热图中。该数据表明，仅3种分析物在两个最低风险的组，A和B之间差异表达。因此， 如可W从临床观点预期的，该数据暗示在两个最低风险的组之间只有很小的差异。相反，在 组A，B或C相对最高风险组D，观察到了 37,44和30种失调的分析物，表明大（较大）的 差异。更具体的，发现几种补体蛋白（例如C3，C4，Clq，因子B和备解素）在高风险组D中 下调，而上调的分析物表现出TH1 (例如，比-2,比-3和INF-a)和T肥（例如，比-4,比-10) 细胞因子两者的复杂模式。最重要的，区分组A(非常低的PC风险）相对组D(非常高的临 床上有意义或后期PC的风险）的生物标志物签名可W视为准确确定PC的恶性生物标志物 签名。
[020引接着我们评价了阵列平台基于观察到的蛋白表达概况将所述四个风险组（A至D) 分类的能力。为此，每个患者组分为训练集（75%的样品）和测试集（25%的样品）（图2B)。 因此，在训练集上训练SVM模型并接着应用到独立的测试集上。结果表明，风险组可W使用 不同的准确度来区分，其中组B和组D表现出AUC为0. 68,组A和BAUC为0. 84 (仅基于 Ξ种分析物），和组A和DAUC为0. 72 (图2C)。因此，该数据表明，恶性签名可W用于很好 的区分组A(非常低的风险）和组D(非常高的临床上有意义或后期PC风险）（见图2A和 2C)。相反，不能将组C从任意的其它Ξ个风险组区分（在所有情况下AUC= 0. 5)。在此背 景中，应当注意C组代表了异质的患者组（中等范围巧54，低％游离PSA)，其中仅25-50% 事实上患有PC，虽然所有的都选择进行活组织检查测试。因此，对运一异质患者组的分层可 能是用于鉴定较高或较低风险形成PC的患者的潜在关键工具。
[0209] 风险组C的分层
[0210] 为了研究风险组C是否能够进一步分层，我们基于未过滤的数据进行了无监督层 次聚类，即使用来自阵列上包括的所有抗体的数据。结果表明，C风险组确实可W分为两个 不同的亚组，表示为C1和C2(图3A)。相似的，使用主成分分析（PCA)也观察到了C群的明 确细分（图3B)。此外，对于C1相对C2观察到了 49种显著差异（p<0. 05)表达的血浆分析 物（图30。更详细的，Ξ种补体蛋白在C1中上调（Clq、因子B和C4)，而剩下的差异表达 蛋白在C1中下调。后一组分析物包括一些细胞因子（例如，IL-6和IL-4)，补体蛋白（例 如，C1-INH和Cls)，W及细胞表面蛋白（例如，ICAM,HLA-DR,Mucine-1和CD-40)。总的来 说，该数据表明异质风险组C可W使用大量失调的分析物分层为两个不同的亚组，C1和C2。
[0211] 为了验证阵列数据，应用了独立的10-plex细胞因子夹屯、抗体微阵列（MSD)(图3D 和3E)。在C1相对C2中观察到的TNF-α(图3D)和IL-8 (比-8)(图3E)的下调可W通过 MSD数据验证。
[0212] 亚组C1和C2的风险分类
[0213] 为了评估对风险组C的分层细分的生物学影响，将亚组C1和C2的蛋白表达概况 与其它Ξ个原始风险组Α，Β和D的那些比较。在C1的情况下，结果表明C1可W很好的从 风险组D区分（AUC= 0. 82)，但不能从风险组A和Β区分（在两种情况下AUC= 0. 5)(图 4A)。此外，对于C1相对D，观察到了 47种差异表达的分析物，但对于C1相对A和B，分别 仅观察到了 16和15种（图4B)。在前一种情况下，在Cl相对D中观察到了上调的补体蛋 白（例如，Clq，C3,和因子B)W及下调的细胞因子（例如，TGF-al，比-Ira，比-6和MCP-1) W及细胞表面标志物（例如，ICAM，CD40和Lewis讶的模式。
[0214] 相反的，结果表明C2可W很好的从风险组A(AUC= 0. 72)和B(AUC= 0. 75)两者 区分，但不能从风险组D区分（AUC= 0. 57)(图4C)。在运种情况下，对于C2相对A和B， 分别观察到了 22种和28种失调的分析物，但对于C2相对D仅5种（图4D)。虽然在C2相 对A中仅观察到了两种下调的分析物（Clq和IL-4)，在C2相对A和B两者中都观察到了上 调的细胞因子（例如，比-lra，MCP-l,和比-6)和细胞表面标志物（CD40，LewisX和唾液酸 化的Lewis讶的模式。综上所述，结果表明，C1与最低风险组A和B更相似，而C2表现出 与最高风险组D较高的相似性，表明C1组代表低风险患者而C2组代表高风险患者。
[021引最后，为了进一步突出生物学相关性，我们比较了区分风险组A(非常低的风险） 相对风险组D(非常高的临床上有意义或后期PC风险）的恶性签名（33种生物标志物）（图 2A)与W上签名的对应标志物的表达水平的重叠（图4E)。数据表明，恶性生物标志物签名 中一个显著的部分也在C1相对C2 (33种生物标志物的27种）和C1相对D(33种生物标志 物的29种）的情况下差异表达，而与区分A相对C2和B相对C2的签名的重叠明显较小。 因此，该数据进一步表明了准确确定PC的恶性生物标志物签名的生物学相关性。
[0216] 讨论
[0217] 血浆是一种微创且临床公认的样品形式，其可W是用于PC的早期检测和风险分 类的生物标志物的理想来源。因此，为了运一目的它也在大量的大规模的蛋白组工作中评 估[19,20]。然而，由于血浆样品关于蛋白数量和动态范围的固有复杂性，已有争论对未 分级样品的经典蛋白组学分析对于分类PC将不太可能有用巧1]。虽然预分级降低样品的 复杂性，但其相应地与关于曲解的蛋白产量/恢复，W及重复性和灵敏度的严重问题相关 巧2,23]。在运种情况下，我们最近显示由重组抗体微阵列代表的亲和蛋白组学可W用于在 粗制的蛋白组中概况分析高W及低丰度的分析物巧6, 27]。之前，单个血清标志物血小板反 应蛋白-1(1：虹〇11113〇3口〇]1(1;[]1-1，了5口-1)，被证明能够使用抗体微阵列区分良性和恶性的前列 腺疾病[45]。在运一概念验证研究中，我们使用了亲和蛋白组学祀向粗制血浆样品，为了破 译第一个与PC风险组相关的多重（multiplexed)候选血浆蛋白生物标志物签名。因此，基 于微阵列的重组抗体PC分析证明是朝向确定下一代PC相关生物标志物的潜在路线。
[021引血浆蛋白组由经典的血浆蛋白W及组织泄露蛋白两者组成。人免疫系统感知机体 内稳态中甚至微小变化（从细菌感染到生长肿瘤）的固有的能力提供了使用免疫系统作为 疾病的遥控器和早期的传感器的独特机会[46]。实际上，免疫签名已经获得了显著地兴趣 [47]，特别是由于最近的研究表明免疫监控作为肿瘤发展的一个重要因素[48]。为此，我们 已经设计并应用了主要祀向免疫调节分析物的重组抗体微阵列巧6,27]。W前我们已经证 明了我们的阵列设计用于癌症诊断巧2, 33]，基于证据的治疗选择巧引W及预测乳腺癌复 发风险巧7]的潜力。在本发现研究中，我们已经延伸了应用的范围，并表明了其用于PC中 风险组封层的潜在用途，其清晰的区分了两个最低相对最高风险组。
[021引对潜在PC患者的风险分类现在可W在临床中使用血清PSA测定（tPSA和％游离PSA) [49]进行，其为几种用于风险分类模型的一种巧，50, 51]。虽然运一方法使得能够检 测许多肿瘤，对于恶性疾病的低特异性导致几个患者经受不必要的活组织检查测试巧]。如 果临床医生能够获得更胜任的风险分类工具，运一数量可w显著减少。特别是，具有中等 巧SA(4-1化g/ml)和低％ ^SA的患者群体已知是异质的，包括PC和良性前列腺增生的混合 [7, 49]。在我们将四个预确定的风险组分类的尝试中，结果表明实际上所述具有中等巧SA 和低％ ^SA的患者群体（组C)不能从任意的其它Ξ个风险组区分。因此，我们的数据进 一步支持目前的观点，即组C是非常异质的患者组。
[0220] 然而，我们的数据更确切的表明C组可分为两个不同的亚组，C1和C2,其正如目前 的文献预期的巧，3, 5, 49]，分别更像两个最低和最高的原始风险组。当旨在癌症患者的个 性化治疗时，将异质的患者组分层为更准确的较高或较低风险患（形成）特定癌症的亚组 的能力将是有帮助的。从长远来看，运可W提供管理PC癌症患者的新的机会。然而，运一 发现研究部分受限于纳入的患者的完整临床资料并不在手的事实，而观察到的候选生物标 志物签名将在祀向更大的、独立的良好表征的患者群的后续研究中适当地验证。值得注意 的是，可W使用用于初始验证的正交方法（MSD)检测的两种细胞因子IL-6和TNF-0支持我 们对C1相对C2的区分。
[022。 当更详细的检查生物标志物签名时，观察到了新的W及一些已知反映高和低PC 风险的生物学相关分析物。简单的说，已经表明TGF-al与PC相关，例如在PC模型中促 进细胞进展，较高的肿瘤分级，W及转移，并随后已经提出作为一个暂定的生物标志物 [3, 4, 52]。相应的，我们发现TGF-al在两个最低风险组，A和B中相对于最高风险组，D下 调。另外，它也在A和B相对C2(高风险），C1(低风险）相对D，W及在C1相对C2中下 调。对于IL-6,运一细胞因子也被建议作为潜在的PC生物标志物巧，4]。我们的数据表明 IL-6在低风险组（A，B或C1)分别相对高风险组值或C2)的多个比较中下调。此外，其它 已知在低风险组中下调的细胞因子，例如IL-lra和MCP-1 [53, 54]，也发现在低风险组（A， B或C1)相对高风险组值或C2)的不同比较中下调，进一步支持我们报道的观察。另外， LewisX在低风险组中下调的观察与W前的结果一致，表明LewisX是前列腺癌中的预后参 数[5引。应当注意运些观察也支持观察到的候选恶性生物标志物签名准确确定PC。迄今， 补体蛋白没有在PC的背景中显著地报道。我们的数据表明几种补体蛋白例如Clq、C3、C4、 备解素和/或C1-INH的不同组合，在多个低风险组分别相对高风险组中上调。虽然W前没 有在临床研究中报道，已经证明Clq在前列腺癌细胞系中显示出保护作用[56]。
[022引综上所述，使用亲和蛋白组学，我们已经描绘了与PC风险组化及PC相关的候选血 浆生物标志物签名。祀向独立的患者群，该结果表明基于临床参数先验确定的传统的风险 组可W分层，甚至进一步亚分层，从而潜在的描述了新的、优化的PC风险组。
[0223] 参考文献
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