用于使用多种染料评估分子链片段长度的方法
【专利说明】
【背景技术】
[0001]基于片段长度电泳分离核酸(DNA/RNA)链(借助凝胶或毛细管)是实验室遗传学中广泛使用的工具。该方法用于评估DNA/RNA样品中片段长度的分布。电泳分离之后的DNA/RNA可视化依赖于将一种或多种染料分子附着于DNA/RNA。可以使染料分子激发荧光以确定DNA/RNA在凝胶柱、通道或其他通路(除非另外表明，在下文中统称“通路”)中的位置，DNA/RNA沿该凝胶柱、通道或其他通路穿过电泳。DNA/RNA片段长度分布的解释一般依赖于与至少一个尺寸参照物，且优选地多个尺寸参照物之间的比较，该尺寸参照物是由分离的、已知尺寸的DNA/RNA( “标记物”)组成的。标记物可以以不同的形式实现，但常用的优化尺寸准确度的方法是使标记物包括在与片段化DNA/RNA相同的电泳通路中。
[0002]一个目前用于使用电泳评估DNA/RNA片段的尺寸的优选方法包括，在开始电泳将已知的标记物包括在这种片段的样品内，即使用内部标记物。然而，由于DNA/RNA样品和标记物通常均结合有相同的染料以便使其在通路内可视化，因而如果存在大浓度的与标记物同样尺寸且具有相同长度的DNA/RNA片段，则可能难以或不能区分这二者。在这种情形下，来自附着至DNA/RNA样品片段的染料的荧光将经常掩蔽标记物染料的荧光。该后果导致对DNA/RNA片段长度的不准确尺寸估计，以致于不能区分内部标记物以提供用于对比的参照。
[0003]掩蔽内部标记物的荧光信号的问题可以通过选择允许它们区别于样品的尺寸的内部标记物，而在很大程度上得以避免。例如，B1analyzer 2100毛细管电泳系统(AgilentTechnologies)利用具有一种非常小(?15_50bp)且另一种非常大(?1.5_17kbp)的两种内部标记物的系统以自动评估DNA/RNA的片段长度分布。通过选择不同长度的内部标记物，在统计上最小化了样品DNA/RNA和标记物之间片段长度显著重叠的可能性。
[0004]虽然使用不同长度的内部标记物可以绕过上述掩蔽的问题，但当内部标记物为更近似样品的尺寸时，片段长度估计的结果会改善:可以通过使用更适合尺寸的内部标记物提供更准确的DNA/RNA片段长度估计，然而，这样做增加了不希望的荧光掩蔽的可能。
[0005]另一种用于使用电泳估计DNA/RNA片段尺寸的途径包括使用外部标记物，即将标记物引入与加载有DNA/RNA样品的通路(泳道，laneway)相邻的通路中。在电泳完成后，可以通过将它们与外部标记物通路比较，估计样品通路中的片段长度。
[0006]可以适当选择外部标记物片段的尺寸以匹配样品片段的尺寸范围；它们之间没有任何重叠或荧光饱和的可能性(机会)。然而，由于外部标记物和DNA/RNA样品之间施加的电流和通路(泳道，laneway)基质组成(matrix composit1n)的差异可以混淆尺寸的估算，因此该比较不是最佳的。此外，实际的样品成分可以影响片段的移动性，因而通道之间相同分子的迀移速度可以取决于剩余的样品组成而不同。为了消除(解决，account for)差异并改善片段长度估计，最好将标记物与DNA/RNA样品包括在同一通路中。
[0007]最后，另一种用于评估片段长度的方法包括将具有独特的激发/发射光谱的荧光染料的内部标记物标记在DNA/RNA分子的末端。然而该方法具有局限性。因为仅将染料分子附着于内部标记物的末端，由这种标记物分子发出的任何信号都非常小，且仅可由高灵敏度的、高成本的，不与凝胶电泳相兼容的探测器(检测器，detector)探测。此外，较大的标记物(即大于2500bp)具有过高的DNA/RNA片段/染料分子比例。并且，因为可以加载的标记物的绝对质量具有实际的上限，该比例阻止了使用大的内部标记物，即使是用于具有高灵敏度探测器的分析系统(即毛细管系统)。
【发明内容】
[0008]考虑到上述与现有技术相关的不足，本发明致力于，用于使共用电泳通路中的DNA/RNA样品与内部标记物分开地可视化的方法，以辅助估计样品内的DNA/RNA片段长度。因此，可以选择一种或多种内部标记物，为了最大的比较值，可以将其在估计DNA/RNA样品的片段长度分布过程中嵌入(nesODNA/RNA样品片段的分布内。有利地，消除了由DNA/RNA片段的(荧光信号所致的)内部标记物荧光信号掩蔽的历史问题，而内部标记物的荧光信号强度仍足以在即使是较不灵敏的电泳装置中使用，诸如使用CCD或M0SFET显像硬件(例如，传统数字照相机技术)和/或非相干照射硬件(non-coherent illuminat1nhardware)(例如，传统LED技术)的那些。
[0009]本发明包括使用用于样品中的DNA/RNA样品片段以及至少一种内部标记物的多种焚光染料，以在电泳装置中实现并发焚光(concurrent fluorescence)并产生非竞争性(non-competing)发射光谱，和/或实现顺序荧光以类似地产生非竞争性发射光谱(但在时间上是分开的)。
[0010]如果期望增强的片段长度分辨率，相对于单染料标记物组合，根据本发明可以使用多个内部标记物和/或染料。因此，根据本发明的方法包括在内部标记物的整个长度中，将任何内部标记物使用至少一种，并且优选地多于一种的独特(unique)染料分子标记。这使得尺寸估计方式与经常同凝胶电泳使用的低成本探测器方式(例如，光学照相机)相兼容。其也实现了上文中的多种染料方法对较大的内部标记物(例如，〉?2500bp)的利用。
[0011]除了增加的灵敏度和片段长度选择性，在实施各种发明实施方式时使内部标记物独立地(排他地，exclusively)可视化的能力，排除了加载内部标记物的绝对质量的需要，在其他情况下其将从研究中的(所关注的)DNA/RNA的荧光信号中可靠地区分。因此，通常小于10%的原始内部标记物对达到期望的说明(阐释，elucidat1n)是必需的，在其他情况下在不使用根据本发明的多染料方案下其将是必需的。相对于现有技术单染料方案的这种减少预计可节省大于50%的运行成本，此外在实施本发明的双染料实施方式时，增加DNA/RNA片段评估的准确度。不言自明，技术人员不再需要具有对于，DNA/RNA样品中潜在的过量的片段长度(其可能掩蔽来自所选择的内部标记物的信号)的详细预知。因此根据本发明的多种染料方法还将减少进行片段长度分布评估过所需的时间。
[0012]在一系列的发明实施方式中，第一染料在由第一激发方式，诸如受限波长光源激发荧光时具有第一发射光谱，其关联至至少一种标记物，并且第二染料在由第二激发方式，诸如不同于第一激发方式的受限波长光源激发荧光时，具有不同于第一染料的第二发射光谱，其关联至多个DNA/RNA样品片段，其中将该DNA/RNA样品片段和至少一种标记物置于共同的凝胶电泳通路中。同时由第一和第二激发方式激发至少一部分的通路，从而使两种染