专利名称：测定染料、抗体、药物和药物前体分子在多肽分子上相对吸附常数的方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体地说，本发明涉及一种利用扫描隧道显微技 术Scanning Tunneling Microscopy, STM)测定染料、抗体、药物和药物前体等分子在多肽 上相对吸附常数的方法。
背景技术：
在药物设计和开发研究中，解析靶标蛋白与药物相互作用的模式和结合本质是 极其重要的，一般可以用高通量的蛋白质结晶和高分辨的X射线晶体衍射技术、二维核磁 共振技术来进行研究(可参考 Daniel Picot, Patrick J. Lollet al.，Nature 1994，367， 243. R Aneta Τ. Petkova, Yoshitaka Ishii et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 2002, 99，16742.)。现在X射线晶体衍射技术已经很成熟，但由于一些重要的蛋白(例如膜蛋白，淀粉 样蛋白)分子本身的难结晶性，很难获得高质量的晶体学数据来研究药物分子与蛋白的相 互作用。另外，即使获得了蛋白和药物分子的共结晶，药物在靶标蛋白上的结合位点也很难 保证具有周期性，所以解析药物分子与蛋白的相互作用仍然困难重重。核磁共振技术可以 精确解析溶液中的分子结构，避开了结晶的困难，但能解析的分子质量有限制。现也有大量研究基于超级计算机，进行分子模拟并实现可视化，得以模拟蛋白与 蛋白或蛋白与小分子相互作用的动态过程，解析药物作用的结构基础，并设计新的药物分 子。但是计算机模拟与实验研究之间不可避免的存在着一些差距。所以急需发展实验研究 方法获得药物分子与蛋白或多肽相互作用的作用位点和直观图像，在分子尺度上研究药物 分子在蛋白或多肽上的吸附能力。本发明发展了一种新方法，利用扫描隧道显微技术测定 染料、抗体、药物和药物前体等待测分子在多肽上的相对吸附常数。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种测定待测分子在多肽分子上相对吸附常数的方法， 该方法包括如下步骤1)将多肽分子和标记分子进行组装，获得多肽分子与标记分子的组装体的扫描隧 道显微镜图像；2)将多肽分子、标记分子和待测分子进行组装，形成组装体，以获得所述待测分子 在多肽分子和标记分子上吸附的扫描隧道显微镜图像；3)对比步骤1)和步骤2)中获得的扫描隧道显微镜图像，统计待测分子吸附在多 肽分子以及标记分子上的吸附数量；4)将步骤幻获得的待测分子在标记分子上的吸附数量归一化为单位1，确定待测 分子在多肽分子上的相对吸附常数。优选地，在所述步骤1)中，所述组装体的制备方法包括如下步骤
i)将所述多肽分子与所述标记分子充分混合，形成混合液；ii)将步骤i)得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基 底以及硅等半导体基底表面，以形成组装体。其中，多肽分子与标记分子形成组装体，可以除去溶剂在固/气界面获得组装体 的扫描隧道显微镜图像，也可保留溶剂在基底/溶液界面获得组装体的扫描隧道显微镜图 像。优选地，在所述步骤2、中，所述组装体的制备方法包括如下步骤i)将所述多肽分子、所述标记分子以及所述待测分子充分混合，形成混合液；ii)将步骤i)得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基 底以及硅等半导体基底表面，以形成组装体。其中，多肽分子、标记分子以及待测分子形成组装体，可以除去溶剂在固/气界面 获得组装体的扫描隧道显微镜图像，也可保留溶剂在基底/溶液界面获得组装体的扫描隧 道显微镜图像。优选地，在制备组装体中，采用超声来充分混合。优选地，在制备组装体中，所述导电性基底为石墨，所述石墨优选为新解理的高定 向石墨。高定向石墨具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，适于扫描隧道显 微镜的研究。优选地，在制备组装体中，还包括除去所述基底表面残留液的步骤，优选地，可以 采用吹惰性气体(例如氮气)的方式来除去所述基底表面的残留液。其中，可以除去溶剂在固/气界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像，也可保留 溶剂在基底/溶液界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像。优选地，所述待测分子为染料、抗体、药物或药物前体分子等。优选地，所述染料为酞菁、吓啉类分子及其衍生物，刚果红、硫磺素、姜黄素及其衍 生物；所述抗体为淀粉质多肽分子抗体；所述药物为吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮杂环 类分子及其衍生物，例如4’ 4-联吡啶，乙烯吡啶，三吡啶，刚果红，姜黄素；所述药物前体为 硫磺素。优选地，所述多肽分子为五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚组氨酸。本发明以五聚 丙氨酸、八聚苯丙氨酸和八聚组氨酸为例，其他多肽也可以，例如beta淀粉样多肽及其片 段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚多肽、嵌段寡聚多肽、人工序列多肽等。优选地，所述标记分子为吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯类氮杂环分子及其衍生物， 例如4’ 4-联吡啶、乙烯吡啶，三吡啶、嘧啶等，优选地，所述标记分子为4’ 4-联吡啶。综上所述，本发明的目的在于发展一种基于扫描隧道显微镜的新方法，在分子水 平上研究蛋白或多肽与小分子的相互作用，测定染料、抗体、药物和药物前体等待测分子在 多肽上的相对吸附常数。在利用扫描隧道显微镜来测定染料、抗体、药物和药物前体等待测分子在多肽上 相对吸附常数的方法中，获得多肽分子自组装结构的STM图像之后，或通过与标记分子的 共吸附获得多肽-标记分子的共组装结构的STM图像之后，加入染料、抗体、药物和药物前 体等待测分子，得到待测分子在多肽上的结合位点和吸附数量，并在分子水平上研究多肽 和待测分子的相互作用，测定待测分子在多肽上相对吸附常数的方法。
本发明的一个实施方案通过识别多肽分子组装特征，来测定染料、抗体、药物和药 物前体等待测分子在多肽上相对吸附常数，包括如下步骤1)制备多肽分子(或与标记分子共混)溶液，超声10分钟；2)在多肽分子的溶液中，或多肽分子与标记分子的混合溶液中，加入染料、抗体、 药物或药物前体等待测分子溶液，使其充分混合；3)混合之后，取15微升溶液滴在新解理的高定向石墨表面，静置10分钟；4)用高纯氮气把残留在石墨表面的溶液吹走；5)用扫描隧道显微镜来进行测定，统计出高分辨扫描隧道显微镜图像中染料、抗 体、药物或药物前体等待测分子在多肽分子上的结合位点和吸附数量，并得到吸附常数的 相对关系。本发明至少具有以下有益效果本发明利用扫描隧道显微镜对染料、抗体、药物或药物前体等分子在多肽上的相 对吸附常数进行测定，能清楚地识别多肽分子二维组装的方向性，并在此基础上，通过加入 染料、抗体、药物或药物前体分子后得到分子在多肽上的结合位点和吸附数量，并由此得到 不同多肽对于分子的相对吸附能力，即分子在多肽上的相对吸附常数。本发明利用扫描隧道显微技术，可在分子水平上研究药物分子与蛋白质分子的相 互作用，药物分子在蛋白分子上的作用位点和吸附能力，不受蛋白结晶性的影响，也不受结 合信号强弱的影响。本发明采用多肽分子与标记分子形成组装体，或者采用多肽分子、标记分子以及 待测分子形成组装体，可以除去溶剂在固/气界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像，也 可保留溶剂在基底/溶液界面获得组装体的扫描隧道显微镜图像。本发明采用的高定向石墨具有原子级平整的表面，在很多环境中都很稳定，适于 扫描隧道显微镜的研究。本发明对于解析靶标蛋白与药物相互作用的模式和结合本质具有 非常重要的意义。本发明可以用于在新药早期研究阶段中标靶的确定，不同序列蛋白对于药物分子 的吸附能力等的测试。特别在治疗神经退行性疾病中，研究淀粉样蛋白的聚集机理及其与 药物分子的相互作用机理，利用分子水平的证据来寻找可能的药物靶点，从而对寻找和设 计有效的调节剂分子、药物分子等提供指导。
图1是三个模型多肽，五聚丙氨酸(5Ala)、八聚苯丙氨酸(SWie)和八聚组氨酸 (SHis)与4，4’ -联吡啶分子GBpy)的共同组装体的扫描隧道显微镜图像；图2是染料分子磺酸基酞菁在三种多肽-标记分子组装体上吸附的扫描隧道显微 镜图像，其中，A和B表示在5Ala-4Bpy组装体中，C和D表示在8Wie_4Bpy组装体中，E表 示在8His-4Bpy组装体中；图3是从图1和图2的扫描隧道显微镜图像中统计得到的染料分子磺酸基酞菁在 三种组装体中的吸附数量；图4是三种多肽组装体对于染料分子磺酸基酞菁的不同吸附能力，即染料分子在 多肽分子上的相对吸附常数。将SPhe多肽分子对于染料分子的吸附能力归一化为1时，SHis和5Ala多肽分子对于染料分子的吸附能力分别为10. 2和41. 8 ；图5是药物分子刚果红在5Ala-4Bpy组装体上吸附的扫描隧道显微镜图像；图6是从图5的扫描隧道显微镜图像中统计得到的刚果红在多肽和4Bpy上的吸 附数量；图7是药物前体分子ThT在5Ala-4Bpy组装体上吸附的扫描隧道显微镜图像。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。实施例1基于扫描隧道显微镜来测定染料分子在多肽上相对吸附常数1、所使用物质的化学结构多肽分子(5Ala、8Phe和8His)，吡啶类分子GBpy)和染料分子磺酸基酞菁的化学
结构，如下所示
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权利要求
1.一种测定待测分子在多肽分子上的相对吸附常数的方法，该方法包括如下步骤1)将多肽分子和标记分子进行组装，获得多肽分子与标记分子的组装体的扫描隧道显 微镜图像；2)将多肽分子、标记分子和待测分子进行组装，形成组装体，以获得所述待测分子在多 肽分子和标记分子上吸附的扫描隧道显微镜图像；3)对比步骤1)和步骤2)中获得的扫描隧道显微镜图像，统计待测分子吸附在多肽分 子以及标记分子上的吸附数量；4)将步骤幻获得的待测分子在标记分子上的吸附数量归一化为单位1，确定待测分子 在多肽分子上的相对吸附常数。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述组装体的制备方法 包括如下步骤i)将所述多肽分子与所述标记分子充分混合，形成混合液； )将步骤i)得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基底以 及硅等半导体基底表面，以形成组装体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤幻中，所述组装体的制备方法 包括如下步骤i)将所述多肽分子、所述标记分子以及所述待测分子充分混合，形成混合液； )将步骤i)得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、钼等金属基底以 及硅等半导体基底表面，以形成组装体。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步骤i)中，采用超声来充分混I=I ο
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步骤ii)中，所述导电性基底 为石墨，所述石墨优选为新解理的高定向石墨。
6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步骤ii)中，还包括除去所述 基底表面残留液的步骤，优选地，采用吹惰性气体，例如氮气的方式来除去所述基底表面的 残留液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测分子为染料、抗体、药物或药物 前体分子。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述染料为酞菁、吓啉类分子及其衍生 物，刚果红、硫磺素、姜黄素及其衍生物；所述抗体为淀粉质多肽分子抗体；所述药物为吡 啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯等氮杂环类分子及其衍生物，例如4’ 4-联吡啶，乙烯吡啶，三吡 啶，刚果红，姜黄素；所述药物前体为硫磺素。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽分子包括五聚丙氨酸、八聚苯丙 氨酸、八聚组氨酸、beta淀粉样多肽及其片段、胰淀素多肽及其片段、prion片段多肽、寡聚 多肽、嵌段寡聚多肽和人工序列多肽，优选地，所述多肽分子为五聚丙氨酸、八聚苯丙氨酸 和八聚组氨酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记分子为吡啶、嘧啶、吡嗪、咪唑、 吡咯类氮杂环分子及其衍生物，例如4’ 4-联吡啶、乙烯吡唆，三吡啶、嘧啶等，优选地，所述 标记分子为4’ 4-联吡啶。
全文摘要
本发明涉及一种利用扫描隧道显微技术来测定染料、抗体、药物和药物前体等待测分子在多肽分子上的相对吸附常数的新方法。该方法涉及如下过程获得多肽分子自组装结构的STM图像之后，或通过与标记分子的共吸附获得多肽-标记分子的共组装结构的STM图像之后，加入染料、抗体、药物和药物前体等待测分子，得到待测分子在多肽上的结合位点和吸附数量，并在分子水平上研究多肽和待测分子的相互作用，测定待测分子在多肽上相对吸附常数的方法。本发明的方法对于解析靶标蛋白与药物的相互作用的模式和结合本质具有非常重要的意义。
文档编号G01N13/00GK102062718SQ20091023816
公开日2011年5月18日 申请日期2009年11月17日 优先权日2009年11月17日
发明者杨延莲, 毛晓波, 王琛 申请人:国家纳米科学中心