专利名称：提高水稻氮吸收效率和产量的基因OsPTR9及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。植物体拥有一系列的氮素转运基因以实现从土壤中吸收氮素营养和在植物体内对氮素营养的重新分配，以满足植株在生长、发育和繁殖过程中对氮素营养的需要。本发明具体涉及一种提高对氮肥的利用效率和提高水稻产量的基因0sPTR9，该基因超量表达后，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘖能力增强，穗长增加，千粒重增加，产量提高。该基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面；在水稻高效利用氮肥与提高产量方面具有重要的应用价值。
背景技术：
水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的挑战。如何进一步提高水稻产量来满足人类不断增长的需求已成为现代农业生产上的一项主要任务。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量30 % [彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh, Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002,35(9) :1095-1103]，成为世界第一大消费国。而且虽然氮肥用量增加，但粮食并没有同步增产。从1984年到1993年，我国化肥用量增加了 81 %，而粮食总产只增加了 14.6%。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量也占施肥总量的 70%。氮肥的损失不仅严重浪费了有限的养分资源，由于其向水体和大气的排放，也带来了令人担忧的环境问题。因此，探讨有限氮素供应条件下作物高产高效的新途径，不仅是实现我国两高一优农业生产目标所必需的，而且也是保护环境、造福子孙后代的重要问题。氮是作物体内许多重要有机化合物的组分，氮是限制植物生长和形成产量的首要因素。在上壤中，氮素可以以氨(NH3和NH4-)、硝酸盐、氨基酸、可溶性肽、非溶性含氮复合物等多种不同的形式被植物吸收利用。植物种类不同，它们所喜好的氮源也不一样，水稻是一种喜氨的植物。硝酸盐被植物吸收后，首先也被还原成氨，然后以氨的形式整合到谷氨酰胺和谷氨酸盐。铵盐的同化作用通常发生在植物体的根部，而硝酸盐的同化作用既可在根部也可在叶片进行，取决于植物的种类和环境条件。部分在根部吸收的硝酸盐通过木质部运输到叶片进行同化，而在叶片中同化的氮主要通过韧皮部以氨基酸的形式运输到其他需氮器官进行再分配。氮素的这种再分配对于那些不参与氮素同化的供应组织是至关重要的。当氮素同化作用发生在根部时，氨基酸会随着木质部中的蒸腾流而被运输到成熟叶片，而大部分运输到成熟叶片的氨基酸又重新从木质部进入韧皮部参与氮素的再分配，这个过程可称之为氨基酸的循环。当氮素的同化作用发生在叶片时，氨基酸的循环过程对于满足根部氮素营养的需求是非常重要的(Marschner H et al. Importance of cycling and recycling of mineral nutrients within plants for growth and development. Acta botanica gallica，1997，110 :265-273)。在根部，过量的氨基酸可以从韧皮部重新回到木质部，参与再循环的过程[Larsson CM et al. Translocation and cycling through rootsof recently absorbed nitrogen and sulphur in wheat (Triticum aestivum)during vegetative and generative growth. Physiologia Plantarum，1991，82 (3) :345-352]。在某些细胞中，氮素也可以通过其他的形式，如小分子肽[Steiner HY et al. AnArabidopsis peptide transporter is a member of a new class of membrane-transport proteins. The Plant Cell，1994，6 (9) : 1289-1299]、嘌呤、嘧啶及其衍生物[Gillissen B et al. A new family of high-affinity transporters for adenine， cytosine, and purine derivatives in Arabidopsis. The Plant Cell，2000，12 (2) :291-300]等，穿过细胞的质膜完成氮素在细胞间的运输。氮的吸收和分配是由一整套完整而复杂的运输蛋白来完成的，这些运输蛋白具有不同的特异性、亲和力以及运输能力，在不同的环境条件下，受到差异性的调控，从而使植物能正常地生长和发育。氮的运输蛋白主要分为硝酸根运输蛋白、铵根运输蛋白、 氨基酸运输蛋白、肽运输蛋白以及嘌呤及嘌呤衍生物运输蛋白几大家族(Williams L et al.Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，2001， 52 :659-688)。一般而言，植物肽的运输蛋白可以归类到三个不同的基因家族ABC运输蛋白家族(ATP-binding cassette transporter family，ABCfamily)、寡妝运输蛋白家族 (oligopeptide transporter family, OPT family)及小分子肽运输蛋白家族(peptide transporter family, PTR family)[Stacey G et al. Peptide transport in plants. Trends in Plant. Science，2002，7 (6) :257-263] 0 拟南芥基因组序列分析预测有 53 个 PTRs家族成员(Arabidopsis Genome Initiative，2000)，聚类分析表明这些基因分成明显的4个亚方矣(Stacey G et al. Peptide transport in plants. Trends in Plant Science， 2002,7(6) :257-263) o其中被确定为运输小分子肽只有几个，其余大部分是运输硝酸根离子[Tsay YF et al. Nitrate transporters and peptide transporters. FEBS letters， 2007,581(12) :2290-2300]。第一个从拟南芥中鉴定的PTR家族成员CHLl (NRT1 1)是一个双亲和力的硝酸根运输蛋白(Tsay YF et al. The herbicide sensitivity gene CHLl of Arabidopsis encodes a nitrate-inducible nitrate transporter. Cell，1993，72 :705-713)。随后， 通过酵母肽运输缺陷型突变体功能互补的方法鉴定出了另外一个拟南芥PTR家族成员 AtPTR2[Rentsch D et al. Ntrl encodes a high-affinity oligopeptide transporter in Arabidopsis. FEBS letters，1995，370 (3) :264-268]。AtPTRl 也是通过酵母肽运输功能缺陷突变体的异源互补鉴定出来的，它不仅仅能够运输多种自然发生的二肽和三肽，而且能够运输一种经修饰的三妝菜显毒素[Dietrich D et al. AtPTRl. a plasma membrane peptide transporter expressed during seed germination and in vascular tissue of Arabidopsis. The Plant Journal，2004，40 (4) :488-499] DAtPTRl 的表达在种子储藏物的调动、种子发育和土壤养分的获得等过程中起重要作用。大麦盾片肽的运输蛋白HvPTRl 是目前为止特征分析最为详细的植物PTR，它负责运输胚乳储藏蛋白水解产生的小分子月太到正在发育的胚[West CE et al. Cloning and functional characterisation of a peptide transporter expressed in the scutellum of barley grain during the early stages of germination. The Plant Journal，1998，15 (2) :221-229]。水稻中虽然存在数量庞大的PTR家族成员，但是到目前为止，仅仅有两个PTR基因(OsNTRl和0sPTR6)被鉴定[Lin CM et al. Cloning and functional characterization of a constitutively expressed nitrate transporter gene, OsNRTl. from rice. Plant Physiology,2000, 122(2) :379-388 ；0uyang J et al. Identification and analysis of eight peptide transporter homologs in rice, Plant Science, 2010,179 :374-382],由于 PTR 家族不同基因的底物不同，这些基因一方面从根的周围吸收小分子肽或其他底物作为植物生长与发育的营养，同时，这些基因在植物体内也运输小分子肽或其他底物，参与氮的重新分配，以满足植物不同器官不同生长发育阶段对氮的需求。所以，PTR家族成员在植物氮素运输和代谢过程中起着非常重要的作用，对植物的生长和发育产生重要影响。但到目前为止，已报道氮运输基因多数集中在氮吸收、生物量提高和突变体的功能研究方面，对于产量提高方面还无报道。本发明以水稻的一个PTR家族新成员基因0sPTR9，通过超量表达后，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘖能力增强， 穗长增加、总粒数和千粒重增加，从而产量提高，另外还通过RNAi技术，并且在0sPTR9基因突变体中证实了该基因的功能。本基因不仅对水稻在低氮条件下氮吸收增加及稻谷增产有促进作用，同时也可以减轻因氮素损失对环境问题的负面影响。
发明内容
氮素是作物重要的大量营养元素之一，直接影响水稻的产量。控制水稻产量的性状较多，例如有效穗、穗长、谷粒大小等。我们从稻属普通栽培稻(Oriza sativa L.)中克隆了 0sPTR9的全长序列，本发明的目的在于提供了一种提高水稻氮利用效率、分蘖能力强、 穗长及千粒重增加的转基因水稻及其应用。本发明的主要内容如下I.本发明在于提供了一种控制水稻氮利用效率、分蘖能力及产量的基因 0sPTR9(如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列)，在转基因水稻超表达植株中提高了水稻的氮利用效率、分蘖能力、穗长及千粒重等。2.本发明在于提供一种基因0sPTR9在其他转基因植物中的应用。通过超量表达基因0sPTR9来提高植物的氮利用效率及产量。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物； 如小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。实现本发明的技术如下超量表达0sPTR9基因验证其功能构建超表达载体0sPTR9-pl301，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得超表达的组培苗80株，作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的组培苗30株，都种于大田，结果超表达组培苗出现穗长、总粒数和千粒重增加的现象。说明0sPTR9基因具有提高水稻产量的功能。单株收种并种植，直至 T2代鉴定出纯合植株，超表达植株的穗长、粒数和千粒重均比对照提高。通过RNAi技术构建干涉表达载体PTCK303-R1R2，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将干涉载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得基因表达量下降的株系5个，直至T2代继续观察表型，仍表现为结实率严重下降，千粒重下降的现象。将目的基因的突变体Tl代种子(由华中农大突变体库提供(http://rmd.ncpgr.cn/)。无菌播种后,移栽于框中,待小苗长高后,种于大田，对突变体植株纯、杂合筛选，纯合体同样出现结实率严重下降，千粒重下降的现象，从而证实了该基因的功能。0sPTR9基因的应用通过农杆菌介导的遗传转化方法或基因枪法或其它遗传转化方法超量表达水稻广量基因0sPTR9可以提闻水稻吸收氣肥的效率，提闻植株分葉能力，提闻水稻的糖长、粒数和千粒重，并且在RNAi和突变体中得到了功能验证。控制水稻氮素吸收和稻谷产量基因 0sPTR9可以在转基因水稻中应用也可以在其他转基因植物中应用，培育具有高产和优质的品种。本发明的优点和效果I.本发明克隆的0sPTR9基因超表达后使水稻分蘖能力增强，穗长、粒数和千粒重增加，说明0sPTR9基因对提高水稻产量较明显，通过基因工程技术提高0sPTR9基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过低氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品质改良。2.拟南芥PTR家族的很多基因虽被研究，但水稻目前还很少。0sPTR9基因的成功克隆，进一步证实了 PTR家族在氮吸收过程的重要作用，对阐明PTR家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。3.虽然目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本发明克隆的0sPTR9基因能够提高水稻的产量，这对植物增产的关键因素有极大的推动作用。
SEQ ID No. I为0sPTR9基因编码区氨基酸残基序列，共有421个氨基酸。SEQ ID No. 2为0sPTR9基因的cDNA序列全长。(全长2429bp，编码区1266bp，在 926-219 Ibp 间。)图I.超表达载体构建的0sPTR9_pCAMBIA1301载体图。图2.干扰载体实验所用的PTCK303载体图。图3.突变体纯杂合PCR检测原理示意图。A表示在插入位点上游设计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T2代植株中，纯合突变体只有B和C配对可以扩增的出， 因为有T-DNA插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA 的插入，只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则B和C配对以及A和B配对时都可以圹增得到产物。图4.超表达载体转基因植株设计引物检测分离的PCR结果。上游引物在35S启动子中，下游引物在0sPTR9的cDNA内部。1_10泳道均有带，可判定此株系为纯合植株。图5.干扰载体转基因植株设计引物检测分离的PCR结果。上下游引物均在载体上，中间包括干扰载体中间的内含子及0sPTR9插入的一段cDNA序列，2-5泳道均有带，可判定为转基因株系。图6.突变体纯杂合检测。野生型只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则B和 C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。纯合型只有B和C配对扩增出产物。所以第10泳道为纯合型突变体植株。图7.不同转基因植株穗子的表型。从左到右依次为中花11、T2代超表达植株、Tl 代干涉植株和Τ3代突变体植株。图8.不同转基因材料的结实率比较。从左到右依次为中花11、Τ2代超表达植株、 Tl代干涉植株和Τ3代突变体植株。图9.不同转基因材料的千粒重比较。从左到右依次为中花11、Τ2代超表达植株、 Tl代干涉植株和Τ3代突变体植株。图10. 0sPTR9在不同氮素条件下生物量比较。水培20d，氮素分别添加3mM，其中 pep代表大豆蛋白胨，ZH代表中花11，OE代表超表达植株，RNAi代表干涉植株，ptr9代表
突变体植株。
具体实施例方式实施例0sPTR9基因的功能验证和应用遗传转化载体的构建超表达载体所用载体是本实验室构建的0sPTR9_pCAMBIA1301。 0sPTR9-pCAMBIA1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301 (Sun et al. Xa26, a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae in rice,encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant Journal. 2004, 37 :517-527)基础上改建的， 携带具有组成型和超量表达特征的玉米35S启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图2)。 pCAMBIA 载体由由澳大利亚 CAMBIA 实验室(center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。提取 RNA 反转录成 cDNA,用加酶切位点的引物扩增后连接pGEMT-easy载体，连接反应PCR产物5 μ 1，载体0. 5 μ 1，2U T41igase， IOx buffer I μ 1，总10 μ I体积，16°C连接3h。取10 μ I连接产物，用氯化钙冻融法转到大肠杆菌toplO,加800ml LB,复苏lh, 6000rpm 5min离心富集菌后涂于氨节抗生素的LB平板，37°C过夜。挑单克隆，扩大培养抽提质粒，酶切鉴定。待测序正确无误后，把构建后的载体连接到PCAMBIA1301已酶切好的大片段上。酶切和PCR验证后，转农杆菌感受态EHA105， 抽提质粒，酶切和PCR验证，取700 μ I含构建好载体的农杆杆菌菌液加300 μ I 50%甘油混匀，-70°C保存。构建好的载体命名为ptr9-pCAMBIA1301。干涉载体所用载体是本实验室构建的PTCK303-R1R2。pTCK303_RlR2是在国际上常用的植物遗传转化载体pTCK303(ZHEN WANG et al. A Practical Vector for Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice Plant Molecular Biology Reporter. 2004,22 409-417)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的Ubi启动子的农杆菌介导的遗传转化载体(图3)。pTCK303载体由中科院植物所分子和发育生物学研究中心(Research Cemer for Molecular and Developmental Biology)惠赠。选择 0sPTR9 基因的 cDNA 干涉片段的区间，将加酶切位点的第一个cDNA片段和第二个cDNA片段分别连接pGEMT-easy 载体，连接反应PCR 产物 5 μ 1，载体 0. 5 μ 1，2U T41igase，10x buffer 1μ1』、10μΗΨ 积，16°C连接3h。取10 μ I连接产物，用氯化钙冻融法转到大肠杆菌toplO，加800ml LB，复苏lh,6000rpm 5min离心富集菌后涂于氨节抗生素的LB平板,37°C过夜。挑单克隆，扩大培养抽提质粒，酶切鉴定。待测序正确无误后，将酶切好的第一个cDNA片段连在PTCK303载体大片段上，转化大肠杆菌，提取质粒，酶切鉴定无误后，将已酶切好的第二个cDNA片段连接含有第一个cDNA片段的pTCK303载体大片段上。转化大肠杆菌，提取质粒酶切，因两个片段插入位点两侧含有BamHI和Sac I酶切位点，故可用这两种酶酶切进行鉴定cDNA插入情况。将正确的质粒转化农杆菌感受态EHA105，抽质粒，酶切和PCR验证，取700 μ I含构建好载体的农杆菌菌液加等300 μ I 50%甘油混匀，-70°C保存。构建好的载体命名为 PTCK303-R1R2。遗传转化米用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA, 1994,Plant Journal 6 :271-282)将超表达载体和干涉载体导入正常中花11水稻品种。农杆菌介导的遗传转化步骤如下愈伤诱导
成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理lmin，5%的次氯酸钠溶液消毒 50min ；
灭菌水洗种子4-5次；
将种子放在诱导培养基上，
置于黑暗处培养5周，温度25-27°C。
愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度 25-27 0C ο
预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4d，温度25-27°C。
农杆菌培养
在带有卡那霉素和链霉素的YEB培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA1052d，温度 28 0C ；
将农杆菌转移至悬浮培养基里，28 °C摇床上培养2-4h。
农杆菌侵染
将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子里；
调节农杆菌的悬浮液至0D_ = 0. 8-1. 0 ;将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡20min ；
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3d，温度19-20°C。
愈伤洗涤和选择培养
灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
浸泡在含含400mg/L头孢霉素的灭菌水中30min ；
转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。
分化及生根
将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7d ；
转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(20001χ)下培养，温度26°C，5-7周。
移栽待愈伤分化成苗并生根后，洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。转基因植株及突变体植株的分子检测待转基因植株长大后，剪取叶子提DNA，并设计引物对其进行PCR检测，最后获得超表达的组培苗80株，结果超表达植株出现穗长、总粒数和千粒重增加的现象。单株收种并种植，直至T2代检测出纯合植株(图5)。同样，设计引物对干涉转基因植株进行PCR检测，最后获得干涉植株9株，结果出现结实率和千粒重严重降低的现象。超表达载体转基因植株检测的引物为F TTGCGATAAAGGAAAGGC ；R :ATCAGCAGCGGCAGAAGC。干涉载体转基因植植株检测的引物为F TCTGGTCCAGTCTTTCCG ；R :AACCCATCTCATAAATAACG。单株收种并种植，直至Tl代继续观察表型(图6)。突变体Tl代种子由华中农大突变体库提供。将突变体种子无菌播种后，移栽于框中，待小苗长高月IOcm时，种于大田中，待苗长大后，对突变体种子纯、杂合筛选。扩增基因片段的上下游引物通过网址http://signal. salk. edu/ ricetdnprimers. 4. html (图4 :A, B)设计，扩增T-DNA插入的边界序列引物为NTLB和 pFRB (图 4 :C，D)。NTLB 的引物序列为 AATCCAGATCCCCCGAATTA。在 PCR 体系中加入 A、B 及 C或D中的一种即可鉴定出纯杂合。由Tl代检测的42株突变体Tl代植株中27株为杂合型，比率为64. 29%，无纯合型。由T2代检测的434株突变体植株中36株为纯合型，比率为8. 29%。(图7纯合的突变体植株一致表现出结实率严重下降，千粒重下降的现象。见图8，图9及图10统计结果。0sPTR9基因超表达结果和应用最后获得T2超表达植株60株，作为对照的由正常中花11植株30株，都种于大田， 超表达植株分蘖增强，穗长、总粒数和千粒重增加，产量提高，而干涉植株Tl代中本基因降低表达的株系结实率严重下降，千粒重下降。见图8，图9及图10统计结果。说明0SPTR9 基因能影响结实率和千粒重，进而影响产量的功能。PTR家族成员在植物氮素运输和代谢过程中起着非常重要的作用，对植物的生长和发育产生重要影响。另外通过添加不同氮素 (3mM)进行了水培试验，水培培养20d后，超表达植株在多种氮素中生物量出现明显增加的现象(图10)。总之，本发明以水稻的一个新PTR家族成员0sPTR9为研究对象，通过超量表达 0sPTR9基因，使正常的水稻氮素吸收提高，分蘖能力增强，穗长和千粒重增加，产量提高，另外还通过RNAi技术及目的基因突变体证实了该基因的功能。本基因对低氮条件水稻高效利用氮肥与提高产量方面具有重要的应用价值。附农杆菌介导的遗传转化试剂和配方试剂和溶液缩写6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-节基腺嘌呤)；KT(Kinetin,激动素)； NAA(Napthaleneacetic acid,萘乙酸)；IAA(Indole-3_acetic acid, Π引哚乙酸)；2, 4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS (Acetosringone,乙酉先丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B,潮霉素)； DMSO(Dimethyl Sulfoxide, 二甲基亚砜)；N6大量元素；N6微量元素；MS大量元素；MS微量元素组织培养的溶液配方
1)N6大量母液[10倍浓缩液(10X)]硝酸钾(KN03)28. 3g磷酸二氢钾(KH2P04)4. 0g硫酸铵((NH4)2S04)4. 63g硫酸镁(MgS04 7H20) 1. 85g氯化钙(CaCl2 2H20) 1. 66g逐一溶解，然后在20_25°C下定容至1000ml。2) N6微量元素母液[100倍浓缩液(100 X)]碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3B03)0. 16g硫酸锰(MnS04 4H20) 0. 44g硫酸锌(ZnS04 7H20) 0. 15g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。3)Fe2EDTA 储存液(100X)在一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeS04 7H20) 2. 78g在另一个大三角烧瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70°C，然后加入乙二胺四乙酸 二钠(Na2EDTA 2H20) 3. 73g在它们都溶解后混合在一起，70°C水浴中保持2h，定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素储存液(100 X)烟酸(Nicotinicacid)0. lg维生素B1 (Thiamine HC1)0. lg维生素B6 (Pyridoxine HC1) 0. lg甘氨酸(Glycine)0. 2g肌醇(Inositol)lOg加水定容至1000ml，4°C保存备用。5)MS大量元素母液(10X)硝酸铵(NH4N03)16. 5g硝酸钾9. Og磷酸二氢钾1.7g硫酸镁3.7g氯化钙4.4g在20-25 °C下溶解并定容至1000ml6) MS微量元素母液(100 X)碘化钾0.083g硼酸0.62g硫酸锰2.23g硫酸锌0.86g钥酸钠(Na2Mo04 2H20) 0. 025g硫酸铜(CuS04 5H20) 0. 0025g
氯化钴(CoCl2· 6H20) O. 0025g在20_25°C下溶解并定容至1000ml。7)2，4-0储存液(111^/1111)2,4-D IOOmgImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。8) 6-BA 储存液(lmg/ml)6-BA IOOmgIml IN氢氧化钾溶解5分钟，燃后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。9) NAA 储存液(lmg/ml)NAA IOOmgIml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4°C
下保存备用。10) IAA 储存液(lmg/ml)IAA IOOmgImlIN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在4°C
下保存备用。11)葡萄糖储存液(O. 5mg/ml)葡萄糖125g蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS 储存液ASO. 392gDMSOIOml分装至I. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾储存液氢氧化钾5.6g蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25 °C下保存备用。14) KT 储存液(lmg/ml)KT IOOmgImllN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25 °C下保存。培养基配方I)诱导培养基N6大量元素母液(IOX) IOOmlN6微量元素母液(100X) IOmlFe2EDTA 储存液(100X) IOml维生素储存液(100X)IOml2，4_D 储存液2.5ml
脯氨酸(Proline)O. 3g
CHO. 6g
鹿糖(Sucrose)30g
Phytagel3g
加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8，煮沸(100°C )并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)预培养基
N6大量元素母液(IOX)12. 5ml
N6微量元素母液(100X)I. 25ml
Fe2EDTA 储存液(100X)2. 5ml
维生素储存液(100X)2. 5ml
2，4-D储存液0. 75ml
CH0. 15g
鹿糖 5g
琼脂粉(Agarose) I 75g
加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖储存液和250 μ I AS储存液，分装倒入培养皿中(25ml/ M )
3)悬浮培养基
Ν6大量元素母液(IOX)5ml
Ν6微量元素母液(100Χ)0. 5ml
Fe2EDTA 储存液(100Χ)0. 5ml
维生素储存液(100Χ)Iml
2，4-D储存液0. 2ml
CH0. 08g
蔗糖2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个IOOml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加Iml葡萄糖储存液和IOOul AS储存液。
4)选择培养基
N6大量元素母液(IOX)25ml
N6微量元素母液(100X)2. 5ml
Fe2EDTA 储存液(100X)2. 5ml
维生素储存液(100X)2. 5ml
2，4-D储存液0. 625ml
CH0. 15g
蔗糖7. 5g
琼脂粉1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6. 0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250 μ I 50mg/ml的潮霉素和500mg/L头孢霉素，分别倒入培养皿中(25ml/皿)。5)预分化培养基N6大量元素母液(IOX)25mlN6 微量元素母液(100X)2.5mlFe2EDTA 储存液(100X)2.5ml维生素储存液(100X)2.5ml6-BA 储存液0.5mlKT 储存液0.5mlNAA 储存液50 μ IIAA 储存液50 μ ICHO. 15g鹿糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加250 μ I 50mg/ml的潮霉素和500mg/L头孢霉素，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。6)分化培养基N6大量元素母液(IOX) IOOmlN6微量元素母液(100X) IOmlFe2EDTA 储存液(100X) IOml维生素储存液(100X) IOml
0201]6-BA 储存液2ml
0202]KT 储存液2ml
0203]NAA 储存液O. 2ml
0204]IAA 储存液O. 2ml
0205]CHIg
0206]蔗糖30g
0207]Phytagel3g
0208] 加蒸懼水至900ml, IN氢氧化钾调节pH值到6. O,封口灭菌。
权利要求
1.一种控制水稻氮利用效率、分蘖能力及产量的基因，其特征在于具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质(1)序列表中SEQID No. I所不的氣基酸残基序列；(2)SEQ ID No. I的氨基酸残基序列经过一至五十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且影响植物的生长发育的蛋白质。
2.一种如权利要求I所述的控制水稻氮利用效率、分蘖能力及产量的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQID No. 2所示的核苷酸序列；(2)编码的序列表中SEQID No. 2蛋白质序列的DNA ；(3)与SEQID No. 2限定的核苷酸序列同源性具有90%以上且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(4)在高严谨条件下可与SEQID No. 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述的水稻的0sPTR9基因的表达载体。
4.含有权利要求2所述的水稻0sPTR9基因的大肠杆菌或农杆菌。
5.含有权利要求2所述的水稻0sPTR9基因的转基因植株。
6.扩增权利要求2所述的水稻0sPTR9基因中任一片段的引物对。
7.权利要求3所述的水稻0sPTR9基因的表达载体在植物生长发育中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的植物包括单子叶植物和双子叶植物。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于将所述水稻0sPTR9基因的超表达载体转化水稻，得到植株氮利用效率提高、分蘖能力增强，穗长、千粒重及产量提高的水稻。
10.按照权利要求7所述的植物，其特征在于所述的植物包括水稻、小麦、玉米、黄瓜、 番茄、杨树、草坪草及苜蓿等。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种提高水稻氮利用效率和增产基因OsPTR9的分离克隆及应用。OsPTR9是水稻PTR家族的一个基因，编码的蛋白是含氮有机物的转运体。本发明通过超量表达OsPTR9基因，使正常的水稻吸收氮肥的效率提高，分蘖能力增强，穗长及千粒重增加，并且通过RNAi技术以及在OsPTR9目的基因突变体中证实了该基因的功能。通过基因工程技术提高或减弱OsPTR9基因的表达量能够充分说明OsPTR9基因能够控制水稻的氮吸收、植株分蘖、穗长及千粒重等。该基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面；在水稻高效利用氮肥与提高产量方面具有重要的应用价值。
文档编号C12N1/21GK102604962SQ20111002298
公开日2012年7月25日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者夏快飞, 张明永, 方中明, 曾纪睛, 杨鑫, 马镇荣, 黄玮婷 申请人:中国科学院华南植物园