一种提高水稻磷吸收率的方法
【专利摘要】本发明公开一种提高水稻磷吸收率的方法。本发明利用PCR技术克隆OsSUT2基因的全长cDNA，构建由玉米Ubi启动子驱动的植物表达载体，通过农杆菌介导法获得过表达OsSUT2基因水稻。转基因纯合水稻在低磷生长条件下植株磷吸收量显著提高，株高、分蘖数、叶片数及穗数显著增加，穗实粒数、结实率也有增加趋势。本发明挖掘了OsSUT2基因的新用途。
【专利说明】一种提高水稻磷吸收率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程，具体为一个水稻蔗糖转运基因0sSUT2在提高水稻磷吸收方面的应用。
【背景技术】
[0002]磷是植物生长发育最重要的元素之一。由于土壤中的磷大部分以植物难以吸收利用的无效态磷方式存在，世界上30-40%的耕地的有效磷不能满足植物正常生长发育的需要。作物缺磷现象普遍存在。另外由于土壤的理化特性，磷肥当季的利用率也只有10%~25%，过量施用的磷肥带来了资源浪费、环境污染等问题。因此培育高效利用磷肥的作物品种是解决上述一系列问题的根本。
[0003]植物对磷的吸收和利用是一个复杂的过程，在长期的与土壤互作过程中，植物进化了一系列适应机制，如通过增加根的数量和表面积，增加对土壤中磷的吸收，利用菌根形成共生关系获取憐兀素，以及改变憐代谢相关基因的表达提闻憐的循环利用等机制。
[0004]蔗糖是植物生长发育和能量代谢的底物，近年研究发现:蔗糖是重要的信号物质，激发和参与了很多植物的代谢途径，增加蔗糖能够提高植物对逆境胁迫适应性。
[0005]蔗糖转运蛋白是一类高疏水性蛋白，负责植物体内蔗糖的转运和分配，它定位于植物细胞膜上，含有12个跨膜结构域，N-末端和C-末端均位于细胞质的一面，中间面向胞质的部分有一个大的环，将蛋白分为各含6个跨膜结构域的两部分，N末端可能对底物的亲和性起决定作用。
[0006]植物蔗糖转运蛋白的主要功能是介导植物体内蔗糖的跨膜转运，与蔗糖在韧皮部的装卸、库组织的蔗糖贮藏与供给、非生物与生物胁迫的响应、植物-微生物间的相互作用等有重要关系。近年来发现，蔗糖转运蛋白与蔗糖信号的传导密切相关，有可能参与植物对磷缺乏的适应性反应。本发明扩展了蔗糖转运蛋白的功能。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种提高水稻磷吸收率的方法，构建了 pl300Ubi0sSUT2表达载体，在水稻中过量表达0sSUT2基因，转基因水稻在低磷胁迫环境中表现出对低磷的生理适应性，提高了磷的吸收效率和利用效率，研究结果对培育磷高效利用水稻具有重要意义。
[0008]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种提高水稻磷吸收率的方法，通过在水稻中过量表达编码蔗糖转运蛋白基因0sSUT2实现。
[0009]所述过量表达0sSUT2基因，基因编号为AB091672，基因的cDNA全长1505bp，编码501个氨基酸，基因序列如SQE ID NO:1所示。
[0010]所述过量表达是利用PCR方法同源克隆出水稻0sSUT2基因，采用F-primer:SQEID NO:2和R-primer:SQE ID NO:3扩增出0sSUT2基因cDNA ;构建过量表达植物载体P1300Ubi0sSUT2 ;借助农杆菌介导法获得转OsSUT2基因水稻；通过自交分离筛选获得过量表达OsSUT2基因的纯合株系。
[0011]所述植物表达载体P1300Ubi0sSUT2是将中间载体pUbi0sSUT2酶切回收并与P1300连接获得的；将连接在T-easy测序载体上的水稻蔗糖转运蛋白0sSUT2 cDNA经EcoRI酶切重组到质粒pBluescriptIIKS,得到中间载体pBlue0sSUT2,然后用BamHI/Kpnl双酶切中间载体，将pBlue0sSUT2中的0sSUT2正向连接到终止子T_nos的前面，得到中间载体pUbi0sSUT2 ;将pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段连接在质粒P1300上，获得转化载体P1300Ubi0sSUT2，将转化载体P1300Ubi0sSUT2导入农杆菌菌株LBA4404，获得P1300Ub i 0sSUT2/LBA4404 工程菌。
[0012]转化包括以下步骤:
1)胚性愈伤的诱导；
2)胚性愈伤的遗传转化；
3)抗性愈伤的筛选；
4)抗性植株的分化、生根培养。
[0013]一种提高水稻磷吸收率的方法，其具体步骤包括以下:
1)以0SSUT2基因片段作为应用基因，设计引物，扩增出编码区，以强启动子Ubi作为驱动，构建单子叶植物表达载体；
2)通过农杆菌介导的遗传·转化方法，得到过量表达转基因水稻。
[0014]所述水稻品种为明恢86，通过农杆菌P1300Ubi0sSUT2/LBA4404转化，获得过量表达0sSUT2基因水稻植株。所述遗传转化方法具体包括以下步骤:
1)种子消毒和愈伤诱导
2)农杆菌pl300Ubi0sSUT2/LBA4404 制备
3)侵染及共培养
4)抗性愈伤筛选
5)抗性愈伤分化、幼苗生根。
[0015]转基因小苗移栽、检测、筛选出过量表达的转基因植株，通过自交重组，获得转基因纯合株系。转基因高代纯合水稻在低磷胁迫环境中，总根长、根尖数和根表面积、根冠比显著提高，植株总磷含量明显提高。
[0016]本发明构建了 P1300Ubi0sSUT2过量表达载体，在水稻中过量表达0sSUT2基因，转基因水稻在低磷胁迫环境中表现出对低磷的生理适应性，提高了磷的吸收效率和利用效率，研究结果可用于培育磷高效利用水稻品种，减少水稻生产过程中磷肥施用，降低土壤、水体及环境的污染具有可预期的应用价值，在理论上扩展了 0sSUT2基因的功能。
[0017]本发明的有益效果如下:
1.本发明提供了一种水稻蔗糖转运蛋白基因的新应用方法。本发明通过遗传转化技术，获得过量表达蔗糖转运蛋白基因0sSUT2水稻；在低磷胁迫环境中，转基因水稻的生物量增加43.74%，根冠比提高了 18.56%，单株磷含量比非转基因水稻提高了 24.24%。
[0018]2.本发明通过在水稻中过量表达蔗糖转运蛋白基因0sSUT2，改变了水稻根构型，根总长度增加了 20.20%、根总表面积增加了 21.92%、总根数增加了 21.79%，水稻磷吸收能力提高。本发明对于减少水稻生产过程中磷肥施用，降低土壤、水体及环境的污染具有可预期的应用价值。[0019]3.本发明通过转基因调控水稻体内碳分布方式，达到改良作物养分利用目的，为通过分子操作改良作物品种提供了新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1.pl300Ubi0sSUT2 载体示意图。
[0021]图2.低磷胁迫下转基因水稻的苗期植株表型。其中A为转基因水稻，B为非转基因水稻；与非转基因水稻相比转基因水稻根系较多、叶片较宽、叶色浓绿。
[0022]图3.低磷胁迫下转基因水稻结实期植株表型。其中A为转基因水稻，B为非转基因水稻；与非转基因水稻相比转基因水稻分蘖数较多、穗数较多。
[0023]图4.低磷胁迫下转基因水稻单株叶片数。其中D86表示对照；DM4表示转基因水稻。*表示差异显著；与非转基因水稻相比转基因水稻在整个生长期植株的叶片数都显著多于对照。
[0024]图5.低磷胁迫下转基因水稻单株分蘖数。其中D86表示对照；DM4表示转基因水稻。*表示差异显著；与非转基因水稻相比转基因水稻在抽穗期时分蘖数显著多于对照。
[0025]图6.低磷胁迫下转基因水稻不同生长期的根冠比。其中D86表示对照；DM4表示转基因水稻。*表示差异显著；与非转基因水稻相比转基因水稻苗期和分蘖期根冠比显著高于对照，但成熟期显著低于对照。
[0026]图7.低磷胁迫下转基因水稻单株总粒数。其中D86表示对照；DM4表示转基因水稻。*表示差异显著；与非转基因水稻相比转基因水稻总粒数显著多于对照
图8.低磷胁迫下转基因水稻收获期不同部位及全株的磷含量。其中D86表示对照；DM4表示转基因水稻。*表示差异显著；与非转基因水稻相比转基因水稻的穗、叶、根以及整株的全磷含量显著高于对照。
【具体实施方式】
[0027]实施一水稻蔗糖转运蛋白0sSUT2全长cDNA克隆
1.水稻蔗糖转运蛋白0sSUT2的克隆
根据(Aoki N, Hirose T,等 The sucrose transporter gene family inrice.Plant Cell Physiol.2003 Mar;44(3):223-32.)文中所登记的基因号，通过 NCBI 查得 0sSUT2 基因(GenBank:AB091672.1)全长 CDS,设计扩增引物 F primer:5，-ATGCCGCGGCGGCCTAGCGGCGGCG-3，和 R primer:5，-TTATCGGTGACCTCTCCTCCTTGAT-3，。扩增出 0sSUT2 编码区，扩增条件为:(1) 94°C 5min ；(2) 94°C 3min,55°C 3min,72°C 3min,反应35个循环；(3) 72°C延伸IOmin回收片段,连接在T_easy测序载体上,测序。
[0028]2.过量表达载体构建
将连接在T-easy测序载体上的水稻蔗糖转运蛋白0sSUT2cDNA经&0RI酶切重组到质粒pBluescriptIIKSm,得到中间载体pBlue0sSUT2,然后备BmMl/Kpn\双酶切中间载体PUSCK，将0sSUT2片段正向连接到终止子T-nos的前面，得到中间载体pUbi0sSUT2。将pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段连接在质粒P1300上，获得转化载体P1300Ubi0sSUT2。载体见附图1。[0029]实施二转0sSUT2过量表达水稻材料获得
采用农杆菌介导法获得转0sSUT2基因水稻，具体步骤如下:
1.胚性愈伤组织诱导与继代
取水稻授粉后20d的未成熟穗，剥壳后用75%乙醇浸泡lmin，再转入25%的次氯酸钠溶液中振荡灭菌25min，于超净工作台中无菌水冲洗4次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导培养基中，每皿约30粒，于28°C暗培养7d,切除胚根，继续培养7天d，待愈伤组织长大后进行继代培养。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤组织用于农杆菌转化。
[0030]2.愈伤组织的预培养
选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为3mm的颗粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于27°C暗培养4d。
[0031]3.农杆菌培养及菌液制备
从低温(_85°C)冻存管中刮取少量菌液接种于附加50mg.1/1卡那霉素和50mg.~1利福平的YEB固体培养基上，于28°C暗培养72h进行菌株活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28°C培养2h后，用添加有100 μ Μ.1乙酰丁香酮的AAM液体培养基将菌洗脱，用含有100 μ Μ.1乙酰丁香酮的AAM液体培养基定容到20ml左右，剧烈摇动Imin后，调整菌液浓度至0D600nm=2.0，静直lh，备用。
[0032]4.农杆菌感染与共培养
将预培养2d的愈伤组织转移到无 菌三角瓶中，加入上述农杆菌菌液，略微摇动后静置30min，倒去农杆菌，将感染 过的愈伤组织置于无菌滤纸上晾干60min后接种于共培养基上，25°C暗培养3d。
[0033]5.去除农杆菌
挑取共培养后的愈伤组织于无菌三角瓶中，用无菌水冲洗4次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含IOOmg.L—1羧卞青霉素的无菌水浸泡60min，然后倒掉液体，将去菌后的愈伤组织置于无菌滤纸上晾干。
[0034]6.抗性愈伤组织筛选
将愈伤组织转移至含有30mg.L—1潮霉素的选择培养基中培养，每两周转接I次，3周后抗性愈伤组织长出。
[0035]7.转化植株再生
将抗性愈伤组织转移至分化培养基上，2周后愈伤组织开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养瓶I个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。
[0036]实施例三.转基因水稻耐低磷实验
1.转基因水稻低磷培养
以转基因T4代纯合水稻为材料，以非转基因对照明恢86为对照。取饱满的水稻种子，室温浸种，2d后种子置于30°C培养箱催芽2d，待种子萌发后，小苗移入含1/2MS培养基中培养5d。将约5cm高的小苗移入以石英砂为基质含有不同磷浓度的液体培养基的无土栽培箱中培养，培养箱置于防雨，四周通风，阳光充足的塑料大棚中。石英砂预先用稀盐酸浸泡5d，然后用去离子水冲淋数遍，洗净盐酸，测定pH值。培养期间苗期I周补一次营养液，分蘖期之后3天加一次营养液，每2周置换一次新的营养液，置换新的营养之前用去离子水冲洗石英砂，生长期间视蒸腾情况补去离子水，补水时保证每一个培养箱中补水体积相同。水稻无土栽培营养液参照国际水稻所研发的配方(IRRI discussion paper series NO22 “Screening rice for salinity tolerance”)，配方中憐含量设为2个憐处理:低憐配方磷量降低为lmgL—\是配方中的1/10，其余元素含量不变；常磷配方则完全按照配方配置。见表1.表1.国际水稻所水稻营养液配方
【权利要求】
1.一种提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:通过在水稻中过量表达编码蔗糖转运蛋白基因0SSUT2实现。
2.根据权利要求1所述的一种提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述过量表达OsSUT2基因，基因编号为AB091672，基因的cDNA全长1505bp，编码501个氨基酸，基因序列如 SQE ID NO:1 所示。
3.根据权利要求1所述的一种提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述过量表达是利用PCR方法同源克隆出水稻OsSUT2基因，采用F-primer:SQE ID NO:2和R-primer:SQE ID NO:3扩增出OsSUT2基因cDNA ;构建过量表达植物载体pl300Ubi0sSUT2 ;借助农杆菌介导法获得转OsSUT2基因水稻；通过自交分离筛选获得过量表达OsSUT2基因的纯合株系O
4.根据权利要求3所述的一种提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:所述植物表达载体pl300Ubi0sSUT2是将中间载体pUbiOsSUT2酶切回收并与pl300连接获得的；将连接在T-easy测序载体上的水稻蔗糖转运蛋白OsSUT2 cDNA经EcoRI酶切重组到质粒pBluescriptIIKS,得到中间载体pBlue0sSUT2,然后用BamHI/Kpnl双酶切中间载体，将pBlue0sSUT2中的0sSUT2正向连接到终止子T-nos的前面，得到中间载体PUbi0sSUT2 ;将pUbi0sSUT2酶切回收Ubi0sSUT2片段连接在质粒P1300上，获得转化载体P1300Ubi0sSUT2。
5.根据权利要求4所述的一种提高水稻磷吸收率的方法，其特征在于:转化包括以下步骤: 1)胚性愈伤的诱导； 2)胚性愈伤的遗传转化；· 3)抗性愈伤的筛选； 4)抗性植株的分化、生根培养。
【文档编号】C12N15/29GK103710356SQ201310696522
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】苏军, 张武君, 宋亚娜, 付艳萍, 颜静宛, 胡太蛟, 李刚, 林智敏 申请人:福建省农业科学院生物技术研究所