一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水稻基因分子标记技术领域，尤其涉及一种定性检测水稻耐消化淀粉 含量的方法。
【背景技术】
[0002] 谷物淀粉是人类生存所需能量的主要来源，其中，水稻是当今世界1/2人口的主 粮，水稻的生产在我国举足轻重。经过育种工作者的不懈努力，我国在水稻生产上取得了巨 大的进步，杂交育种技术日益成熟，水稻的食味、蒸煮品质不断提升。而伴随人民温饱问题 的解决，生活水平的提高，具有调控血糖功能的功能型水稻成为水稻育种的新方向。
[0003] 淀粉作为血糖的直接供给来源，其消化特性也不断为人们所认知。按消化特 性，1992年Englyst等将淀粉分类为快消化淀粉（RDS)，缓慢消化淀粉（SDS)和抗性淀 粉（RS)，该分类方法是由Englyst根据生理解剖分析得出的。其中，快消化淀粉为进食后 20min内可被消化的淀粉；缓慢消化淀粉是进食后20~120min之间被消化的淀粉；而进 食120min后不被消化，不在小肠内消化吸收，却在大肠中发酵的则是抗性淀粉。由于耐消 化淀粉（SDS)和抗性淀粉（RS)对于人体均有益，所以，我们定义耐消化淀粉（Endurance Starch,ES)为缓慢消化淀粉（SDS)和抗性淀粉（RS)之和，即ES=SDS+RS;或者ES=TS(总 淀粉）_RDS(抗性淀粉）。
[0004] 2002年Ludwig临床研究表明，控制餐后血糖平稳对于人体健康大有脾益，长期食 用快消化淀粉含量高的食物会导致餐后血糖指数迅速升高，相关激素分泌调控压力变大， 进而导致糖尿病、心血管疾病和肥胖等诸多慢性疾病的发生。同时，由于谷物抗性淀粉含量 较低，血糖调控能力有限，提高耐消化淀粉含量，成为稳定餐后血糖的主要途径。
[0005] 目前，水稻耐消化淀粉含量的测定采用Englyst方法或者AACC方法，对于杂交后 代育种材料，上述方法一般都需要获得F3代后才能进行耐消化品质检测；增加了育种成本 和育种的工作量。分子标记辅助选择（Marker-assistedselection,MAS)技术给水稻育种 提供了新的途径，可通过该技术筛选水稻中耐消化淀粉含量高的材料，并将其用于杂交育 种中稻米食味品质和缓慢消化功能特性的组合育种中，显著加快了优质功能型水稻的育种 进度。
[0006] 现有研究表明，自然稻米米粉的ES含量在11.0%~24.2%之间（Patindol，J .,Guraya,Η. ,Champagne,Ε. ,Chen,Μ.Η. , &McClung,A. 2010.Relationshipofcooked-ricenutritionallyimportantstarchfractionswithotherphysicochemical properties.Starch-SUirke, 62 (5), 2妨_256)，日本晴（粳稻）和R7%4(籼稻）的ES含量 分别为17. 4%和20. 0%，而浙江大学通过钴-60伽玛射线诱变常规水稻筛得的一份耐消化 淀粉含量高的水稻株系esl的耐消化淀粉含量高达28. 7%。
[0007] 因此，有必要通过分子标记辅助选择技术获取上述水稻株系esl中与高耐消化淀 粉含量性状连锁的分子标记，以改善现有技术中常规耐消化淀粉含量测定方法育种成本 高、育种进度慢的问题，为加快优质功能型水稻的育种进度提供保障。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法以及与水稻高 耐消化淀粉含量性状紧密连锁的分子标记，通过该分子标记，可以筛选耐消化淀粉含量高 的水稻品种，用于高耐消化淀粉含量水稻品种的辅助选择选育。
[0009] -种定性检测水稻耐消化淀粉含量的方法，包括以下步骤：
[0010] 以待测水稻的基因组DNA为模板，采用如SEQIDNO. 1和SEQIDN0. 2所示核苷 酸序列的引物对进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0011] 所述水稻为籼稻时，若扩增产物包含l〇6bp和473bp两种条带，则说明待测水稻中 耐消化淀粉含量高于25 %，否则，耐消化淀粉含量低于25%;
[0012] 所述水稻为粳稻时，若扩增产物包含3bp、106bp和380bp三种条带，则说明待测水 稻中耐消化淀粉含量高于25%，否则，耐消化淀粉含量低于25%。
[0013] 具体地，所述的限制性内切酶为HaeII。
[0014] 所述PCR扩增的反应体系为：基因组DNA50ng，1XPCRbuffer2. 0μ1，(λ2mM dNTPsl. 6μ1，0· 5μM上游引物 0· 5μ1，0· 5μM下游引物 0· 5,Taq酶 1U，总体积 20μ1。
[0015] 所述PCR扩增的反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C复性30s，72°C 延伸lmin，循环30次；72°C延伸7min。
[0016] 本发明提供了一种引物对，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下 所示：
[0017] eslf:5' -GAGCGACGAGGAAAAGCACAAG-3'（SEQIDNO. 1);
[0018] eslr:5,-TGCAGACGAGCCACTATCAGACC-3'（SEQIDNO. 2)。
[0019] 本发明还提供了一种用于定性检测水稻耐消化淀粉含量的分子标记，所述分子标 记的核苷酸序列如下所示：
[0020] SEQIDNO. 3：GAGCGACGAGGAAAAGCACAAG；
[0021] SEQIDΝ0· 4 :TGCAGACGAGCCACTATCAGACC。
[0022] 该分子标记可用于鉴定普通水稻品种、其突变体、种质资源和育种株系中是否含 有高耐消化淀粉含量基因，并确定上述水稻的耐消化淀粉含量的高低。
[0023] 其中，SEQIDN0. 3所示核苷酸序列为常规籼稻品种esl分子标记序列；SEQID NO. 4所示的核苷酸序列为常规粳稻品种esl的分子标记序列。
[0024] 本发明还提供了上述SEQIDN0. 3或SEQIDN0. 4所示的核苷酸序列在定性检测 水稻耐消化淀粉含量中的应用。
[0025] 本发明提供的技术方案还可制备包含上述引物对的用于定性检测水稻耐消化淀 粉含量的试剂盒。该试剂盒可用于定性检测水稻耐消化淀粉含量。
[0026] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0027] (1)本发明分子标记与高耐消化淀粉含量性状不仅紧密连锁，而且在植株后代中， 该分子标记与高耐消化淀粉含量形状共分离，使得相应的鉴定方法具有很高的可靠性；
[0028] (2)通常，对于杂交后代育种材料，一般要在匕代才能进行耐消化品质检测；本发 明方法为耐消化淀粉性状水稻品种的辅助育种提供了一条途径，可免除育种群体繁杂且昂 贵的稻米消化特征鉴定工作，利用该分子标记可以从F2苗期进行筛选，既加快了育种进度 又节省了种植成本，并且可以对目标性状逐代追踪，在回交过程中不易丢失目标性状。
【附图说明】
[0029] 图1为分子标记esl在F2群体中与耐消化淀粉特性的连锁分析；
[0030] 其中：1为高耐消化淀粉含量突变体esl;2为日本晴（Nipponbare) ;M为分子量标 记，其余为F2群体高耐消化淀粉含量的单株。
[0031] 图2为分析标记esl检测消化特征不同的品种及其代表品种资源；
[0032] 其中：1-10号泳道分别为高耐消化淀粉含量株系esl、日本晴、浙辐111、ZR)4、宁 粳3号、武运粳23、秀水110、TF5、NHR111S、ZF12号的PCR产物经过酶解后的条带。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0034] 以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编 写的由JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology和 J.Sambrook等编写的由ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的Molecular