预测睡眠剥夺后5-羟色胺变化的方法与microRNAs标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生理学领域，更具体而言本发明涉及睡眠剥夺后的生理变化。
【背景技术】
[0002] 针对睡眠对认知功能影响的研究表明，连续两个每晚不足6小时的睡眠限制可导 致认知功能的降低，包括反应时间延长、简单反应任务中失误次数增多、心算能力降低和工 作记忆减弱。由于生物节律广泛地调控着各种生理功能、激素分泌、行为、认知功能等，人的 生理功能和作业能力无法避免受人体内部生物节律的调控以达到再平衡，生物节律的失调 会严重影响人的健康与操作能力。
[0003] 在睡眠节律紊乱的建模研究中，美国VanDongen教授在经典"双过程模型 (two-processmodel) "的基础上进一步指出，个体对睡眠缺失的敏感性差异是建模中不可 忽视的重要因素，并提出个体化的节律紊乱与工作能力预测模型。
[0004] 5-羟色胺（5-HT)变化是重要的睡眠剥夺生理效应。血小板与睡眠剥夺的相关性 早有报道，其分子机制与5-羟色胺有关（Heiseretal.，1997;Schreiberetal.，1997)。 有文献表明，睡眠剥夺可刺激5-轻色胺的释放（Grossmanetal.，2000)。5-轻色胺与睡 眠剥夺的机体反应密切相关，最近发表的睡眠剥夺代谢组学研究表明，5-羟色胺、色氨酸、 牛磺酸等27种代谢物在睡眠剥夺后显著上升（Daviesetal. 2014)。
[0005] 综上所述，筛选能表征和预测睡眠剥夺生理效应，特别是5-羟色胺（5-HT)变化的 个体差异的表观遗传学指标是重要的。
【发明内容】
[0006] 本发明人采用睡眠剥夺的人体实验模型，筛选并鉴定了能表征睡眠节律个体化模 型参数的表观遗传学指标。
[0007] 在一方面，本发明提供了在睡眠剥夺下5-轻色胺（5-HT)相关microRNAs标志 物hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p，它们的序列分别是SEQIDNO. 1 和 / 或SEQID NO. 2。优选地，所述microRNAs标志物还可以选自如下的序列和/或其互补序列：SEQID NO. 1+SEQIDΝ0· 2、SEQIDNO. 2+SEQIDΝ0· 1、SEQIDNO. 1+SEQIDNO. 2+SEQIDΝ0· 1 和SEQIDNO. 2+SEQIDNO. 1+SEQIDNO. 2。
[0008]SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2可以表征睡眠剥夺下的5-羟色胺（5-HT)。5-羟色 胺（5-HT)、hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p的关系满足Y=axl+bx2+c,Y是 5-羟 色胺（5-HT)的变化，xl和x2 分别是miRNA变量hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p，a 和b是变量的回归系数，c是常数，优选a:b:c= (-1) : (-12至-8) : (20至30);例如，分别 是 _0. 1、_1 和 2. 4。
[0009] 在另一方面，本发明提供了一种预测睡眠剥夺下5-羟色胺（5-HT)变化的方法， 所述方法包括检测microRNAs标志物hsa-miR-4701_3p和hsa-miR-4800-5p表达的水平， hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p的序列分别是SEQIDΝα?和SEQIDN0.2。高表 达水平的hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p表示睡眠剥夺后5-羟色胺（5-HT)水平 的降低。在一个具体实施方案中，5-轻色胺（5-HT)变化Y=axl+bx2+c，xl和x2分别是 miRNA变量hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p，a和b是变量的回归系数，c是常数，优 选a:b:c= (-1) : (-12 至-8) : (20 至 30);例如分别是-0· 1、-1，和 2. 4。
[0010] 在又一方面，本发明提供了一种预测睡眠剥夺对人影响的方法，所述方法包括检 测microRNAs标志物hsa-miR-4701_3p和hsa-miR-480〇-5p表达的水平，hsa-miR-4701_3p和hsa-miR-4800-5p的序列分别是SEQID NO. 1和SEQID NO.2。高表达水平的 hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p表示睡眠剥夺后5-羟色胺（5-HT)水平的降低。
[0011] 在再一方面，本发明还提供了检测microRNAs标志物hsa-miR-4701_3p和 hsa-miR-4800-5p表达的水平的试剂盒，所述试剂盒包括选自如下的序列和/或其互补序 列：hsa-miR-4701-3p和hsa-miR-4800-5p;SEQIDN0.1+SEQIDN0.2;SEQIDN0.2+SEQ IDNO. 1；SEQIDNO. 1+SEQIDNO. 2+SEQIDNO. 1；SEQIDNO. 2+SEQIDNO. 1+SEQID NO. 2〇
[0012] 通过血清microRNAs与生化指标的挖掘，本发明证明，通过检测血清microRNAs表 达水平，能够实现对睡眠剥夺生理效应个体差异的预测，从而筛选更加耐受睡眠剥夺的个 体。
[0013] 本发明中筛选得到的对睡眠剥夺生理效应5-羟色胺（5-HT)变化有预测功能的 microRNAs，与睡眠剥夺生理调控的相关性较高，这一发现为系统揭示睡眠剥夺影响人体的 分子机制提供了全新的线索，值得深入研究。
【附图说明】
[0014] 图1人血5-羟色胺（5-HT)含量检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 本发明提供了在睡眠剥夺下5-轻色胺（5-HT)相关microRNAs标志物 hsa-miR-4701-3p和/或hsa-miR-4800-5p，以及利用其预测睡眠剥夺下5-羟色胺（5-HT) 变化的方法和预测睡眠剥夺对人影响的方法。
[0016] 本发明虽然不拘囿于任何理论，但发明人认为hsa-miR-4701_3p和 hsa-miR-4800-5p的表达水平与5-羟色胺（5-HT)之间存在一种负调控关系。
[0017] 在本发明中，发明人发现5-羟色胺（5-HT)变化可以表示为Y=axl+bx2+c，其 中xl和x2分别是miRNA变量hsa-miR-4701_3p和hsa-miR-4800_5p，a和b是变量的回 归系数，c是常数。并且，发明人进一步发现，a、b和c优选存在这样的比例关系a:b:c= (-1) : (-12 至-8) : (20 至 30)。例如，a、b和c分别是-0· 1、-1 和 2. 4。
[0018] 实施例
[0019] 1、睡眠剥夺生理效应模型
[0020] (1)志愿者
[0021] 筛选临床体检身体健康、心理健康的志愿者共12人，男性，年龄为20至50。将上 述12名志愿者随机分成4组，每组3人。实验前1周要求每名志愿者保持规律的作息（23 时至第2天7时安排睡眠）。
[0022] (2)实验条件
[0023] 睡眠剥夺，时长为72h。受试者从进入隔绝室开始到实验结束累计72h无睡眠，当 被试表现出困倦瞌睡时用铃声惊醒。
[0024] (3)实验程序
[0025] 实验前第三天，对所有志愿者的情绪状态、基础生理生化指标进行测试，作为志愿 者上述指标的基线值。采用焦虑和抑郁量表及P0MS问卷等测试志愿者的情绪状态。采用 动态生理参数记录检测仪测试志愿者基础生理指标，采集当天的早晨8:00、中午12:00、下 午16:00和晚上20:00的唾液、尿液，分析志愿者生化指标。测试5-羟色胺（5-HT)，采用酶 联免疫吸附测定（ELISA)通用方法和试剂盒。
[0026] 实验前第三天，采集当天早晨8:00血液，分离血清（1ml)，加入RNA降解保护剂冻 存，留待后续microRNAs芯片分析。
[0027] 实验结束志愿者充分休息后当天，对志愿者的情绪状态、基础生理生化指标进行 测试，作为志愿者实验后的结果。测试方法和指标同实验前测试。
[0028] 2、数据采集总体情况
[0029] 数据采集情况如下表所示：
[0030] 表1数据采集情况表
[0031]
[0032]
[0033] 3、5_羟色胺（5-HT)含量测定方法与质量控制
[0034] 按照人5-羟色胺（5-HT)ELISA试剂盒（E01H0106,上海蓝基生物）说明书对5-HT 进行测试。
[0035] 为保证数据的准确性，每块酶标板上都做了双标准曲线，在加样过程中期进行加 样操作，减少加样时间所带来的误差。标准曲线结果见图1。
[0036] 曲线拟合采用CurveExpert专业数据分析软件，选用拟合程度最高MMF模型对数 据进行分析。人血5-羟色胺（5-HT)含量检测中MMF模型曲线拟合分析结果如下：
[0037]MMF模型：y= (a*b+c*x~d) / (b+x~d)
[0038] 系数数据：
[0039]a = 4. 82E-02
[0040]b = 6. 60E+04
[0041]c = 2. 03E+00
[0042]d = 1. 68E+00
[0043]MMF模型：y= (a*b+c*x~d) / (b+x~d)
[0044]标准差：0·〇731429
[0045]相关系数：0·"552〇8
[0046]注释：
[0047] 超过了 100次的重复计数；
[0048] 该拟合未能收敛至限差0· 000001 (CHI2为0· 010700);
[0049] 未使用加权。
[0050] 对于受试者，5-HT指标采集均在睡眠剥夺"前/后"两个时间，将受试者按照指标 "上升/下降"进行分类。
[0051