支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途

支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途
【专利摘要】本发明提供支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途。所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中，具有下述特征：(1)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6～1:4的范围；(2)2,3,6-三甲基-1,4,5-三乙酰基葡萄糖醇和2,3,4-三甲基-1,5,6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；(3)2,4,6-三甲基-1,3,5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且小于10%；及(4)2,4-二甲基-1,3,5,6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
【专利说明】支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途
[0001]
[0002]本案是申请日为2008年4月23日，申请号为200880017583.1，发明名称为“支链α-葡聚糖及生成其的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途”的发明申请的分案申请。
【技术领域】
[0003]本发明涉及一种支链α -葡聚糖及生成其的α -葡糖基转移酶和它们的制造方法以及用途，详细来讲，涉及一种支链α-葡聚糖及具有通过与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖作用并进行α-葡糖基转移而生成该支链α-葡聚糖的作用的α-葡糖基转移酶和它们的制造方法、以及含有该支链α -葡聚糖的组合物及其用途，所述支链α -葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0004](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范围；
[0005](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0006](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0007](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。`【背景技术】
[0008]所谓食物纤维，本来是指动物难以消化的纤维素、木质素、半纤维素、果胶等植物细胞成分，但是，广义来讲，也包含不能通过淀粉酶消化的难消化性的水溶性多糖类，它们被称为水溶性食物纤维。近年来，食物纤维在作为其原本的功能的整肠作用、血中胆固醇降低作用、血糖调节作用等的基础上，作为改善肠内菌丛的益生菌的功能也开始备受瞩目。但是，食物纤维与钙被并列认为是日本人的饮食生活中所缺少的营养素，现在的日本人的平均食物纤维摄取量相对平成6年提出的第5次修订“日本人的营养需要量”中所示的食物纤维的目标摄取量20~25g/日，仅达到目标的5~8成(参照例如《食物纤维的市场动向的调查》、“食品与开发”、第34卷、第2号、第24~27页(1999年)等)。在这种状况下，提出了各种可以用作各种饮食品的原料、且作为水溶性食物纤维有用的难消化性的多糖类。
[0009]例如，作为水溶性食物纤维，市场上流通有难消化淀粉(湿热处理高直链淀粉玉米)、瓜尔胶分解物、葡甘露聚糖、低分子海藻酸等以存在于自然界的多糖为原料的水溶性食物纤维。但是，这些水溶性食物纤维均具有粘性高、添加于食品时有损味道、食感等缺点，因此，其利用只局限于一部分。另一方面，作为低粘度的水溶性食物纤维，在食品领域中广泛利用聚葡萄糖(美国辉瑞公司开发)或难消化性糊精。已知，聚葡萄糖是将葡萄糖和山梨糖醇及柠檬酸在高真空下进行加热、通过化学反应使其聚合而得到的合成多糖，葡萄糖在1，2、1，3、1，4、1，6、1，2，6、1，4，6位等具有糖苷键合成的支链。另外，难消化性糊精是在通过化学反应分解淀粉的同时使转移或逆合成反应发生，通过导入淀粉本来不具有的1，2、1，3、1，2，4、1，3，4的各糖苷键而降低消化性的合成多糖。该难消化性糊精如下操作进行制造，即，在淀粉中添加少量的盐酸，将以粉末状态进行加热而得到的焙烧糊精溶解于水，添加α-淀粉酶进行水解，对由此得到的低粘度溶液进行精制、凝缩、喷雾干燥。也有为了进一步降低消化性而在难消化性糊精中添加葡萄糖淀粉酶，使可消化部分分解至成为葡萄糖，分离除去葡萄糖，同样地进行精制、喷雾干燥而制得的制品。但是，难消化性糊精的来自原料淀粉的收率低，并且容易着色，在工业生产方面具有很大缺点。一般认为，被导入这些聚葡萄糖或难消化性糊精中的新糖苷键同时含有α-端基及β-端基这双种端基差向异构体型，而且，还原末端葡萄糖残基部分地变化为1，6-脱水葡萄糖(参照例如《低分子水溶性食物纤维》、食品成分系列“食物纤维的科学”、第116页~131页、朝仓书店(1997年)
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[0010]作为葡聚糖中的葡萄糖的键合方式的糖苷键(以下，在本说明书中将“糖苷键”简称为“键”。)中，由于α-1，6键与α-1，4键相比，通过淀粉酶难以使其分解，因此，含有较多α-1，6键的葡聚糖也可以期待用作水溶性食物纤维用途。例如，利用来自属于乳酸菌的肠膜明串珠菌(leuconostoc mesenteroides)的葡聚糖鹿糖酶(EC2.4.1.5)以鹿糖为原料制造的葡聚糖是葡萄糖主要以α-1，6键聚合的葡聚糖，有时也具有α-1，2键合及α _1，3键合的支链。使用来自肠膜明串珠菌B-512F株的葡聚糖蔗糖酶时，期待得到的葡聚糖中的键的α-1，6键的含量也达到90%以上，为难消化性。但是，葡聚糖因来自蔗糖的收率低，并且粘性高，所以精制操作繁琐，成本升高，因此，几乎没有进行作为水溶性食物纤维使用的尝试。
`[0011]另外，也进行了通过使淀粉酶与廉价的淀粉作用，主要分解α-1，4键，从而提高α-1，6键的含量，制备水溶性食物纤维的尝试。在日本特开2001-11101号公报中，提出了如下方法:通过使α-淀粉酶和β_淀粉酶的混合物与淀粉液化液作用后，回收残留的糊精部分，由此制备α -1, 6键与α -1, 4键的比提高至10~20%的支链糊精。但是，该支链糊精通过在保持淀粉本来具有的支链(α-1，6键)的同时除掉葡萄糖以α-1,4键连接的直链部分从而提高α -1, 6键的比例的方法来制造，因此，存在来自原料淀粉的收率低、不能期待大幅度的消化性降低等问题。另外，作为与淀粉部分分解物(糊精)作用而导入α -1, 6键的酶，已知有糊精葡聚糖酶(EC2.1.1.2)(参照例如山本一也等、“生物科学.生物技术.生物化学”、第56卷、(1992年)、第169页~173页)。虽然糊精葡聚糖酶是通过与淀粉部分分解物作用，主要催化α-1，6葡糖基键转移反应，从而生成葡聚糖结构(葡萄糖以α-1，6键连接的结构)的酶，但是，目前已知的来自属于醋酸菌的荚膜醋杆菌(Acetobacter capsulatum)的糊精葡聚糖酶存在α-1, 6键的的导入比例少(参照例如铃木雅之等、“应用糖质科学(Journal of Applied Glycoscience) ”、第48卷、第2号、第143页~151页(2001年)等)、并且酶自身的稳定性低等问题，因此，未能应用于实际中。在这种状况下，即使在扩展水溶性食物纤维的选择范围的意义上，也强烈期望提供新的难消化性葡聚糖及制造其的方法。
【发明内容】

[0012]本发明的课题在于，提供一种作为水溶性食物纤维有用的葡聚糖及其制造方法以及其用途。
[0013]为了解决上述课题，本发明人等期待开发出以麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖为原料(基质)，生成具有较多支链(在本说明书中，所谓“支链”，是指在葡聚糖中的葡萄糖的键合方式中α-1，4键以外的葡萄糖的键合方式)的支链α-葡聚糖的酶，并对产生这种酶的微生物进行了广泛地探索。其结果发现，从土壤中分离出的微生物、ΡΡ710株及ΡΡ349株在菌体外产生与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α -1, 4葡聚糖作用并生成具有α-1, 4、α-1, 6、α-1，3、α-1，4，6及α-1, 3，6键的支链α-葡聚糖的新型α-葡糖基转移酶。而且发现，该新型酶可以由淀粉部分分解物等α-1，4葡聚糖有效地生成支链α-葡聚糖，所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0014](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范围；
[0015](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0016](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0017](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
[0018]另外，本发明人等发现，通过在培养ΡΡ710株而得到的α-葡糖基转移酶的粗酶液中预先混杂分解淀粉的淀粉酶，并使用该粗酶液、或将分离出的该淀粉酶与α -葡糖基转移酶并用，可以制造与单独使用α-葡`糖基转移酶的情况相比水溶性食物纤维含量提高了的支链α-葡聚糖。而且还发现，除了可以并用该淀粉酶之外，通过将公知的α-淀粉酶或淀粉去分支酶等与α-葡糖基转移酶并用，也可以调节得到的支链α-葡聚糖的重均分子量或水溶性食物纤维含量。此外，本发明人等发现，通过这些方法而得到的支链α-葡聚糖与原料α-1,4葡聚糖相比，α-1,6键的比例大幅度地增大，而且具有α-1，3及α-1，3，6键，表现出显著的难消化性，因此，作为水溶性食物纤维是有用的，也具有血糖上升抑制作用及生物体内类脂质减少作用，从而完成了本发明。
[0019]即，本发明通过提供一种支链α-葡聚糖和生成该支链α-葡聚糖的新型葡糖基转移酶、它们的制造方法以及用途来解决上述课题，所述支链α-葡聚糖以葡萄糖为构成糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0020](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范围；
[0021](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0022](3) 2，4，6-三甲基_1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0023](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
[0024]根据本发明，可以收率良好且大量、廉价地制造并供给在以食品领域为主的各种领域中作为水溶性食物纤维是有用的、着色少的难消化性支链α -葡聚糖。
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1是将分别使用来自环状芽孢杆菌ΡΡ710及来自球形节杆菌ΡΡ349的α -葡糖基转移酶样品、由淀粉部分分解物制成的葡聚糖A及B的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0026]图2是示意性地表示淀粉部分分解物及本发明的支链α -葡聚糖的结构的图。
[0027]图3是表示来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶的最适温度的图。
[0028]图4是表示来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶的最适pH的图。
[0029]图5是表示来自环状芽孢杆菌PP710的α -葡糖基转移酶的温度稳定性的图。
[0030]图6是表示来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶的pH稳定性的图。
[0031]图7是表示来自球形节杆菌PP349的α _葡糖基转移酶的最适温度的图。
[0032]图8是表示来自球形节杆菌ΡΡ349的α -葡糖基转移酶的最适pH的图。
[0033]图9是表示来自球形节杆菌PP349的α -葡糖基转移酶的温度稳定性的图。
[0034]图10是表示来自球形节杆菌ΡΡ349的α -葡糖基转移酶的pH稳定性的图。
[0035]图11是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的最适温度的图。
[0036]图12是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的最适pH的图。
[0037]图13是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的温度稳定性的图。
[0038]图14是表示来自环状芽孢杆菌PP710的淀粉酶的pH稳定性的图。
[0039]图15是将并用来自环状芽孢杆菌PP710的α -葡糖基转移酶精制品和淀粉酶精制品而制成的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0040]图16是将并用来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶精制品和异淀粉酶而制成的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0041]图17是将并用来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶精制品和α -淀粉酶而制成的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0042]图18是将并用来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶精制品和CGTase而制成的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0043]图19是将并用来自环状芽孢杆菌ΡΡ710的α -葡糖基转移酶精制品和异淀粉酶及CGTase而制成的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图与作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图进行比较的图。
[0044]符号的说明
[0045]在图1和图15~19中，
[0046]1:相当于分子量1000，000道尔顿的洗脱位置[0047]2:相当于分子量100，000道尔顿的洗脱位置
[0048]3:相当于分子量10，000道尔顿的洗脱位置
[0049]4:相当于分子量1，000道尔顿的洗脱位置
[0050]5:相当于分子量100道尔顿的洗脱位置
[0051]在图1中，
[0052]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0053]b:葡聚糖A的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0054]c:葡聚糖B的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0055]1:相当于葡萄糖聚合度499的位置
[0056]2:相当于葡萄糖聚合度6.3的位置
[0057]3:相当于葡萄糖聚合度384的位置
[0058]4:相当于葡萄糖聚合度22.2的位置
[0059]5:相当于葡萄糖聚合度10.9的位置
[0060]6:相当于葡萄糖聚合度I的位置
[0061]7:相当于葡萄糖聚合度433的位置
[0062]8:相当于葡萄糖聚合度22.8的位置
[0063]9:相当于葡萄糖聚合度10.9的位置
[0064]10:相当于葡萄糖聚合度I的位置
[0065]在图2中，
[0066]1:淀粉部分分解物的示意图
[0067]2:本发明的支链α -葡聚糖的示意图
[0068]a:非还原末端葡萄糖残基
[0069]b: α -1，3键合的葡萄糖残基
[0070]c: α-1, 4键合的葡萄糖残基
[0071]d:a-l，6键合的葡萄糖残基
[0072]e: a -1，3，6键合的葡萄糖残基
[0073]f: α-1, 4, 6键合的葡萄糖残基
[0074]斜向虚线:a-1,3键合
[0075]横向实线:a-1，4键合
[0076]纵向实线:a-1,6键合
[0077]在图13中，
[0078].:不存在钙离子的情况
[0079]O:存在ImM钙离子的情况
[0080]在图15中，
[0081]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0082]b:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.1单位淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0083]c:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.2单位淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图[0084]d --每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.5单位淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0085]e:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、I单位淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0086]在图16中，
[0087]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0088]b:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、50单位异淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0089]c:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、200单位异淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0090]d:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、500单位异淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0091]e:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、1000单位异淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0092]在图17中，
[0093]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0094]b:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.1单位α -淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC`的色谱图
[0095]c:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.2单位α -淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0096]d:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.5单位α -淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0097]e:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、1.0单位α -淀粉酶作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0098]在图18中，
[0099]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0100]b:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.1单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0101]c:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.2单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0102]d:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、0.5单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0103]e:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、1.0单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0104]在图19中，
[0105]a:作为基质的淀粉部分分解物的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0106]b:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、50单位异淀粉酶、I单位CGTase作用而得到的支链α-葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0107]c:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、200单位异淀粉酶、I单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0108]d:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、500单位异淀粉酶、I单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图
[0109]e:每I克基质使10单位α -葡糖基转移酶、1000单位异淀粉酶、I单位CGTase作用而得到的支链α -葡聚糖的凝胶过滤HPLC的色谱图【具体实施方式】
[0110]本发明中所说的葡聚糖，是指以葡萄糖为构成糖的葡萄糖聚合度为3以上的寡糖或多糖。本发明的支链α-葡聚糖是以葡萄糖为构成糖的α-葡聚糖，其特征在于，在甲基化分析中:
[0111](1)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范围；
[0112](2)2，3，6-三甲基-1，4，5_三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4_三甲基_1，5，6_三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上；
[0113](3) 2，4，6-三甲基-1，3，5_三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且低于10% ;及
[0114](4) 2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
[0115]本发明中所说的甲基化分析，是通常公知的确定多糖或寡糖中构成其的单糖的键合方式的方法。将甲基化分析用于葡聚糖中的葡萄糖的键合方式的分析时，首先，将构成葡聚糖的葡萄糖残基中的全部游离的羟基甲基化，接着，将完全甲基化了的葡聚糖水解。其次，将通过水解得到的甲基化葡萄糖还原，形成消除了端基差向异构体型的甲基化葡萄糖醇，而且，通过将该甲基化葡萄糖醇中的游离的羟基乙酰化，得到部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯(以下，在本说明书中，有时省略`“部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯”中的被乙酰基化的部位和“葡萄糖醇乙酸酯”的标记，简称为“部分甲基化物”。)。通过用气相色谱法对得到的部分甲基化物进行分析，来自葡聚糖中键合方式各异的葡萄糖残基的各种部分甲基化物可以用占气相色谱图中的全部部分甲基化物的峰面积的峰面积的百分率(%)表示。而且，可以由该峰面积％确定该葡聚糖中的键合方式不同的葡萄糖残基的存在比、即各糖苷键的存在比率。在本说明书中，部分甲基化物的“比”，是指甲基化分析的气相色谱图中的峰面积之比，部分甲基化物的“％”，是指甲基化分析的气相色谱图中的“面积％”。
[0116]上述⑴中的所谓2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇(以下，简称为“2，3，6-三甲基化物”)，是指C-4位参与1，4键合的葡萄糖残基，2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇(以下，简称为“2，3，4-三甲基化物”)是指C-6位参与1，6键合的葡萄糖残基。而且，所谓“2，3，6-三甲基化物和2，3，4-三甲基化物之比在1:0.6~1:4的范围”，即指在甲基化分析中的部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的气相色谱图中，对于本发明的支链α -葡聚糖，除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基与除C-1位以外仅C-4位参与键合的葡萄糖残基和除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基的总计的比例在37.5~80.0%的范围。
[0117]上述⑵中的所谓“2，3，6_三甲基化物和2，3，4-三甲基化物的总计占部分甲基化物的60%以上”，是指对于本发明的支链α -葡聚糖，除C-1位以外仅C-4位参与键合的葡萄糖残基和除C-1位以外仅C-6位参与键合的葡萄糖残基的总计占构成葡聚糖的总葡萄糖残基的60%以上。
[0118]同样，上述⑶中的所谓“2，4，6-三甲基-1，3，5-三乙酰基葡萄糖醇”(以下，简称为“2，4，6-三甲基化物”)，是指C-3位参与1，3-键合的葡萄糖残基，所谓“2，4，6-三甲基化物为部分甲基化物的0.5%以上且低于10%”，是指对于本发明的支链α -葡聚糖，除C-1位以外仅C-3位参与键合的葡萄糖残基为构成葡聚糖的总葡萄糖残基的0.5%以上且低于10%。
[0119]进而，同样，上述⑷中的所谓“2，4- 二甲基-1，3，5，6_四乙酰基葡萄糖醇”(以下，简称为“2，4- 二甲基化物”)，是指C-3位及C-6位双方分别参与1，3键合和1，6键合的葡萄糖残基，所谓“2，4-二甲基化物为部分甲基化物的0.5%以上”，是指对于本发明的支链α -葡聚糖，除C-1位以外C-3位和C-6位参与键合的葡萄糖残基为构成葡聚糖的总葡萄糖残基的0.5%以上。
[0120]完全满足上述(I)~(4)的条件的本发明的支链α -葡聚糖为目前为止所未知的新型葡聚糖。本发明的支链α-葡聚糖在甲基化分析中，只要满足上述(I)~(4)的条件，葡萄糖残基的键合顺序就没有特别限定。
[0121]本发明的支链α -葡聚糖通常为具有葡萄糖聚合度为10以上的各种葡萄糖聚合度的支链α-葡聚糖的混合物的形态。另外，在本发明的支链α-葡聚糖中，其重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)通常小于20。
[0122]进而，本发明的支链α-葡聚糖使具有即使为邻接于葡聚糖中的异麦芽糖结构的还原末端侧的α -1, 2、α -1, 3、α -1，4及α _1，6键的任一种键也进行水解的特征的异麦芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)作用时，每单位消化物的固体成分通常生成异麦芽糖25质量％以上50质量％以下。
[0123]另外，对于本发明`的支链α-葡聚糖，根据平成8年5月厚生省告示第146号的营养表示基准、“营养成份等的分析方法等(刊登于营养表示基准区别表第I的第3栏的方法)”中的第8项、记载于“食物纤维”的“高效液相色谱法(酶-HPLC法)”求出水溶性食物纤维含量时，通常含有40质量％以上水溶性食物纤维。对上述高效液相色谱法(以下，在本说明书中简称为“酶-HPLC法”)的概略进行说明时，为如下方法:通过利用热稳定α_淀粉酶、蛋白酶及淀粉葡糖苷酶(葡萄糖淀粉酶)进行的一系列酶处理对试样进行分解处理，利用离子交换树脂从处理液除去蛋白质、有机酸、无机盐类，由此，制备高效液相色谱(HPLC)用试样溶液，然后，供给到凝胶过滤HPLC中，求出色谱图中未消化葡聚糖和葡萄糖的峰面积，使用各自的峰面积、和预先另外利用常规方法的葡萄糖氧化酶法求出的试样溶液中的葡萄糖量，算出试样的水溶性食物纤维含量。对本方法的详细情况，将在后述的实验中进行说明。
[0124]如后述的实验19所示，本发明的支链α-葡聚糖即使经口摄取也难以利用唾液α-淀粉酶、胰液α-淀粉酶或小肠粘膜α-糖甙酶进行分解，因此，难以被消化吸收，可以用作使血糖急剧上升少、刺激胰岛素的分泌少的低卡路里的水溶性食物纤维。另外，该支链α -葡聚糖利用口腔内的微生物，难以引起酸发酵，即使与蔗糖并用，也具有抑制成为牙垢的原因的不溶性葡聚糖的生成的作用，因此，也可以有利地用作低蛀牙性或抗致龋性糖质。进而，本发明的支链α-葡聚糖在使用小鼠的急性毒性试验中，为不显示任何毒性的葡聚糖。[0125]进而，如后述的实验20及21所示，同时摄取本发明的支链α _葡聚糖和通常的淀粉时，与仅摄取淀粉的情况相比，抑制血糖值或胰岛素量的上升，因此，也可以用作血糖上升抑制剂。
[0126]而且，如后述的实验22所示，本发明的支链α-葡聚糖也具有通过摄取而抑制生物体内的类脂质的过剩蓄积的作用，因此，也可以用作生物体内类脂质减少剂。
[0127]将本发明的支链α -葡聚糖用作上述血糖抑制剂或生物体内类脂质减少剂时，由于水溶性食物纤维含量越高，作用效果越优异，因此，支链α-葡聚糖通常可以优选利用含有40质量％以上、优选50质量％以上、进一步优选60质量％以上的水溶性食物纤维的支链α-葡聚糖。
[0128]本发明中所说的α-葡糖基转移酶，是指通过与麦芽糖及葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖作用、基本上不进行水解地催化α-葡糖基转移从而生成本发明的支链α-葡聚糖的酶。在水解活性弱方面、不依赖于基质溶液的浓度地由低浓度至高浓度均具有效率良好的转移活性方面及也生成α-1，3及α-1，3，6键方面，本发明的α -葡糖基转移酶为与来自以往公知的真菌的α-葡糖苷酶或来自醋酸菌的糊精葡聚糖酶不同的酶。
[0129]本发明的α-葡糖基转移酶的酶活性可以如下测定。以最终浓度为lw/v%的方式使麦芽糖溶解于20mM醋酸缓冲液(pH6.0)并做成基质液，在该基质液5ml中加入酶液0.5ml，在40°C下进行酶反应30分钟，将该反应液0.5ml和5ml的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)混合，在沸水水浴中加热10分钟，由此使反应停止，然后，按照常规方法用葡萄糖氧化酶法测定反应液中的葡萄糖量，算出通过反应生成的葡萄糖量。α-葡糖基转移酶的活性I单位定义为在上述条件下I分钟内生成Iμ摩尔的葡萄糖的酶量。
[0130]作为本发明的α -葡糖基转移酶的一个具体例，可列举例如具有下述理化性质的α -葡糖基转移酶。
[0131](I)分子量
`[0132]在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90，000± 10，000道尔顿；
[0133](2)最适温度
[0134]在ρΗ6.0反应30分钟的条件下，为50~55°C ;
[0135](3)最适 pH
[0136]在40°C反应30分钟的条件下，为5.0~6.3 ;
[0137](4)温度稳定性
[0138]在pH6.0保持60分钟的条件下，在直至40°C稳定；及
[0139](5) pH 稳定性
[0140]在4°C保持24小时的条件下，至少在pH3.5~8.4的范围内稳定。
[0141]作为本发明的α -葡糖基转移酶的其它具体例，可列举例如具有下述理化性质的α -葡糖基转移酶。
[0142](I)分子量
[0143]在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90，000± 10，000道尔顿；
[0144](2)最适温度
[0145]在ρΗ6.0反应30分钟的条件下，为约50°C ；
[0146](3)最适 pH[0147]在40°C反应30分钟的条件下，为约6.0 ；
[0148](4)温度稳定性
[0149]在pH6.0保持60分钟的条件下，在直至40°C稳定；及
[0150](5) pH 稳定性
[0151]在4°C保持24小时的条件下，至少在pH4.0~8.0的范围内稳定。
[0152]虽然本发明的α-葡糖基转移酶不受其供给源的限制，但是，作为优选的供给源，可列举微生物，尤其优选使用本发明人等从土壤中分离出的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株。下面，将在本发明的具有α -葡糖基转移酶产生能力的微生物ΡΡ710株及ΡΡ349株的鉴定试验中判明的细菌学各种性质分别示于表1及2。需要说明的是，鉴定试验按照《微生物的分类和鉴定》(长谷川武治编、学会出版中心、1985年)进行。
[0153][表 I]
[0154]
【权利要求】
1.一种支链α-葡聚糖，其以葡萄糖为构成糖，其特征在于， 在甲基化分析中，所述支链α-葡聚糖是通过下述α-葡糖基转移酶作用于麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α -1, 4葡聚糖得到的，所述的α -葡糖基转移酶对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α -1, 4葡聚糖的非还原末端具有α -1, 6葡糖基转移活性和α -1, 3葡糖基转移活性； 所述的支链α-葡聚糖具有下述特征: (1)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇之比在1:0.6~1:4的范围； (2)2，3，6-三甲基-1，4，5-三乙酰基葡萄糖醇和2，3，4-三甲基-1，5，6-三乙酰基葡萄糖醇的总计占部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的60%以上； (3)2，4，6-三甲基-1，3，5-三乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上且小于10% ;及 (4)2，4-二甲基-1，3，5，6-四乙酰基葡萄糖醇为部分甲基化葡萄糖醇乙酸酯的0.5%以上。
2.如权利要求1所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，葡萄糖聚合度为10以上，重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)所得的值(Mw/Mn)小于20。
3.如权利要求1或2所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，通过异麦芽糖糊精酶(EC3.2.1.94)消化，每单位消化物的固体成分生成异麦芽糖25质量％以上50质量％以下。
4.如权利要求1~3中任一项`所述的支链α-葡聚糖，其特征在于，利用高效液相色谱法(酶-HPLC法)求出的水溶性食物纤维含量为40质量％以上。
5.一种α-葡糖基转移酶，其特征在于，对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖的非还原末端具有α-1，6葡糖基转移活性及α-1，3葡糖基转移活性，且具有下述理化性质: (1)分子量 在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法中，为90，000 ± 10，000道尔顿； (2)最适温度 在ρΗ6.0反应30分钟的条件下，为50~55°C ; (3)最适pH 在40°C反应30分钟的条件下，为5.0~6.3 ; (4)温度稳定性 在pH6.0保持60分钟的条件下，直到40°C稳定；及 (5)pH稳定性 在4°C保持24小时的条件下，至少在pH4.0~8.0内稳定。
6.一种支链α -葡聚糖的制造方法，其特征在于，使对麦芽糖和/或葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖的非还原末端具有α-1，6葡糖基转移活性及α-1，3葡糖基转移活性的α -葡糖基转移酶作用于麦芽糖和/或葡萄糖聚合度为3以上的α -1, 4葡聚糖、生成权利要求I~4中任一项所述的生成葡聚糖的步骤、和获得该葡聚糖的步骤。
7.如权利要求6所述的支链α-葡聚糖的制造方法，其特征在于，在生成权利要求1~4中任一项所述的葡聚糖的步骤中，并用选自淀粉酶、淀粉去分支酶及环糊精葡萄糖转位酶中的I种或2种以上。
8.如权利要求6所述的支链α-葡聚糖的制造方法，其为环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)PP710(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERMBP-10771)、球形节杆菌(Arthrobacter globiformis) PP349 (独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERM BP-10770)或它们的变异株。
9.含有如权利要求1~4的任一项所述的支链α-葡聚糖的组合物，其特征在于，为饮食品、化妆品、医药品、医药部外品或工业原料的形态。
10.一种血糖上升抑制剂，其特征在于，含有权利要求1~4中任一项所述的支链α -葡聚糖作为有效成分。
11.一种生物体内类脂质减少剂，其特征在于，含有权利要求1~4中任一项所述的支链α-葡聚糖作为有效成分。`
【文档编号】C12P19/04GK103865967SQ201410065367
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2008年4月23日 优先权日:2007年4月26日
【发明者】渡边光, 山本拓生, 西本友之, 津崎桂二, 奥和之, 茶圆博人, 福田惠温 申请人:株式会社林原