一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的葡聚糖分支酶RmGBE具有优良的酶学特性，在食品、饲料、造纸等行业中具有较大的应用潜力。【专利说明】—种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。【
背景技术：
】[0002]葡聚糖分支酶(1，4_a-glucanbranchingenzyme,branchingenzyme,a-1,4-glucan-6-glycosyltransferase;EC2.4.1.18),又称Q酶，隶属于GHl3家族，是该家族酶中比较特殊的一类酶，能够同时作用于α_1，4和^-1，6-糖苷键，且是目前6!113家族中已知的唯一能够在葡萄糖多聚物间形成α-1，6-糖苷键的酶。葡聚糖分支酶能够切割α-葡聚糖分子内的α-1，4-糖苷键，同时将切下的寡糖以α-1，6_糖苷键的形式连接到葡聚糖上形成分支，是糖原和淀粉生化合成中的必须酶，对于淀粉及糖原的合成以及其最终的结构和功能特性具有重要的影响(ThiemannV,SaakeB,VollstedtA,etal.HeterologousexpressionandcharacterizationofanovelbranchingenzymefromthethermoalkaliphilieanaerobicbacteriumAnaerobrancagottschalki1.ApplMicrobiolBiotechnol2006，72:60-71)。葡聚糖分支酶特殊的催化功能使其在实际工业生产中具有巨大的应用潜力。[0003]葡聚糖分支酶广泛分布于自然界中的高等动物、植物以及微生物中。目前国际上关于微生物和植物来源的葡聚糖分支酶研究的较为广泛，但关于真菌来源的葡聚糖分支酶研究较少，仅见Kawabata等对一个来源于粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)的葡聚糖分支酶进行了分离纯化和性质研究(KawabataY,ToedaK,TakahashiT,etal.PreparationofhighlybranchedstarchbyglycogenbranchingenzymefromNeurosporacrassaN2-44anditscharacterizationandapplication.JApplGlycosci2002,49:273-279)，尚没有真菌来源的葡聚糖分支酶基因克隆以及表达等方面的研究报道。国内葡聚糖分支酶的研究多集中在植物来源(又称为淀粉分支酶)，且主要侧重于农学育种研究方面。其它来源分支酶的研究文献报道也较少，没有关于葡聚糖分支酶酶学性质方面的研究报道。[0004]工业生产的淀粉原料中含有18-33%左右的直链淀粉成分(BuleonA,ColonnaP,PlanchotV,etal.Starchgranules:structureandbiosynthesis.1nternationalJBiolMacromol1998,23:85-112)，直链淀粉的特殊线性结构使其难以被降解，从而导致工业生产中淀粉原料的有效利用率降低。此外直链淀粉容易回生，使淀粉类产品老化速率加快，从而导致产品品质下降。葡聚糖分支酶由于具有独特的α-1，6-糖苷键催化能力，可以催化直链淀粉的分支反应以改变其抗性结构，因此在多种淀粉相关的工业生产中显示出较好的应用前景。[0005]研究表明，葡聚糖分支酶作用于淀粉溶液时能够增加淀粉的溶解度和体系的稳定性，同时极大程度的降低淀粉溶液的老化速度(Eun-JooK,Soo-1nR,Hyun-AhB.BiochemicalcharacterisationofaglycogenbranchingenzymefromStreptococcusmutans:Enzymaticmodificationofstarch.FoodChem2008,4:979-984；KawabataY，ToedaK，TakahashiΤ，etal.PreparationofhighlybranchedstarchbyglycogenbranchingenzymefromNeurosporacrassaN2~44anditscharacterizationandapplication.JApplGlycosci2002，49:273-279)。葡聚糖分支酶的这种抗老化特性使其能够应用于焙烤食品的生产加工过程中，不仅起到延长食品货架期的目的，同时还能够提高产品的品质，如增大面包的比容等(OkadaS，KitahataS,YoshikawaS，etal.Processfortheproductionofbranchingenzyme,andamethodforimprovingthequalitiesoffoodproductstherewith:USpatentapplication4454161；SpendlerT,Joergensen0B.Useofabranchingenzymeinbaking:PatentapplicationW097/41736)。另外葡聚糖分支酶能够应用于造纸工业中，在纸张的成型包衣流程中添加葡聚糖分支酶能够降解该流程中的淀粉溶液，减少其中老化淀粉的生成量，从而有助于提高纸张的均匀度和光滑度(NicholsSE.Glucan-containingcompositionsandpaper:USPatentapplication6465203)o葡聚糖分支酶还能够作用于直链或支链淀粉，通过环化作用产生有特殊功效的环状葡聚糖(TakataH,TakahaT,OkadaS.Cyclizationreactioncatalyzedbybranchingenzyme.JBacteriol1996,6:1600-1606；TakataH,TakahaT,OkadaS,etal.StructureofthecyclicglucanproducedfromamylopectinbyBacillusstearothermophilusbranchingenzyme.CarbohydrResl996,295:91-101)。[0006]随着社会的快速发展，能源的需求量日渐增加，然而化石能源的储量却在逐渐枯竭，因此人们对于可再生新能源的渴求非常强烈。淀粉作为植物光合作用的产物，广泛分布于各种农作物中，是一种储量极其丰富的天然可再生生物质资源，且具有价格低廉、容易获取、污染小、可再生、易处理和可生物降解等优点，已被广泛应用于多种工业生产中。淀粉资源充分、高效利用的关键是要有酶学特性优良的水解酶系发挥作用，葡聚糖分支酶是淀粉酶系中的一种，因此开发一些新型、高效和具有特殊新功能特性的葡聚糖分支酶具有重要的研究意义和实际应用价值。【
发明内容】[0007]本发明的目的是提供一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用。[0008]本发明提供的一种蛋白，为如下(1)或(2)所示:[0009](1)SEQIDN0.2所示的蛋白；[0010](2)将SEQIDN0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。[0011]上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。[0012]上述编码基因中，所述编码基因为如下中至少一种:[0013]1)SEQIDN0.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子；[0014]2)SEQIDN0.1所示的DNA分子；[0015]3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且所述蛋白质的DNA分子；[0016]4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。[0017]含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。[0018]一种制备葡聚糖分支酶的方法也属于本发明的保护范围，该方法是将所述的重组菌进行诱导表达得到。[0019]所述重组菌是将SEQIDN0.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子插入pET-28a(+)的多克隆位点得到的。[0020]上述蛋白在制备具有葡聚糖分支酶作用的产品中的应用也属于本发明的保护范围；[0021]所述蛋白在ρΗ5.5-9.5,40°C以下具有葡聚糖分支酶活力，最适pH为7.5,最适温度为25°C。[0022]上述蛋白在增加食品比容和/或延缓食品老化中的应用也属于本发明的保护范围。[0023]上述应用中，所述食品为面食；[0024]所述面食具体为面包。[0025]上述蛋白在水解葡聚糖类多糖中的应用也属于本发明的保护范围；[0026]所述多糖具体为直链淀粉。[0027]本发明提供的一种来源于米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CAU432的葡聚糖分支酶RmGBE纯酶的比酶活力为11.8Umg—1，该酶的最适反应pH值为7.5，在较宽的pH范围内保持稳定。最适反应温度为25°C，在10-30°C保持较高的酶活力，具有良好的低温适应性。并且本发明的葡聚糖分支酶的底物专一性较强，在面包中添加该酶能够显著提高面包的比容并延缓面包的老化。本发明提供的葡聚糖分支酶RmGBE具有优良的酶学特性使其在食品、饲料、造纸等行业中具有较大的应用潜力。【专利附图】【附图说明】[0028]图1为葡聚糖分支酶RmGBE的纯化电泳图。[0029]图2为葡聚糖分支酶RmGBE的最适pH(A)及pH稳定性(B)。[0030]图3为葡聚糖分支酶RmGBE的最适温度(A)及温度稳定性(B)。[0031]图4为葡聚糖分支酶RmGBE对面包比容的影响。[0032]图5为葡聚糖分支酶RmGBE对面包硬度的影响。【具体实施方式】[0033]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0035]碘液(工作液)的配制:将0.125mL储备液(0.26g碘和2.6g碘化钾溶于IOmL蒸馏水)与0.5mLlmol/LHCl溶液混合，用蒸馏水定容至65mL。[0036]下述实施例中葡聚糖分支酶酶活力的定义及测定方法如下:[0037]葡聚糖分支酶酶活力的测定参照Takada等(TakataH,TakahaT,KurikiT,etal.PropertiesandactivecenterofthethermostablebranchingenzymefromBacillusstearothermophilus.ApplEnvironMicrobioll994，60:3096-3104)的方法并稍作改动，具体方法为:将直链淀粉(购自Sigma)溶解于50mmOl/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)，制备浓度为0.lg/100ml的底物溶液。将50μL适当稀释的待测酶液与等体积的底物溶液混合，在25°C水浴中反应20min。再加入400μL碘液(工作液)终止反应，随即加入800μL0.4mmol/LHCl，在660nm下检测吸光值。[0038]葡聚糖分支酶酶活力单位(U)定义:在以上条件下，每分钟底物与碘液的混合物吸光度值降低1%所需要的葡聚糖分支酶的酶量。[0039]米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CAU432在文献“Tang，etal.,2012.Purificationandcharacterizationofanovelbeta-1,3-1,4-glucanase(Iichenase)fromthermophilicRhizomucormieheiwithhighspecificactivityanditsgenesequence.JAgrFoodChem60,2354-2361.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。[0040]SMARTRACEcDNAAmplificationKit购自美国Clontech公司，产品目录号为634914。[0041]琼脂糖N1-1DA亲和柱购自美国GE公司，产品目录号为17-0575-01。[0042]实施例1、葡聚糖分支酶基因的获得[0043]一、葡聚糖分支酶基因基因组保守区片断PCR扩增[0044]以米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)CAU432的基因组DNA为模板，用简并引物GBEDF和GBEDR，使用ExTaqDNA聚合酶进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0045]?0?反应条件:941:5111丨11;941:308，601:~551:(每个循环降低0.5°C)30s，72°Clmin，共10个循环；94°C30s,55°C30s,72°Clmin，20个循环；72°C，10min。[0046]PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，显示在460bp左右有一条特异条带，将此条带回收并连接PMD18-T载体、热激法转化E.coliDH5a和菌落PCR鉴定重组子后测序。测序结果经NCBIBLAST搜索比对，结果表明该条带的核苷酸序列与葡聚糖分支酶有较高同源性。[0047]简并引物如下:[0048]GBEDF(正向):5，-GACGGCTTCCGATTCGAYGGNGTNAC-3，[0049]GBEDR(反向):5，-TCGCCGACCAGGGCYTGRTCRTG-3，[0050]其中:Y=C/T，N=A/T/C/G,R=A/G。[0051]二、葡聚糖分支酶基因全长cDNA扩增[0052](一)根据步骤一克隆得到的DNA片段，分别设计5’RACE和3’RACE引物，如表1所/Jnο[0053]表1引物序列[0054]【权利要求】1.一种蛋白，为如下(I)或(2)所示:Cl)SEQIDN0.2所示的蛋白；(2)将SEQIDN0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为如下中至少一种:OSEQIDN0.1中自5’末端起第28位至第2124位核苷酸所示的DNA分子；2)SEQIDN0.1所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子;4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5.一种制备葡聚糖分支酶的方法，该方法是将权利要求4所述的重组菌进行诱导表达得到。6.权利要求1所述的蛋白在制备具有葡聚糖分支酶作用的产品中的应用。7.权利要求1所述的蛋白在增加食品比容和/或延缓食品老化中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述食品为面食；所述面食具体为面包。9.权利要求1所述的蛋白在水解葡聚糖类多糖中的应用；所述多糖具体为直链淀粉。【文档编号】A21D8/04GK103789281SQ201410053914【公开日】2014年5月14日申请日期:2014年2月18日优先权日:2014年2月18日【发明者】江正强,吴淑朋,杨绍青,鲍庆丹,闫巧娟,刘昱申请人:中国农业大学