α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶,其制备方法和用途的制作方法

专利名称：α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶,其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(isomaltosylglucosaccharide-forming enzyme)，其制备方法和用途，更具体地说，涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，产生该酶的方法，利用该酶的α-葡糖基转移方法，利用该酶和α-异麦芽糖基转移酶两者产生具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖的方法，以及包含这些糖的组合物。
现有技术已经知道由葡萄糖分子作为组成糖的糖，例如，从作为原料的淀粉产生的淀粉部分水解物，包括直链淀粉，淀粉糊精，麦芽糖糊精，麦芽寡糖(maltooligosaccharide)以及异麦芽寡糖。并且，已知这些糖在其分子末端通常具有还原性和非还原性基团，和显示出还原性。一般来说，淀粉部分水解物可以用葡萄糖当量(DE)指数表述，该当量是基于干物质的还原力的一种尺度。已知具有比较高的值的那些通常具有比较低的分子量，比较低的粘性，强的甜度和反应性性质，与含氨基的物质(例如氨基酸和蛋白质)的易反应性，其可以引起褐变和产生不愉快的气味，并且容易引起变质。为了改进这些缺陷，长期需要用于降低或消除还原力而不改变葡萄糖分子作为淀粉部分水解物构成糖的方法。例如，在美国化学会杂志，Vol 71，pp.353-358(1949)中公开的方法。已报道了经接触来源于微生物软化芽胞杆菌的淀粉酶从淀粉形成由经由α-1，4葡萄糖苷键连接在一起的6-8个葡萄糖分子组成的α-，β-以及γ-环糊精的方法。现在，这些环糊精以工业规模生产，并利用其固有的性质，例如非还原性，无味以及包裹能力用于不同的领域。如所公开的，例如在日本专利公开143,876/95和213,283/95(由与本申请相同的申请人提出)中公开的那些，已知通过将非还原糖形成酶和海藻糖释放酶与淀粉部分水解物(例如麦芽寡糖)接触，产生由经由α，α-连接键连接在一起的两个葡萄糖分子组成的海藻糖的方法。现在海藻糖已经从淀粉工业化生产，并利用其有利的非还原性，中等和高质量的甜度用于不同的领域。如以上所描述的，具有二个葡糖聚合度(DP)的海藻糖以及具有6-8的DP的α-，β-以及γ-环糊精以工业规模生产，并利用它们有利的性质使用。然而，非-或低-还原糖的类型是有限的，因此需要不同于这些糖的更多不同的糖。
前不久，报道了一种由葡萄糖单位组成的环四糖的新类型。欧洲生物化学杂志，Vol.226，pp.641-648(1994)显示了通过将水解酶，alternanase，与经由交替α-1，3和α-1，6键和葡萄糖分子连接的alternan接触，接着在有机溶剂甲醇存在下结晶，形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖(本说明书中全文可以称为环四糖)的方法。
环四糖和具有环状结构的糖显示出稳定挥发性有机化合物，不引起氨基羰基反应的包含能力。因此，人们期望它们得到使用和加工，少担心褐变和变质。
然而，产生该糖所需的原料alternan和alternanase不易获得，并且用于它们的生产的微生物也不易获得。
在这样的条件下，本发明发明人通过将原料具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键(glucosidic linkage)、并且具有至少为3的葡糖聚合度的糖(在说明书全文中可以称为α-异麦芽糖基葡糖基糖)与α-异麦芽糖基转移酶接触，成功地产生了环四糖，该转移酶特异性地水解α-异麦芽糖基部分和其余的葡糖基糖部分，然后将α-异麦芽糖基部分转移到其受体上形成环四糖，如在日本专利申请149,484/2000和229,557/2000中公开的。α-异麦芽糖基转移酶是这样一种酶，其由α-异麦芽糖基葡糖基糖通过α-异麦芽糖基转移反应形成环四糖，并且具有下列物理化学性质
(1)作用从具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖；(2)分子量当在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上测定时，具有约82,000到约136,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电泳上测定时，具有约3.7到约8.3的等电点。
(4)最适温度当在pH 6.0下温育30分钟时，具有约45℃到约50℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育30分钟时，具有约5.5到约6.5的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度下的热稳定范围；(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有在约3.6到约10.0的pH稳定范围。
就环四糖的原料糖而言，其从丰富和低价格的淀粉产生应当是合乎需要的，然而，由于α-异麦芽糖基转移酶不直接作用于淀粉，实际上使用了下列方法首先将淀粉转化成具有上述特定结构的α-异麦芽糖基葡糖基糖，例如相对低分子量的异麦芽寡糖，如潘糖和异麦芽糖基麦芽糖，然后在α-异麦芽糖基转移酶的作用下形成环四糖。
已经发现，当用潘糖作为环四糖的原料时，基于干固体的重量(d.s.b.)，从原料的产率是约44％。同样地，用异麦芽糖基麦芽糖作为原料的情况下，环四糖的产率约为31％(d.s.b.)，而用淀粉作为原料的情况下，它们应当与酶，例如α-淀粉酶，淀粉脱支酶，β-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶接触，形成相对低分子量的异麦芽糖基寡糖，包括潘糖，环四糖的产率低至约15％(d.s.b.)。
虽然从淀粉实际产生环四糖的是可行的(即使具有这样低的产率)，但其生产价格可以是较高的。在这样的情况下，需要建立采用容易得到的原料(例如淀粉)以相对高的产率产生环四糖的新的方法。
发明描述本发明的目的在于提供一种α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其制备方法，可由其获得的环四糖，包括环四糖的糖以及它们的用途。
为了达到上述目的，本发明发明人广泛地筛选了微生物，其产生可用于从淀粉原料以比较高的产率制备环四糖之新酶，期望得到这样一种酶。结果他们意外地发现从土壤分离的芽孢杆菌属或节杆菌属的微生物，如圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)C9菌株，圆孢芽孢杆菌C11菌株，圆孢芽孢杆菌N75菌株以及球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)A19菌株(下文称为″菌株C9″，″菌株C11″，″菌株N75″以及″菌株A19″)，它们形成α-异麦芽糖基转移酶(如日本专利申请149,484/2000和229,557/2000中公开的)以及新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(本发明发明人所追求的)两者。经首先发现以下事实，发明人完成了本发明通过将相对低分子量的葡糖基糖(包括淀粉部分水解物)与α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶接触，环四糖的产率(本发明发明人瞄准的目标)可以大大提高；揭示了α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质以及α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的制备方法；利用α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的α-葡糖基转移反应，产生α-异麦芽糖基葡糖基糖的方法；环四糖或包含环四糖的糖组合物，其可由利用α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶获得；以及产生这些糖的方法。本发明发明人也获得了含有环四糖或包含环四糖的糖组合物的食物，化妆品和药物，由此完成了本发明。
附图简要描述

图1是当用高效液相色谱测定时，经由来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶获得的糖的洗脱模式。
图2是环四糖的核磁共振谱(1H-NMR)，所说的环四糖是经采用来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的酶促反应获得的。
图3是环四糖的核磁共振谱(13C-NMR)，所说的环四糖是经采用来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的酶促反应获得的。
图4代表环四糖的结构，即，环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)。
图5显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图6显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图7显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图8显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图9显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图10显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图11显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图12显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C9菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图13显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图14显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图15显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图16显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图17显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图18显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图19显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图20显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌C11菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图21显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图22显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图23显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图24显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图25显示温度对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图26显示pH对来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图27显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图28显示来源于微生物圆孢芽孢杆菌N75菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图29显示温度对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图30显示pH对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶促活性的影响。
图31显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的热稳定性。
图32显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的pH稳定性。
图33显示温度对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图34显示pH对来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图35显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图36显示来源于微生物球形节杆菌A19菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图37显示温度对来源于微生物分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图38显示pH对来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶酶促活性的影响。
图39显示来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶的热稳定性。
图40显示来源于微生物分枝节杆菌S1菌株的α-异麦芽糖基转移酶的pH稳定性。
图41利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽三糖的核磁共振谱(1H-NMR)。
图42利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽四糖的核磁共振谱(1H-NMR)。
图43利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽三糖的核磁共振谱(13C-NMR)。
图44利用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶经酶促反应获得的α-异麦芽糖基麦芽四糖的核磁共振谱(13C-NMR)。
图45为本发明的环四糖晶体(五到六水合物)显微镜照片在屏幕上显示的可见中间图。
图46是当用x-光粉末衍射分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖(五到六水合物)的x-光衍射光谱。
图47是当用热重量分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖(五到六水合物)的热重量分析曲线。
图48是当用x-光粉末衍射分析测定时，晶体形式的本发明的环四糖一水合物的x-光衍射光谱。
图49是当用热重量分析测定时，晶体形式的本发明的一水合物的热重量分析曲线。
图50是当用x-光粉末衍射分析测定时，经在40℃下真空干燥获得的本发明的环四糖(五到六水合物)的无水晶体粉末的x-光衍射光谱。
图51是当用x-光粉末衍射分析测定时，经在120℃下真空干燥获得的本发明的环四糖(五到六水合物)的无水晶体粉末的x-光衍射光谱。
图52是当用热重量分析测定时，本发明的无水环四糖粉末的热重量分析曲线。
实施本发明的最好方式以下是产生本发明的新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的菌株C9，菌株C11，菌株N75以及菌株A19的鉴定结果，鉴定试验按照日本科学学会出版社(日本东京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa编辑的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定方法)中描述的方法进行。菌株C9A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面光滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阳性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性(9)生长条件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用 酸形成D-葡萄糖 + +甘油 + +蔗糖 + +乳糖 + +注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量40％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌C9″，于2000年4月25日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(International Patent Organism DepositaryNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(Tsukuba Central 6，1-1，Higashil-Chome Tsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERMBP-7143接受。菌株C11A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；
液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阳性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性(9)生长条件 在5.5-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源 利用酸形成D-葡萄糖++甘油++蔗糖++乳糖++注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量39％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌C11″，于2000年4月25日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7144接受。菌株N75A.形态学当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.5-1.0×1.5-5μm棒形存在，不表现出任何多态性，具有运动性，形成胞内一端球形孢子和膨胀的孢子囊，并且革兰氏染色阳性；B.培养性质(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在两天培养后具有1-2毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状放射状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；液化琼脂平板。C.生理学性质(1)VP-试验 阴性(2)吲哚形成 阴性(3)从硝酸形成气体 阳性(4)淀粉水解 阳性(5)色素形成 不形成任何可溶性色素(6)脲酶 阴性(7)氧化酶 阳性(8)过氧化氢酶 阳性
(9)生长条件 在5.7-9.0的pH和10-35℃的温度下生长(10)需氧 需氧的(11)碳源利用和酸形成碳源利用酸形成D-葡萄糖 ++甘油 ++蔗糖 ++乳糖 ++注符号″+″意指是的或阳性。
(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量 40％参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为圆孢芽孢杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″圆孢芽孢杆菌N75″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7591接受。菌株A19A.形态学(1)当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.4-0.8×1.0-4.0μm棒形存在，表现出多态性，不具有运动性，不形成胞子，并且革兰氏染色阳性；(2)当在27℃在EYG琼脂平板上培养时的细胞特征表现出杆菌和球菌的生长循环B.培养性质
(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在一天培养后具有2-3毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状丝状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；不液化琼脂平板。C 生理学性质(1) 淀粉水解 阴性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 阳性(4) 氧化酶 阳性(5) 过氧化氢酶 阳性(6) 氧需求 需氧的(7) 细胞壁的主要二氨基酸 赖氨酸(8) 细胞壁的肽聚糖型 赖氨酸-丙氨酸(9) 细胞壁的N-酰基类型 乙酰基(10)细胞壁的糖组份 半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11)维生素需求 阴性(12)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量62％(13)DNA-DNA同源性当与球形节杆菌ATCC 8010比较时，具有66.5％的DNA-DNA同源性参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为球形节杆菌物种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″球形节杆菌A19″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7590接受。
在本发明中，可以适当地使用芽孢杆菌属(Bacillus)，节杆菌属(Arthrobacter)和其它属的任何微生物以及它们的突变体，只要它们形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。通过以本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的物理化学性质为指征，利用用于微生物筛选的常规方法，这些微生物可以容易地筛选到。
来源于节杆菌属微生物(在下文中称为″菌株S1″)(本发明发明人从Okayama-shi，Okayama，日本，土壤中分离到)的α-异麦芽糖基转移酶可以作为α-异麦芽糖基转移酶有利地用于本发明，这种酶从α-异麦芽糖基葡糖基糖通过转移α-异麦芽糖基残基产生环四糖。鉴定试验按照日本科学学会出版社(日本东京)出版(1985)的由Takeji Hasegawa编辑的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分类和鉴定方法)中描述的方法进行。菌株S1A.形态学(1)当在27℃在营养肉汤琼脂上培养时的细胞特征通常以0.3-0.7×0.8-3.5μm棒形存在，表现出多态性，不具有运动性，不形成胞子，并且革兰氏染色阳性；(2)当在27℃在EYG琼脂平板上培养时的细胞特征表现出杆菌和球菌的生长循环B.培养性质
(1)在27℃在营养肉汤琼脂平板上培养时形成的菌落的特征形状在一天培养后具有2-3毫米直径的环形菌落边缘全缘隆起半球形光泽暗淡表面平滑颜色不透明和淡黄色(2)在27℃在营养肉汤琼脂斜面培养时形成的菌落的特征；生长中等程度形状丝状(3)在27℃在营养肉汤琼脂平板上穿刺培养时形成的菌落的特征；不液化琼脂平板。C 生理学性质(1) 淀粉水解 阴性(2) 色素形成 不形成可溶性色素(3) 脲酶 阳性(4) 氧化酶 阳性(5) 过氧化氢酶 阳性(6) 氧需求 需氧的(7) 细胞壁的主要二氨基酸 赖氨酸(8) 细胞壁的肽聚糖型 赖氨酸-丙氨酸(9) 细胞壁的N-酰基类型 乙酰基(10) 细胞壁的糖组份半乳糖，葡萄糖，鼠李糖以及甘露糖(11) 维生素需求 阴性(12) DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)百分含量65％(13) DNA-DNA同源性当与分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)ATCC 13727比较时，具有84.4％的DNA-DNA同源性参照伯杰氏系统细菌学手册，第二卷(1986)，将这些细菌学性质与已知微生物的那些性质比较。结果揭示出所述的微生物被鉴定为分枝节杆菌种的微生物。该微生物具有没有在任何文献中公开的下列特征形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(其从淀粉部分水解物产生α-异麦芽糖基葡糖基糖)和α-异麦芽糖基转移酶(其通过转移α-异麦芽糖基残基由α-异麦芽糖基葡糖基糖产生环四糖)两者。
基于这些结果，本发明发明人将这一微生物命名为″分枝节杆菌S1″，于2001年5月16日将其保藏在国立高级产业科学和技术研究所国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-ChomeTsukuba-shi，Ibarakiken，305-8566，日本)。该微生物的保藏在同一天由该单位以保藏号FERM BP-7592接受。
在本发明中，分枝节杆菌S1的任何突变体都可以适当地用于本发明，只要它形成α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。通过以可用于本发明的α-异麦芽糖基转移酶的物理化学性质为指征，利用用于微生物筛选的常规方法，这样的突变体可以容易地筛选到。
任何营养培养基都可以用于本发明，只要上述微生物在其中可以生长并产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶；可以任意使用合成的和天然的营养培养基。在本发明中有用的碳源是微生物为其生长而同化的那些这样的例子是来源于植物的淀粉和植物糖原；来源于动物和微生物的糖原和支链淀粉；糖，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇以及糖蜜；和有机酸，如柠檬酸和琥珀酸。这些碳源在营养培养基中的浓度依据它们的种类适当地改变。在本发明中有用的氮源是，例如，无机氮化合物，如铵盐和硝酸盐；和含有机氮的物质，如尿素，玉米浆，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物以及牛肉膏。在本发明中有用的无机组份是，例如，钙盐，镁盐，钾盐，钠盐，磷酸盐以及锰，锌，铁，铜，钼以及钴的其它盐。如果必要，氨基酸和维生素可以适当地组合使用。
用于本发明的微生物在需氧条件下，通常在4-40℃的温度范围内，更优选地，在20-37℃范围内，在4-10的pH下，更优选地，在5-9的pH下培养。用于本发明的培养时间设定为微生物的生长起始所要求的时间或更长，优选地为10-150小时。在营养培养基中的溶氧浓度(DO)无具体限制，但通常在0.5-20ppm范围内，并且其可以借助于控制通气水平，搅拌，增加氧到空气中以及增加发酵罐内部压力保持在所述范围内。培养自由地以分批或连续方式进行。
在微生物培养完成之后，收集本发明的酶。因为酶的活性在细胞和无细胞培养液两者中发现，后者可被收集作为粗酶溶液而且完整的培养液可以用作粗酶溶液。常规的液-固分离方法可以用于从培养物除去细胞；离心培养液，用涂布滤膜，带有平面滤膜或空心纤维的滤器过滤培养液的方法可以适当地用来从培养液除去细胞。如上所述，无细胞培养液可以用作粗酶溶液，然而，它们可以在使用之前用硫酸铵盐析，丙酮和醇沉淀，真空浓缩，平面膜和中空纤维浓缩来浓缩。
包含本发明的酶的无细胞溶液和它们的浓缩物可以完整使用，或者在用常规方法使酶固定后使用。在这种情况下，例如，利用离子交换剂的缀合方法，利用树脂和膜的共价键合/吸附方法以及利用高分子量物质的包含方法都可以适当地使用。
酶溶液通常包含本发明α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶。如果必要，可以在用常规方法分离/纯化之后使用本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。作为例子，根据本发明的电泳同质α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶可以这样获得将培养液中的酶盐析成浓缩物，透析浓缩的粗酶，通过采用树脂“SEPABEADS FP-DA13”的阴离子交换柱色谱，采用“SEPHACRYL HR S-200”的亲和色谱，采用“BUTYL-TOYOPEARL 650M”的疏水色谱以及采用“SEPHACRYL HR S-200”的亲和色谱的顺序色谱纯化透析的溶液。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶具有特征性的物理化学性质，即它可从具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键(glucosidic linkage)的原料糖，经由α-葡糖基转移形成如下糖，该糖具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者，而实质上不增加原料糖还原力；所说的酶不具有形成葡聚糖的能力；并且受EDTA(乙二胺四乙酸)抑制。更具体地说，该酶具有以下显示的物理化学性质；具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖包括，例如，选自下组的一种或多种糖麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，胶化淀粉以及糖原(1)活性经葡基从具有至少为2的葡糖聚合度并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖形成如下糖，后者具有至少为3的葡糖聚合度，并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原末端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者，而实质上不增加原料糖还原力；(2)分子量当在SDS-PAGE上测定时，具有约74,000到约160,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电聚焦电泳(isoelectrophoresis)上测定时，具有约3.8到约7.8的等电点。
(4)最适温度当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约40℃到约50℃的最适温度；当存在1mM Ca2+在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃到约55℃的最适温度；当在pH 8.4下温育60分钟时，具有60℃的最适温度；当存在1mM Ca2+在pH 8.4下温育60分钟时，具有65℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育60分钟时，具有约6.0到约8.4的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+在pH 6.0下温育60分钟时，具有约50℃或更低温度的热稳定区；当在pH 8.0下温育60分钟时，具有约55℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+在pH 8.0下温育60分钟时，具有约60℃或更低温度的热稳定区；
(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有在约4.5到约10.0的pH稳定区。
(8)N-末端氨基酸序列酪氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-异亮氨酸，组氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸，丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶有用的底物包括具有1，4-糖苷键的多糖，如淀粉，支链淀粉，直链淀粉和糖原；以及可由用淀粉酶，酸，等部分水解上述多糖获得的淀粉部分水解物，如淀粉糊精，麦芽糖糊精以及麦芽寡糖。这些具有α-葡糖苷连接键的葡糖基糖可以进一步用分支酶(EC 2.4.1.18)，例如底物的分支酶处理。用淀粉酶处理的葡糖基糖的淀粉部分水解物的例子是用如在《淀粉酶和相关酶手册》(Pergamon出版社，日本东京(1988)出版)中公开的α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)，麦芽三糖形成酶(EC 3.2.1.116)，麦芽四糖形成酶(EC 3.2.1.60)，麦芽五糖形成酶，和麦芽六糖形成淀粉酶(EC 3.2.1.98)水解的那些。在制备淀粉部分水解物的情况下，可以任意使用脱支酶，如支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和异淀粉酶(EC 3.2.1.68)。
作为底物的淀粉包括来源于农作物的地上淀粉，如玉米，小麦以及稻米淀粉；以及地下淀粉，如土豆，甜土豆以及木薯淀粉。更优选地，这些淀粉使用时被胶化和/或液化成液态形式。部分水解程度越低，环四糖的产率越高，因此，DE设定到约20的水平或更低，优选地，约12或更低以及更优选地，约5或更低。
本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的转移反应的受体包括了上述底物本身，单糖如葡萄糖，木糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，岩藻糖，山梨糖以及N-乙酰氨基葡萄糖；寡糖如海藻糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，纤维二糖，龙胆二糖，乳糖以及蔗糖；以及其它如麦芽糖醇和L-抗坏血酸。
底物的浓度没有特别限定，本发明的酶促反应甚至在低至0.1％(w/w)(此后在本说明书中，“％(w/w)”缩写为“％”，除非有特别注明)的浓度下进行，然而，百分之一或更高的浓度是用于工业规模产生优选地的。底物溶液可以是以悬浮液形式的那些，其包含不完全溶解的不溶性底物。底物浓度优选地是40％或更低，更优选地是30％或更低。
用于本发明的酶促反应的温度是进行酶促反应的那些，即，不超过约65℃的那些，更优选地是约30℃到约55℃。用于酶促反应的pH通常设定为4.5-10，优选地约5.5到约9。用于酶促反应的时间可以依据酶促反应效率适当被设定。
通过将由上述酶促反应形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖与α-异麦芽糖基转移酶接触，环四糖以令人满意产率产生。可以使α-异麦芽糖基转移酶在上述作用并且灭活本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶后作用在底物上。优选地，这些α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶可以组合使用，以便促进从淀粉或其部分水解物以约30％(d.s.b.)或更高的高产率产生环四糖以及以约80％(d.s.b.)，或更高的产率从糖原产生环四糖。基于两种酶的反应性质，可以按下述估计上述结合使用的的环四糖的形成机制(1)本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用在如下糖的非还原端的α-1，4葡糖基残基上，以释放葡萄糖残基，所说的糖具有至少两个葡萄糖聚合并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键，如淀粉，糖原以及淀粉部分水解物；然后释放的葡萄糖残基分子间转移到其它糖的葡萄糖C-6上的羟基基团上，形成在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的糖；(2)α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的糖，然后分子间把此残基转移到在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的其它糖的葡萄糖残基C-3上的羟基基团上，形成在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖；(3)α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖，以便通过分子间转移作用从糖释放异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基，然后环化所释放的异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基糖成为环四糖；以及(4)通过步骤(1)(3)，环四糖从所产生的没有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的糖形成，通过依次重复步骤(1)到(3)，环四糖的产率高度提高。
如上所解释的，可以估计，当组合使用时，本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶重复作用在它们的底物上，以增加环四糖的产率。
在环四糖形成反应期间，其它糖转移酶任选可以有利地组合使用，以改进环四糖的产率；当使两种类型的酶，即，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用在，例如，约15％的淀粉部分水解物溶液上时，环四糖以约55％的产率产生，而使用三种类型的酶，即，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶以及环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase)时，在与以上相同的条件下，增加环四糖的最大产率约5-10％，达到约60-65％的改进的产率。
在形成的环麦芽糖糊精的情况下，可以通过使用微生物的培养方法产生，所说的微生物能够产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两者，所说的转移酶特异性地水解由α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖的α-异麦芽糖基部分和其余α-葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移到受体。
作为用于上述使用微生物的方法的培养基，任何合成或天然培养基都可以使用，只要它们含有具有至少为2的葡糖聚合度和在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖，并且其中微生物可以生长。至于其它培养微生物的条件，可以使用用来形成本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的那些。
通过上述酶促反应与培养获得的培养物可以完整地作为包含环四糖或环四糖糖组合物的溶液使用。一般来说，在使用之前，可以采用单独或组合的下列纯化方法对它们进行纯化活性炭脱色，H或OH形式的离子交换树脂脱盐以及柱色谱如离子交换柱色谱，用活性炭的柱色谱以及硅胶柱色谱，用有机溶剂如醇和丙酮的分离，采用适当的可分离性的膜分离，使用酶(如淀粉酶，包括α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)以及α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20))的剩余糖水解，通过酵母发酵或碱处理除去剩余糖的水解。
特别是，离子交换柱色谱优选地用作工业规模的产生方法；强酸性阳离子交换树脂柱色谱，公开于如日本专利公开23,799/83和72,598/83中。用柱色谱，污染糖可以除去，以便有利地产生具有改进含量目标糖的环四糖或包含它的糖组合物。在这种情况下，固定床，移动床以及半移动床方法可以适当使用。
所产生的环四糖与包含它的糖组合物可以适当地浓缩成糖浆产品，并任选地将它们进一步干燥成粉状产品。
为了产生环四糖晶体，例如，在95℃或更低的温度下，优选地在10-90℃温度下，在0.1-20％d.s.b环四糖晶体种子存在时，将具有约30-90％浓度和约至少50％纯度环四糖的高环四糖含量溶液置于结晶罐(任选存在有机溶剂)中，然后在搅拌下逐渐冷却，以获得糖膏(massecuites)。收集环四糖晶体和具有这样的晶体的糖浆的方法包括，例如，常规方法，如分离，块粉碎，流态化粒化和喷雾干燥法。
根据本发明所产生的环四糖是稳定的，高质量的，低甜度，非还原性白色粉末，甚至与下列物质混合或加工时几乎没有褐变，无气味，不变质该物质特别是，例如含氨基酸的物质，如氨基酸，寡肽以及蛋白质。
因为环四糖具有包含能力，它有效地抑制风味组份和有效组份扩散和变质，并且稳定地保持它们。为了这一目的，如果必要，组合使用环四糖和其它环状糖，如环糊精，分支环糊精，环葡聚糖以及环果聚糖，可以有利地改进环四糖包含能力的水平。在本发明中有用的上述环状糖，如环糊精不应该限定成具有高纯度的那些，并且可以有利地是相对低纯度的环四糖，如包含大量麦芽糖糊精与环糊精的淀粉部分水解物。
因为环四糖不被淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解，所以，当口头使用时，它实质上不被身体同化。该糖实质上也不被肠道微生物同化，因此它可以用作非常低热量的水溶性饮食纤维。环四糖实质上也可以用作甜味剂，基本上不造成齿龋，因为它简直不被齿龋诱导微生物同化。该糖抑制粉状产品的粘着和凝固。本发明的环四糖本身是一种具有满意稳定性而无毒性、害处和副作用的天然甜味剂，并且因为这些，其可以有利地用于片剂、糖衣片剂，与赋形剂，例如支链淀粉，羟乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮组合。此外，环四糖具有控制渗透能力的性质，填充能力，赋予光泽能力，保温能力，粘性，对其它糖的结晶阻止能力，无实质上的可发酵性等等。
这样，本发明的环四糖和包含它的糖组合物在各种组合物，如食品，烟草，香烟，饲料，宠物食品，化妆品以及药物中，可以任意用作甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，稳定剂，脱色预防剂，赋形剂，等等。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以与一种或多种其它甜味剂结合使用，例如，粉化的糖浆，葡萄糖，异构化糖，蔗糖，麦芽糖，海藻糖，蜂蜜，枫树糖，山梨糖醇，麦芽醇，二氢查耳酮，斯替维苷，α-葡基斯替维苷，Momordica grosvenori甜味剂，甘草甜素，祝马丁，L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K，sucralose，甘氨酸以及丙氨酸；以及填料如糊精，淀粉以及乳糖。特别是，环四糖和包含它的糖组合物可以适当地与一种或多种低热甜味剂，如内消旋赤藓糖醇，木糖醇以及麦芽糖醇组合用作低热甜味剂，饮食甜味剂等；或者与一种或多种相对高甜度的甜味剂，如α-葡糖基斯替维苷，祝马丁，L-天冬氨酰基L-苯丙氨酸甲基酯，糖精，丁磺氨K以及sucralose结合使用。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意地原封不动地使用，或者在与填料、赋形剂，结合剂等混合后，并形成具有不同形状，如颗粒，球体，平板，立方体以及片状的产品后使用。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物与其它具有酸味，酸性，咸味，美味，涩性以及苦味的有味物质很好地调好；并且具有令人满意的高酸和热耐受性。这样，它们可以极好地用作甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，等等，以增甜和/或改进一般食品的味道和质量，这些食品例如，酱油，粉状酱油，味噌，″funmatsu-味噌″(一种粉状味噌)，″moromi″(一种精炼的清酒)，″hishio″(一种精炼的酱油)，″furikake″(一种熟化的鱼粉)，蛋黄酱，调味品，醋，″sanbai-zu″(一种糖调味汁，酱油和醋)，″funmatsu-sushi-su″(sushi的粉状醋)，″chuka-nomoto″(一种中国鱼的即时混合物)，″tentsuyu″(日本深度脂肪油炸食品的调味汁)，″mentsuyu″(日本细面条调味汁)，调味汁，酱，″yakinik-no-tare″(日本烤肉的调味汁)，咖哩roux，即时炖汤混合物，即时汤混合，″dashi-no-moto″(一种即时储备混合物)，混合调味品，″mirin″(一种甜饼)，″shin-mirin″(一种合成的mirin)，片状糖以及咖啡糖。
本发明的环四糖和包含它的糖组合物也可以任意地用于下列食品的增甜和/或改进味道和质量″Wagashi″(日本蛋糕)，如″senbei″(稻米饼干)，″arare″(稻米蛋糕块)，″okoshi″(小米和稻米蛋糕)，″gyuhi″(淀粉糊状物)，″mochi″(稻米糊状物)和等，″manju″(具有豆果酱的小面包)，″ufro″(一种甜稻米果子冻)，″an″(大豆酱)等，″yokan″(一种大豆的甜果子冻)，″mizu-yokan″(一种软adzuki豆果子冻)，″kingyoku″(一种yokan)，果冻，pao de Castella以及″amedama″(一日本太妃糖)；西方糕饼，如小面包，饼干，小甜点，馅饼，布丁，黄油奶油，乳蛋糕奶油，奶油蓬松饼，华夫饼干，海绵蛋糕，油炸圈饼，巧克力，咀嚼树胶，焦糖糖果，奶油杏仁糖以及冰糖；冻结甜食，如冰激凌与sherbet；糖浆，如″kajitsu-no-syrup-zuke″(一种保存的水果)和″korimitsu″(削刮冰的糖浆)；糊状物，如面粉糊状物，花生糊状物以及水果糊状物；加工的水果和蔬菜，如果酱，″syrup-zuke″(泡菜水果)以及″toka″(保存的)；泡菜和盐渍产品，如″fukujin-zuke″(红色小萝卜泡菜)，″bettarazuke″(一种整株新鲜小萝卜泡菜)，″senmai-zuke″(一种片块新鲜小萝卜泡菜)以及″rakkyo-zuke″(盐渍冬葱)；泡菜和盐渍产品的预混合，如″takuan-zuke-no-moto″(一种盐渍小萝卜预混合物)以及″hakusai-zuke-no-moto″(一种新鲜白油菜泡菜预混合物)；肉产品，如火腿与香肠；鱼肉产品，如鱼火腿，鱼香肠，″kamaboko″(一种蒸鱼糊状物)，″chikuwa″(一种鱼糊状物)以及″tenpura″(一种日本深度脂肪油炸鱼糊状物)；″chinmi″(调味品)，如″uni-no-shiokara″(海顽童盐肠)，″ika-noshiokara″(枪乌贼的盐肠)，″su-konbu″(加工过的昆布)，″saki-srume″(干燥的枪乌贼带)，″fugu-no-mirin-boshi″(干燥的mirin-seasoned河豚)，熟化鱼粉，如太平洋鳕，海鲤科食用鱼，小虾，等的；″tsukudani″(在酱油中煮沸的食品)，如紫菜类，可食用的野植物，干燥枪乌贼，小鱼以及牡蛎；日常菜，如″nimame″(烹调的大豆)，马铃薯色拉以及″konbu-maki″(昆布卷)；牛奶产品；罐装和瓶装产品，如肉，鱼肉，水果以及蔬菜的那些；醇饮料，如合成的，发酵酒，sake，水果酒，发光醇饮料，啤酒；软饮料，如咖啡，可可，汁液，碳酸盐饮料，酸奶饮料以及包含乳酸菌的饮料；即时食品，如即时布丁混合物，即时热蛋糕混合物，即时汁液或软饮料，即时咖啡，″sokuseki-shiruko″(把adzuki豆汤与稻米蛋糕即时混合)以及即时汤混合物；以及其它食品和饮料，如婴儿固体食品，食疗食品，健康/滋补饮料，肽类食品以及冻结食品。本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意延长或保持新鲜烤制日本和西方糖食的味道与风味，并改进动物和宠物如家养动物，家禽，蜂蜜蜜蜂，蚕以及鱼的饲料和宠物食品的口味；而且，它们也可以任意作为甜味剂，味道改善剂，调味剂，质量改善剂和稳定剂以用在浆状物或糊状物形式的其它产品，如烟草，香烟，牙膏，口红，胭脂，唇油，内服液态药，片剂，锭剂，滴状鳕肝油，软糖，口服清凉剂，漱口剂，化妆品以及药物中。当用作质量改善剂或稳定时，本发明的环四糖和包含它的糖组合物可以任意地用于易于丧失其有效组份与活性的生物学活性物质以及包含生物学活性物质的健康食品和药物中。这样的生物学活性物质的例子是包含淋巴因子，如α-，β-或γ-干扰素，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，巨噬细胞迁移抑制因子，集落刺激因子，转移因子以及白细胞介素2的液态制剂；包含激素如胰岛素，生长激素，促乳素，红细胞生成素以及卵泡刺激激素的液态制剂；生物学制剂如BCG疫苗，日本脑炎疫苗，麻疹疫苗，活小儿麻痹症疫苗，天花疫苗，破伤风类毒素，竹叶青属抗毒素以及人类免疫球蛋白；抗生素如青霉素，红霉素，氯霉素，四环素，链霉素以及卡那霉素硫酸盐；包含维生素如硫胺素，核黄素，L-抗坏血酸，鳕肝油，类胡萝卜素，麦角甾醇以及生育酚的液态制剂；高度不饱和脂肪酸和其酯衍生物如EPA，DHA以及花生四烯酸；酶如脂肪酶，弹性蛋白酶，尿激酶，蛋白酶，β-淀粉酶，异淀粉酶，葡聚糖酶以及乳糖酶的溶液；抽提物如人参抽提物，猛海龟抽提物，小球藻属抽提物，芦荟抽提物以及蜂胶抽提物；以及蜂王浆。通过使用本发明的环四糖和包含它的糖组合物，上述生物学活性物质以及活微生物如病毒，乳酸菌以及酵母的其它浆状物可以任意制备成液体，糊状物，固形物形式的健康食品和药物，其具有令人满意的高稳定性和质量，不担心丧失或失活其有效成份与活性。
如上所述，当与其它组份(一般外用)一起使用时，下列作用和特性也有效地发挥抑制挥发或保持芬芳和风味组份，抑制脱水收缩、其它糖的结晶以及蛋白质、脂质以及活性组份变质，保持湿润以及稳定乳化状态，其由环四糖和包含它的糖组合物发挥；以及稳定性和填料赋予能力的特性，其是环四糖和糖固有的。
类似于其它天然存在的糖，因为本发明的环四糖和包含它的糖组合物在使用到皮肤上时几乎不刺激皮肤，在皮肤中有效地保持湿润，所以它们可以有利地掺入到外用皮肤组合物中使用。在外用皮肤组合物中，本发明的环四糖和包括的糖组合物通常用于与下列一种或多种皮肤学上适用的其它组份适当地组合使用油和脂质，蜡，碳氢化合物，脂肪酸，酯，醇，表面活性剂，染料，香味剂，激素，维生素，植物抽提物，动物抽提物，微生物抽提物，盐，紫外吸收剂，光致敏染料，抗氧剂，防腐剂/杀菌剂，止汗剂/防臭剂，提神剂，螯合剂，皮肤增白剂，抗炎剂，酶，糖，氨基酸以及增稠剂。例如，在化妆品领域中，外用皮肤组合物可以洗液膏，乳状洗液，凝胶，粉末，浆状物或者块状物的形式提供，例如，清洁化妆品，如肥皂，化妆皂，皮肤洗涤粉，洗面霜，洗面剂，身体香波，身体洗液，香波以及洗发粉；头发化妆品，如成套洗剂，头发喷剂，润发油，发乳，发蜡，发胶，发液，头发滋补剂，头发洗剂，生发剂，头发染料，头皮处理剂，头发化妆品，增光发油，发油以及梳头油；基础化妆品，如化妆洗剂，雪花膏，润肤霜，润肤洗剂，胶冻，胶冻擦剂，糊状洗剂，粉末，清洁霜，冷霜，手霜，手洗剂，乳状洗剂，保湿液，剃须前/后洗剂，剃须后霜，剃须后泡沫，剃须前霜以及婴儿油形式的化妆盒；补充化妆品，如以液体，霜或固体形式的粉底，滑石粉，婴儿粉，体粉末，香料粉，化妆基料，以霜，糊状物，液体，固体或粉末形式的粉料，眼影，眼霜，睫毛油，眉笔，睫毛化妆品，口红，口红洗剂；芳香化妆品，如芳香剂，膏状/粉状芳香剂，科隆香水(eau deColognes)，香水Colognes以及香水(eau de toilette)；日晒和防晒化妆品如防晒霜，防晒洗剂以及防晒油；指甲化妆品，如修指甲材料，修脚材料，指甲颜料，指甲漆以及指甲化妆品材料；眼线膏化妆品；口红和唇膏，如唇膏，唇油，糊状胭脂以及唇上光剂；口腔化妆品，如牙膏和口洗涤剂；以及沐浴化妆品，如浴盐/油以及沐浴化妆材料。在药物领域中，外用皮肤组合物可以以湿敷布，喷射剂，敷贴剂，浴剂，粘着剂，软膏，糊状物，涂擦剂，洗剂以及泥敷剂的形式提供。
可以和环四糖和包含它的糖组合物一同掺入外用皮肤组合物的其它组份的具体例子是油和脂肪，包括在室温下为液体形式的植物油，如鳄梨油，杏仁油，橄榄油，芝麻油，红花油，大豆油，山茶油，桃仁油，蓖麻油以及棉子油；在室温下为固体形式的植物脂肪，如可可脂肪，棕榈脂/油以及植物蜡；以及动物油，如貂油，蛋黄油以及海龟油。
在本发明中有用的蜡的例子是，植物蜡如hohoba油，巴西棕榈蜡以及小烛树蜡；动物蜡如鲸蜡油，Baird’s槌鲸油，蜂蜡，鲸油以及羊毛脂；以及矿物油如褐煤蜡。
在本发明中有用的碳水化合物是，例如，矿物碳水化合物，如石蜡或固体石蜡，液态石蜡，地蜡，微晶蜡以及矿脂；以及动物碳氢化合物，如角鲨烷和角鲨烯。
在本发明中有用的脂肪酸的例子是月桂酸，豆蔻酸，棕榈酸，硬脂酸，油酸，山嵛酸，十一碳烯酸，羊毛脂脂肪酸，硬羊毛脂脂肪酸，软羊毛脂脂肪酸，异硬脂酸以及其衍生物。
在本发明中有用的醇类是，例如，高级醇，包括多元醇，如月桂醇，鲸蜡醇，seto十八烷醇，十八烷醇，油醇，二十二烷醇，羊毛脂醇，氢化羊毛脂醇，己基癸醇，辛基十二烷醇以及聚乙二醇；低级醇，包括多元醇，如乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，乙二醇，丙二醇以及甘油；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的酯的例子是，月桂酸己基酯，豆蔻酸异丙基酯，豆蔻酸十四烷基酯，豆蔻酸鲸蜡基酯，豆蔻酸辛基十二烷基酯，棕榈酸异丙基酯，硬脂酸丁基酯，胆甾醇硬脂酸酯，胆甾醇乙酸酯，胆甾醇n-乳酸酯，胆甾醇己酸酯，胆甾醇月桂酸酯，胆甾醇肉豆蔻酸酯，胆甾醇棕榈酸酯，胆甾醇硬脂酸酯，胆甾醇12-羟基硬脂酸酯，油酸癸酯，油酸辛基十二烷基酯，羊毛脂脂肪酸异丙基酯，甘油三豆蔻酸酯，丙二醇二油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鲸蜡基酯，羊毛脂乙酸酯，二甲基辛酸己基癸基酯以及它们的衍生物。
在本发明中有用的表面活性剂是，例如，阴离子表面活性剂，如月桂酸锌，豆蔻酸锌，棕榈酸锌，硬脂酸镁，十二烷基硫酸钠，聚氧乙烯月桂基醚硫酸钠，三乙醇胺聚氧乙烯月桂基醚硫酸盐，聚氧乙烯鲸蜡基醚磷酸盐，聚氧乙烯烷基苯基醚磷酸盐，N-十二烷基肌氨酸钠，椰子脂肪酸肌氨酸三乙醇胺，椰子脂肪酸钠甲基牛磺酸以及大豆磷脂；阳离子表面活性剂如氯化硬脂酰三甲基铵，氯化二硬脂酰二甲基铵，氯化苯甲烃铵，氯化鲸蜡基吡啶鎓，溴化烷基异喹啉鎓以及溴化十二烷基二甲基2-苯氧乙基铵；兼性离子表面活性剂如β-月桂基氨基丙酸钠，甜菜碱月桂基二甲基氨基乙酸酯以及2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉鎓甜菜碱；非离子型表面活性剂如甘油一硬脂酸酯，自乳化的，甘油一硬脂酸酯，亲脂的脱水山梨糖醇一月桂酸酯，脱水山梨糖醇一油酸酯，蔗糖脂肪酸酯，十一碳烯酸一乙醇胺，椰子油二乙醇胺，聚乙二醇一油酸酯，乳酸肉豆蔻基酯，乳酸鲸蜡基酯，聚氧乙烯鲸蜡基醚，聚氧乙烯辛基苯基醚，聚氧乙烯山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇一月桂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇一硬脂酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯，聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯，聚氧乙烯蓖麻油以及聚氧乙烯氢化蓖麻油；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的染料例子是，红焦油染料如，赤藓红，苋菜红，玫瑰红，酸性红，色淀红C，立索红，若丹明，亮色淀红，曙红YS，紫胺R，亮坚牢深红，丽春红R，橙色焦油染料如二溴荧光素，永久橙，赤藓红黄NA以及橙色I；黄色焦油染料如酒石黄，晚霞黄，荧光素钠，联苯胺黄G，萘酚黄S以及黄AB；绿色焦油染料如固绿FCF，茜素菁蓝绿F，浅绿SF黄以及萘酚绿B；蓝色焦油染料如亮蓝FCF，靛蓝胭脂红，靛蓝，专利蓝NA，carbanthrene蓝以及苏丹蓝；棕色焦油染料如间苯二酚棕；紫色焦油染料如茜素紫；黑色焦油染料如萘酚蓝黑；无机颜料，如氧化锌，氧化钛，氢氧化钴，氢氧化铝，滑石，陶土，云母，皂土，紫罗兰锰以及云母钛；类胡萝卜素颜料，如β-类胡萝卜素，番茄红素以及藏红花素；黄酮类颜料，如sisonine，藏红花黄，芸香苷以及栎精；黄素颜料，如核黄素；醌颜料，如胭脂虫红，茜素以及shikonin；以及它们的衍生物。
一般在外用皮肤用品中使用的香料粗略地可以分成天然植物以及动物香料，合成香料以及它们适当组合的混合物。动物香料的例子包括麝香，灵猫酮以及龙涎香。植物香料，例如，蒸溜物，即，可由蒸馏获得精油，例如，用水蒸发茴香种子，罗勒叶，藏茴香果，肉桂皮，胡荽种子，熏衣草花，肉豆蔻种子，薄荷叶，玫瑰花，迷迭香花、种子及叶，以及麝香草叶；一般依据性质和方法分类成纯净物，树脂状物质，含油树脂和酊剂的抽提物。合成香料的例子是苯乙酮，茴香醚，苄基醇，乙酸丁基酯，樟脑，柠檬醛，香茅醇，枯茗醛，蒿脑，乙基香兰酮，醋酸香叶酯，linarol，薄荷醇，甲基对-甲酚，水杨酸甲基酯，乙酸苯基酯，香兰素以及它们的衍生物。在本发明中，可以任意使用与以上所述香料适当组合的组合物。
在本发明中有用的激素包括，例如，卵泡激素如雌酮和雌二醇；促孕素，如孕甾酮和孕烯醇酮；以及肾上腺皮质激素如可的松，氢化可的松以及泼尼松龙。在本发明中有用的维生素是，例如，维生素A类化合物如视黄醇，视黄酸，α-，β-和γ-胡萝卜素以及它们的衍生物；维生素B类化合物如硫胺素(维生素B1)，核黄素(维生素B2)，维生素B6，包括吡哆醇，吡哆醛以及吡哆胺以及它们的衍生物；维生素C类化合物如L-抗坏血酸，2-O-α-D-葡糖基-L-抗坏血酸，L-抗坏血酸和葡糖基-L-抗坏血酸的酰基衍生物，别名亲脂性维生素C，以及L-抗坏血酸的其它酸衍生物如L-抗坏血酸的硫酸酯；维生素D类化合物如麦角骨化醇，胆钙化醇以及它们的衍生物；以及维生素E类化合物如α-，β-和γ-和δ-生育酚，α-，β-和γ-和δ-tocotrienol以及它们的衍生物。
除了以上提到的用作香料的植物抽提物之外，在本发明中有用的植物抽提物的例子是，抽提物如春黄菊，鼠尾草，芦荟，深红鼠尾草，Angelica keiskei，鳄梨树，荨麻，茴香，乌龙茶，coak树皮，大麦，咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)，甜胡椒，海草，木瓜，甘草，温桲子，栀子，Sasa albo-marginata，肉桂，红茶，米糠，发酵米糠，Stevia rebaudiana，芹菜，日本绿色龙胆，大豆，麝香草，茶，普通山茶，日本当归，玉米，胡萝卜，Rosa rugosa，hinoki(日本柏树)，丝瓜，红花，松树，桃子，桉树，爬行虎耳草，yuzu(圆佛手柑)，百合花，薏苡，艾类植物，Cyanophta(蓝绿藻类)，海草，苹果，粘质沙雷氏菌以及莴苣的那些；以及从植物分离的化合物如扁柏酚，甘菊环，叶绿素以及甘草甜素。在本发明中有用的动物抽提物包括胎盘抽提物。
微生物的抽提物的例子是酵母提取物。在本发明的外用皮肤组合物有用的盐有利地包括可以一般用于常规外用皮肤组合物的那些以及海水，深海水，海水干燥组份以及天然盐，包括液体形式的那些，如矿物盐。
在本发明中有用的紫外吸收剂包括，例如，对-氨基苯甲酸，对-二甲基氨基苯甲酸乙己基酯，对-甲氧基肉桂酸乙己基酯，2-(羟基-5-甲苯基)苯并三唑，oxibenzozone，尿刊酸，尿刊酸乙酯以及它们的衍生物；能够遮蔽紫外线的有机物质如5-氯尿嘧啶以及鸟嘌呤胞嘧啶。在本发明中有用的光敏染料的例子是2，2’[3’-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亚噻唑啉-2-基)亚乙基]亚丙烯基]双[碘化3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓]别名″PLATONIN″，碘化2-[2-(3-庚基-4-甲基-2-亚噻唑啉-2-基)次甲基]-3-庚基-4-甲基噻唑啉鎓别名″PIONIN″，6-[2-[(5-溴-2-吡啶基)氨基]乙烯基]-1-乙基-2-甲基吡啶鎓别名″TAKANAL″，碘化2-(2-苯胺乙烯基)-3，4-二甲基-噁唑啉鎓″LUMINEX″以及其衍生物。
除上述具有抗氧化能力的化合物之外，在本发明中有用的抗氧剂包括，例如，没食子酸丙酯，没食子酸丁酯，没食子酸辛酯，没食子酸十二酯，去甲二氢愈创木酸(NDGA)，叔丁基羟基苯甲醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，4-羟基甲基-1-2，6-二叔丁基苯酚以及它们的衍生物。
除上述的具有灭菌或杀菌活性的化合物之外，在本发明中有用的防腐剂和杀菌剂的例子包括，酚类化合物如苯酚，对氯间甲酚，树脂酚，对氧代苯甲酸以及甲酚；酸化合物包括以盐形式的那些，如苯甲酸，山梨酸，水杨酸以及硼酸；卤化双酚，如六氯苯，硫双二氯酚以及二氯苯；酰胺如3，4，4’-三氯carvaniride，十一碳烯酸一乙醇胺；季铵化合物如氯化苯甲烃铵，氯化苄甲乙氧铵以及氯化decalinium；氯己定盐酸盐，1-羟基吡啶-2-硫酮，溶菌酶氯化物；以及它们的衍生物。
在本发明中有用的止汗剂/除臭药是，例如，氯化铝，氯化锌，氯羟基铝，铝氯羟基尿囊素盐，铝二羟基尿囊素盐以及铝氯水合物。在本发明中有用的提神物的例子包括薄荷醇，薄荷/欧薄荷油，樟脑，百里酚，螺烷醇以及甲基水杨酸。在本发明中有用的螯合剂，例如，乙二胺四乙酸的衍生物，三聚磷酸，六异丁烯酸，二氢乙基甘氨酸，柠檬酸，酒石酸，葡糖酸以及糖酸。
除上述具有皮肤增白活性的化合物之外，在本发明中有用的皮肤增白剂是，例如，核酸如反义寡核苷酸，包括酪氨酸酶基因的反义寡核苷酸；曲酸，乳酸，邻氨基苯甲酸，香豆素，苯并三唑，咪唑啉，嘧啶，二噁唑，呋喃，吡喃酮，烟酸，熊果苷，贝加灵，贝加因，小檗碱以及它们的衍生物；黑色素形成抑制剂，酪氨酸酶形成抑制剂以及酪氨酸酶抑制剂。
除上述具有抗炎活性的那些之外，在本发明中有用的抗炎剂的例子包括，例如，尿囊素，尿囊素乙酰基-DL-甲硫氨酸，β-甘草次酸尿囊素盐，鱼石脂，吲哚美辛，乙酰水杨酸，苯海拉明氯化物，愈创蓝油烃，camazulene，氯苯那敏顺丁烯二酸盐，甘草甜素，甘草次酸以及orentalgromurel抽提物。在本发明中有用的酶的例子是来自芽孢杆菌属和链霉菌属微生物和酵母的那些；以及来源于植物和动物的那些，如蛋白酶，脂肪酶以及溶菌酶。
在本发明中有用的糖是例如，寡糖如蔗糖，麦芽糖，果糖，乳糖以及海藻糖；环四糖以外的环状糖，如环糊精；糖醇如麦芽糖醇，山梨糖醇，甘露糖醇，木糖醇以及阿拉伯糖醇；多糖如透明质酸，硫酸软骨素，支链淀粉，纤维素，淀粉，葡聚糖，果胶，角叉菜胶，瓜尔胶，玉米浆，阿拉伯树胶，黄蓍胶，黄原胶以及壳多糖，它们的衍生物和部分水解物。在本发明中有用的氨基酸是甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，胱氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，2-吡咯烷酮-5-羧酸，羟基脯氨酸，哌可酸，肌氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，瓜氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸磺酸，精氨酰琥珀酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸，鸟氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，β-丙氨酸，牛磺酸，β-氨基丁酸，γ-氨基丁酸，和它们的盐。
除上述具有粘性赋予能力的化合物之外，在本发明中有用的增稠剂包括，例如，水溶性高分子物质如温桲子，藻酸钠，阳离子化纤维素，羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，羧甲基淀粉，丙二醇藻酸盐，胶原，角蛋白，羟丙基三甲基铵氯化物醚，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙烯基吡咯烷酮-乙酸乙烯酯共聚物，聚乙烯亚胺，聚丙烯酸钠，聚乙烯基甲基醚以及羧乙烯基聚合物；电解质，如氯化钠，氯化钾以及硫酸钠；以及油料。
虽然上述例子不会完全覆盖上述例证性化合物/组份的匹配的盐(如果它们有这样的盐)，但任何外用皮肤剂可接受的盐(以上例证性的盐以外的)都可以任意用于本发明。
将本发明的环四糖或包含它的糖组合物掺入上述组合物的方法是这样的方法，其可以在完成它们的加工之前将环四糖和糖组合物掺入到各种组合物中，并且其可以适当选自下列常规方法混合，揉合，溶解，熔化，浸透，渗入，分散，敷涂，涂布，喷雾，注射，结晶以及固化。优选掺入最后组合物的环四糖或包含它的糖组合物的量通常在至少0.1％的量，希望至少1％。
下列实验详尽地解释本发明实验1通过培养制备非还原性环四糖将由5％(w/v)″PINE-DEX#1″(日本东京Matsutani化学公司市售的淀粉部分水解物)，1.5％(w/v)″ASAHIMEAST″(日本东京AsahiBreweries有限公司市售的酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁七水合物，和水组成的液体培养基以100ml的量置于500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种圆孢芽孢杆菌C9菌株，FERM BP-7143，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时，离心所形成的培养液，以除去细胞获得上清液。将上清液120℃高压灭菌15分钟，然后冷却，经离心除去不能溶解的物质，获得上清液。
为了在上清液中检查糖，使用正丁醇，吡啶以及水的混合物溶液(＝6∶4∶1)为展开剂，“KIESELGEL 60”(一种美国Rahway的Merck公司出售的用于TLC的铝板(20×20cm))为薄层板经硅胶薄层色谱(在下文中缩写为“TLC”)从上清液分离。
分离的总糖经硫酸-甲醇法着色，还原糖经联苯胺-苯胺法检测，非还原糖在前面的检测方法上为阳性，但在后面的检测方法上为阴性。并具有0.31的Rf值。
将检测之前的约90ml上清液调节到pH 5.0和45℃，在与每克1,500单位“TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM”(一种日本Aichi的Amano药物公司出售的α-葡萄糖苷酶)，每克75单位葡糖淀粉酶固体(日本京都的Nagase生物化学有限公司出售的)混合后，温育24小时。此后，所形成的培养物通过添加氢氧化钠调整到pH 12，煮沸2小时，以便分解剩余的还原糖。之后通过过滤除去不溶性物质，所产生的溶液用″DIAION PK218″和″DIAION WA30″，日本东京Mitsubishi化学工业有限公司出售的阳离子交换树脂，以及日本东京Mitsubishi化学工业有限公司出售的″DIAIONSK-1B″和″AMBERLITE IRA411″，日本东京的日本Organo公司出售的阴离子交换树脂，脱色和脱盐，接着以活性炭脱色，膜过滤，蒸发器浓缩，真空冻干，获得约0.6克(d.s.b.)糖粉。
在高效液相色谱(在下文简作″HPLC″)上的糖分析在10.84分钟洗脱时间发现一个单一峰，如图1所示，揭示糖具有99.9％或更高的高纯度。HPLC采用日本东京Showa Denko K.K.的″SHOWDEX KS-80l柱″，在60℃的柱温，0.5毫升/分钟水流速，日本东京Tosoh公司出售的″RI-8012″差示折射计进行。
当用Somogyi-Nelson’s法测定糖的还原力时，还原力在可检测的水平之下，揭示样品实质上是非还原糖。实验2非还原糖的结构分析以实验1的方法获得的非还原糖快原子轰击质谱(称为″FABMS″)明显检测到质量数为649的加质子分子离子，这意味这一糖具有648的质量数。
根据常规方式，用硫酸水解糖，然后进行糖组成分析。结果仅检测到D-葡萄糖，揭示糖是由D-葡萄糖分子组成的或考虑到上述质量数，是由四个D-葡萄糖分子组成的环四糖。
糖的核磁共振分析(称为″NMR″)给出如图2所示的1H-NMR光谱和如图3所示的13C-NMR光谱，将这些光谱与已知的糖比较，揭示它们与以下一种非还原的环状糖相符“欧洲生物化学杂志”(EuropeanJ.Biochemisty)pp.641-648(1994)中公开的环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}。这些数据确认本发明的糖是在图4所示的环四糖，即，环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}。实验3从圆孢芽孢杆菌C9(菌株C9)产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶将由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，日本东京Matsutani化学公司市售的淀粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″，日本东京AsahiBreweries有限公司市售的酵母提取物，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体培养基以分别100ml的量置于各500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种圆孢芽孢杆菌C9菌株，FERM BP-7143，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时进行种子培养。
将约20L用于上述种子培养的新制备的相同液体培养基置于30 L发酵罐，加热灭菌，然后冷却到27℃，用1％(v/v)种子培养物接种，接着在通气搅拌条件下于27℃和pH 6.0-8.0培养48小时。在培养完成之后，将具有约0.45单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，约1.5单位/mlα-异麦芽糖基转移酶以及约0.95单位/ml环四糖形成活性的所形成的培养物在10,000rpm下离心30分钟，以获得18L上清液。当测量酶促活性时，所述的上清液具有约0.45单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，即，约8,110单位的总酶促活性；约1.5单位/mlα-异麦芽糖基转移酶，即，约26,900单位的总酶促活性；以及约0.95单位/ml环四糖形成活性，即，约17,100单位的总酶促活性。
这些酶的活性按以下所述测定通过在100mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中溶解麦芽三糖，给出浓度为2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反应混合溶液60分钟，通过10分钟煮沸暂停反应混合物，以实验1中公开的HPLC定量测定在反应混合物中形成的异麦芽糖基麦芽糖和麦芽糖中的麦芽糖，由此测定本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶促活性。α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的一单位活性被定义为在上述酶促反应条件下每分钟形成一微摩尔麦芽糖的酶量。在整个说明书中，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶促活性意指如上测定的单位。
通过在100mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中溶解潘糖，给出浓度为2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反应混合溶液30分钟，通过10分钟煮沸暂停反应混合物，以葡萄糖氧化酶方法定量测定在反应混合物中形成的环四糖与葡萄糖中的葡萄糖，由此测定本发明的α-异麦芽糖基转移酶的酶促活性。α-异麦芽糖基转移酶的一单位活性被定义为在上述酶促反应条件下每分钟形成一微摩尔葡萄糖的酶量。在整个说明书中，α-异麦芽糖基转移酶的酶促活性意指如上测定的单位。
通过在50mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中溶解″PINE-DEX#100″，日本东京Matsutani化学公司市售的淀粉部分水解物，给出浓度为2％(w/v)的底物溶液，添加0.5ml酶溶液的至0.5ml底物溶液中，在35℃下酶促反应混合溶液60分钟，通过10分钟煮沸暂停反应混合物，进一步向所形成的混合物中添加1毫升50mM乙酸盐缓冲液(pH5.0)以及70单位/ml″TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM″(一种由日本Aichi的Amano药物公司出售的α-葡萄糖苷酶)，27单位/ml日本京都Nagase生物化学公司出售的葡糖淀粉酶，在50℃下温育60分钟，通过在100℃下加热10分钟灭活剩余的酶，并以类似实验1的HPLC定量测定环四糖，由此测定本发明的环四糖形成活性。环四糖形成活性的一单位活性被定义为在上述酶促反应条件下每分钟形成一微摩尔环四糖的酶量。在整个说明书中，环四糖形成活性意指如上测定的活性(单位)。实验4从圆孢芽孢杆菌C9制备酶实验4-1将实验3的上清液18 L用80％饱和硫酸铵盐析，使其在4℃下静置24小时，所形成的沉淀在10,000rpm下由离心30分钟收集，溶解在10mM磷酸缓冲液(pH7.5)中，对新制备的相同缓冲液透析，以获得约400毫升具有8,110单位的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，24,700单位的α-异麦芽糖基转移酶和约15,600单位的环四糖形成活性的粗酶溶液。将粗酶溶液用1,000ml″SEPABEADS FP-DA13″凝胶(一种日本东京的Mitsubishi化学工业公司出售的离子交换树脂)进行离子交换色谱。α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶与环四糖作为没有吸附在离子交换树脂上的非吸附组份被洗脱掉。所产生的酶溶液对具有1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析，离心透析溶液除去杂质，并用500ml″SEPHACRYLHR S-200″(一种由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝胶)进行亲和色谱。酶促活性组份吸附在凝胶上，当依次用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度，麦芽四糖从0mM增加至100mM的线性梯度洗脱时，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶以及α-异麦芽糖基转移酶分别洗脱，即，前者由在约30mM的麦芽四糖线性梯度洗脱以及后者由在约0M的硫酸铵线性梯度洗脱。这样，分别收集具有根据本发明的α-异麦芽糖基-转移活性的组份和α-异麦芽糖基葡糖基糖-形成活性的那些。在任何上述组份中没有发现任何环四糖形成活性，这说明具有α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的上述组份的混合物溶液也具有环四糖形成活性，也说明由淀粉部分水解物形成环四糖的活性由上述两种类型酶活性共同作用发挥。
用于分别纯化本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的方法在以下描述实验4-2α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化将在实验4-1中获得的本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶组份对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将透析溶液离心，以除去不溶性杂质，将所产生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650M″(日本东京Tosoh公司出售的凝胶)进行疏水色谱。酶吸附在凝胶上，但用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱时，在约0.3M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份。将组份集中，并再一次对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去杂质，并用″SEPHACRYL HR S-200″凝胶的亲和色谱纯化酶。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表1中显示。
表1酶*活性酶*的比活性 产率纯化步骤(单位) (单位/mg蛋白质)(％)培养上清液 8,110 0.12 100硫酸铵盐析后的透析溶液7,450 0.56 91.9从离子交换柱色谱的洗脱物 5,850 1.03 72.1亲和柱色谱的洗脱物4,040 8.72 49.8疏水柱色谱的洗脱物3,070 10.6 37.8亲和柱色谱的洗脱物1,870 13.6 23.1注符号″*″意指本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。
最后纯化的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶样品在用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上进行纯度测定，在凝胶上检测到为单一蛋白质的带，即，一个高纯度的酶样品。实验4-3α-异麦芽糖基转移酶的纯化将已经在实验4-1中被亲和色谱与具有α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的组份分离的α-异麦芽糖基转移酶组份对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去杂质，用″SEPHACRYL HR S-200″凝胶进行亲和色谱。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表2中显示。
表2酶*活性酶*的比活性 产率纯化步骤(单位)(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液26,9000.41100用硫酸铵盐析后的透析溶液 24,7001.8591.8从离子交换柱色谱的洗脱物 19,4003.4172.1亲和柱色谱的洗脱物 13,40018.649.8疏水柱色谱的洗脱物 10,00021.337.2亲和柱色谱的洗脱物 6,460 26.924.0注符号″*″意指本发明的α-异麦芽糖基转移酶。实验5α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的性质实验5-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质对在实验4-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约140,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有5.2±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响依据酶活性测定方法测定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下测定温度的影响。这些结果显示在图5(温度影响)和图6(pH影响)中。当在pH6.0下温育60分钟时，酶的最适温度是约40℃(在缺乏1mM Ca2+下)和约45℃(在存在1mM Ca2+下)。当在35℃下温育60分钟时，酶的最适pH是约6.0到约6.5。酶的热稳定性通过以下方法测定在存在或缺乏1mM Ca2+时在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图7(热稳定性)和图8(pH稳定性)中显示。结果，在1mM Ca2+缺乏时酶具有不超过约35℃的热稳定性，在1mM Ca2+存在时酶具有不超过约40℃的热稳定性，以及约4.5到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响。结果在表3中显示。
表3金属离子 相对活性(％)金属离子相对活性(％)无100Hg2+4Zn2+92 Ba2+65Mg2+100Sr2+80Ca2+115Pb2+103Co2+100Fe2+98Cu2+15 Fe3+97Ni2+98 Mn2+111Al3+99 EDTA20如表3的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制，也被Ba2+和Sr2+抑制。也发现酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示该酶在N-末端区具有SEQ ID NO1的部分氨基酸序列，即，酪氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-异亮氨酸。实验5-2α-异麦芽糖基转移酶的性质对在实验4-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约112,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有5.5±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响依据酶活性测定方法测定。这些结果显示在图9(温度影响)和图10(pH影响)中。当在pH6.0下温育30分钟时，酶的最适温度是约45℃。当在35℃下温育30分钟时，酶的最适pH是约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图11(热稳定性)和图12(pH稳定性)中显示。结果，酶具有不超过约40℃的热稳定性，约4.0到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响。结果在表4中显示。
表4金属离子相对活性(％) 金属离子 相对活性(％)无 100 Hg2+1Zn2+88Ba2+102Mg2+98Sr2+101Ca2+101 Pb2+89Co2+103 Fe2+96Cu2+57Fe3+105Ni2+102 Mn2+106Al3+103 EDTA 104如表4的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也发现酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶在N-末端区具有SEQ ID NO2的部分氨基酸序列，即，异亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸-组氨酸-丙氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-甘氨酸。实验6从圆孢芽孢杆菌C11(菌株C11)产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶将由4.0％(w/v)″PINE-DEX #100″，淀粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一种酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体培养基以分别100ml的量置于500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种圆孢芽孢杆菌C11菌株，FERM BP-7144的贮存培养物，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时进行培养。集中所形成的培养物，并用作种子培养物。
将约20L用于上述种子培养的新制备的相同营养培养基置于30L发酵罐，加热灭菌，然后冷却到27℃，用1％(v/v)种子培养物接种，接着在通气搅拌条件下于27℃和pH 6.0-8.0培养48小时。将具有约0.55单位/ml α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，约1.8单位/ml α-异麦芽糖基转移酶活性以及约1.1单位/ml环四糖形成酶活性的所形成的培养物在10,000rpm下离心30分钟，以获得18L上清液。上清液测定表明，其具有约0.51单位/mlα-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，约9,180单位的总酶促活性；约1.7单位/mlα-异麦芽糖基转移酶活性，即，约30,400单位的总酶促活性；以及约1.1单位/ml环四糖形成活性，即，约19,400单位的总酶促活性。实验7从圆孢芽孢杆菌C11制备酶将实验6获得的上清液18L用80％饱和硫酸铵盐析，使其在4℃下静置24小时，对所形成的沉淀在10,000rpm下由离心30分钟收集，溶解在10mM缓冲液(pH7.5)中，对新制备的相同缓冲液透析，以获得约416毫升粗酶溶液，发现该溶液具有8,440单位的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，28,000单位的α-异麦芽糖基转移酶和约17,700单位的环四糖形成酶。当进行实验4-1中公开的采用″SEPABEADS FP-DA13″凝胶的离子交换色谱时，上述三种类型的作为没有吸附在凝胶上的非吸附组份被洗脱。集中具有这些酶的非吸附组份，对具有1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析，离心透析溶液除去杂质，并用500ml″SEPHACRYL HRS-200″对所形成的上清液进行亲和色谱。活性酶吸附在凝胶上，依次用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度，麦芽四糖从0mM增加至100mM的线性梯度洗脱，接着分别洗脱α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶以及α-异麦芽糖基转移酶，前者由在约0.3M浓度的硫酸铵线性梯度洗脱，后者由在约30mM浓度的麦芽四糖线性梯度洗脱。因此，分别收集具有根据本发明的α-异麦芽糖基-转移活性的组份和α-异麦芽糖基葡糖基糖-形成活性的那些。类似于实验4中圆孢芽孢杆菌C9的情况，发现在这一柱色谱的任何组份中没有发现任何环四糖形成活性，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两种组份的酶混合物溶液显示出环四糖形成活性，说明由淀粉部分水解物形成环四糖的活性由这些酶的酶活性协同发挥。
用于分别纯化本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的方法此后公开实验7-2α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化将本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶组份对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将透析溶液离心，以除去不溶性杂质，将所产生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本东京Tosoh公司出售的凝胶)进行疏水色谱。酶吸附在凝胶上，但用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱时，在约0.3M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份。将组份集中，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去杂质，并用″SEPHACRYL HRS-200″凝胶的亲和色谱纯化酶。在每一种纯化步骤中的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表5中显示。
表5酶*活性酶*的比活性 产率纯化步骤(单位)(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液 9,180 0.14100用硫酸铵盐析后的透析溶液8,440 0.6091.9从离子交换柱色谱的洗脱物6,620 1.0872.1亲和柱色谱的洗脱物 4,130 8.8345.0疏水柱色谱的洗脱物 3,310 11.036.1亲和柱色谱的洗脱物 2,000 13.421.8注符号″*″意指本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。
最后纯化的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶样品在用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上进行纯度测定，在凝胶上检测到为单一蛋白质的带，即，一个高纯度的酶样品。实验7-3α-异麦芽糖基转移酶的纯化将已经在实验7-1中被亲和色谱与具有α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的组份分离的α-异麦芽糖基转移酶组份对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去不溶性杂质，将所产生的上清液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本东京Tosoh公司出售的凝胶)进行疏水色谱。酶吸附在凝胶上，当用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱时，在约0.3M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份。将组份集中，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)透析。将所形成的透析溶液离心，以除去杂质，并用″SEPHACRYL HRS-200″凝胶进行亲和色谱以纯化酶。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表6中显示。
表6酶*活性 酶*的比活性 产率纯化步骤(单位)(单位/mg蛋白质)(％)培养上清液 30,4000.45 100用硫酸铵盐析后的透析溶液 28,0001.98 92.1从离子交换柱色谱的洗脱物 2l,8003.56 71.7亲和柱色谱的洗脱物 13,70021.9 45.1疏水柱色谱的洗脱物 10,30023.4 33.9亲和柱色谱的洗脱物 5,510 29.6 18.1注符号″*″意指本发明的α-异麦芽糖基转移酶。实验8α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的性质实验8-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质对在实验7-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约137,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有5.2±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响依据酶活性测定方法测定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下测定温度的影响。这些结果显示在图13(温度影响)和图14(pH影响)中。当在pH6.0下温育60分钟时，酶的最适温度是约45℃(在缺乏1mM Ca2+下)和约50℃(在存在1mM Ca2+下)。当在35℃下温育60分钟时，酶的最适pH是约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在存在或缺乏1mM Ca2+时在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图15(热稳定性)和图16(pH稳定性)中显示。结果，在缺乏1mM Ca2+时酶具有不超过约40℃，在存在1mM Ca2+时酶具有不超过约45℃的热稳定性。酶的pH稳定性是约5.0到约10.0。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响。结果在表7中显示。
表7金属离子 相对活性(％)金属离子相对活性(％)无100 Hg2+4Zn2+91Ba2+65Mg2+98Sr2+83Ca2+109 Pb2+101Co2+96Fe2+100Cu2+23Fe3+102Ni2+93Mn2+142Al3+100 EDTA 24如表7的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制，也被Ba2+和Sr2+抑制。也发现酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO1的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的酪氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-异亮氨酸。
N-末端区部分氨基酸序列与来源于实验5-1中圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的序列比较揭示，它们是相同的，在α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶中共同的N-末端氨基酸序列是N-末端区的SEQ ID NO1氨基酸序列酪氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-异亮氨酸。实验8-2α-异麦芽糖基转移酶的性质对在实验7-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约102,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有5.6+0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响依据酶活性测定方法测定。这些结果显示在图17(温度影响)和图18(pH影响)中。当在pH6.0下温育30分钟时，酶的最适温度是约50℃。当在35℃下温育30分钟时，酶的最适pH是约5.5到约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图19(热稳定性)和图20(pH稳定性)中显示。结果，酶具有不超过约40℃的热稳定性，约4.5到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响。结果在表8中显示。
表8金属离子 相对活性(％)金属离子 相对活性(％)无 100 Hg2+2Zn2+83Ba2+90Mg2+91Sr2+93Ca2+91Pb2+74Co2+89Fe2+104Cu2+56Fe3+88Ni2+89Mn2+93Al3+89EDTA 98如表8的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也发现酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO2的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的异亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸-组氨酸-丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸。
N-末端区部分氨基酸序列与来源于实验5-2中圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的序列比较揭示它们在N-末端区域具有如SEQ IDNO4所示的相同氨基酸序列异亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸-组氨酸-丙氨酸-脯氨酸。实验9α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的氨基酸序列实验9-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的内部氨基酸序列将以实验7-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化的样品对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析，用新制备的相同缓冲液稀释透析溶液，以给出每毫升约一毫克的浓度。将作为待试样品的一毫升稀释物与日本东京Wako纯化化学工业公司出售的胰蛋白酶10μg混合，在30℃温育22小时，以水解成肽。为了分离水解的肽，对所产生的水解物进行反相HPLC，其中使用直径2.1mm长度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美国的产品)，在室温下，以0.9毫升/分钟的流速，并且采用0.1％(v/v)三氟乙酸中的乙腈在120分钟内从8％(v/v)增加至40％(v/v)的线性梯度。从柱上洗脱的肽经监测在210nm波长的吸光度来检测。将已经与其它肽充分分离的命名为P64(约64分钟的保留时间)，P88(约88分钟的保留时间)以及P99(约99分钟的保留时间)三个肽样品分别收集并在真空中干燥，然后溶解在200μl0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。对每一个肽样品进行蛋白质测序，以分析多达八个氨基酸的氨基酸序列，获得SEQ ID NO5到7的氨基酸残基。所分析的内部部分氨基酸序列在表中9显示。
表9肽名称 内部部分氨基酸序列P64天冬氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丙氨酸-天冬酰胺-缬氨酸-苏氨酸-苏氨酸P88色氨酸-丝氨酸-亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸P99天冬酰胺-酪氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-苯丙氨酸实验9-2α-异麦芽糖基转移酶的内部氨基酸序列将以实验7-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶的纯化的样品对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析，用新制备的相同缓冲液稀释透析溶液，以给出每毫升约一毫克的浓度。将作为待试样品的一毫升稀释物与日本东京Wako纯化化学工业公司出售的″赖氨酰内肽酶″10μg混合，使其在30℃反应22小时以形成肽。对所产生的混合物进行反相HPLC以分离肽，其中使用直径2.1mm长度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美国的产品)，在室温下，以0.9毫升/分钟的流速，并且采用0.1％(v/v)三氟乙酸中的乙腈在120分钟内从8％(v/v)增加至40％(v/v)的的线性梯度。从柱上洗脱的肽经监测在210nm波长的吸光度检测。将已经与其它肽充分分离的命名为P22(约22分钟的保留时间)，P63(约63分钟的保留时间)以及P71(约71分钟的保留时间)三个肽样品分别收集并在真空中干燥，然后溶解在200μl 0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。对每一个肽样品进行蛋白质测序，以分析多达八个氨基酸的氨基酸序列，获得SEQ ID NO8到10的氨基酸残基。所分析的内部部分氨基酸序列在表10中显示。
表10肽名称内部部分氨基酸序列P22 甘氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-酪氨酸P63 异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-色氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-丝氨酸P71 色氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-亮氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸实验10从圆孢芽孢杆菌N75(菌株N75)产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶将由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，淀粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一种酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体培养基以分别100ml的量置于500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种圆孢芽孢杆菌N75菌株贮藏培养物，FERM BP-7591的贮存培养物，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时进行培养以用作种子培养物。
将约20L用于上述种子培养的新制备的相同液体培养基置于30L发酵罐，加热灭菌，然后冷却到27℃，用1％(v/v)种子培养物接种，接着在通气搅拌条件下于27℃和pH 6.0-8.0培养48小时。将具有约0.34单位/mlα-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，约1.1单位/mlα-异麦芽糖基转移酶活性以及约0.69单位/ml环四糖形成酶活性的所形成的培养物在10,000rpm下离心30分钟，以获得18L上清液。上清液测定表明，其具有约0.33单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，约5,940单位的总酶促活性；约1.1单位/mlα-异麦芽糖基转移酶活性，即，约19,800单位的总酶促活性；以及约0.67单位/ml环四糖形成酶活性，即，约12,100单位的总酶促活性。实验11从圆孢芽孢杆菌N75制备酶将实验10获得的上清液18 L用60％饱和硫酸铵盐析，使其在4℃下静置24小时，对所形成的沉淀在10,000rpm下由离心30分钟收集，溶解在10mM Tris-HCl(pH8.3)中，对新制备的相同缓冲液透析，以获得约450毫升粗酶溶液，发现该溶液具有4,710单位的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，15,700单位的α-异麦芽糖基转移酶和约9,590单位的环四糖形成酶。接着对其进行实验4-1中公开的采用″SEPABEADS FP-DA13″凝胶的离子交换色谱。所述酶吸附在凝胶上，而α-异麦芽糖基转移酶作为没有吸附在凝胶上的非吸附组份被洗脱。当用氯化钠从0M增加至1M的线性梯度洗脱时，本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶在约0.25M氯化钠浓度时洗脱。在这些条件下，将具有本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的组份和具有α-异麦芽糖基转移酶活性的那些分别分级分离和收集。类似于实验4中圆孢芽孢杆菌C9和实验7中圆孢芽孢杆菌C11的情况，其揭示在这一柱色谱的任何组份中没有发现任何环四糖形成活性，并且通过混合α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两种组份获得的酶溶液显示出环四糖形成活性，这些事实表明由淀粉部分水解物形成环四糖的活性由本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶协同发挥。
下列实验描述用于分别纯化本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的方法实验11-2α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化收集具有本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的以上组份，然后对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将透析溶液离心除去杂质，并进行采用″SEPHACRYL HR S-200″凝胶的亲和色谱。酶吸附在凝胶上，然后由硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度和麦芽四糖从0mM增加到100mM的线性梯度从中依次洗脱。结果，吸附在凝胶上的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶在约30mM麦芽四糖浓度时从中洗脱，接着收集具有所述酶活性的组份。集中这些组份，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。透析溶液经离心除去杂质，将所产生的透析溶液用350ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″(日本东京Tosoh公司出售的凝胶)进行疏水色谱。酶吸附在凝胶上，当用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱时，在约0.3M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份。将组份集中，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将所形成的透析溶液离心，以除去杂质，并用300ml″SEPHACRYL HRS-200″凝胶进行亲和色谱以纯化酶。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表11中显示。
表11纯化步骤 酶*活性 酶*的比活性 产率(单位) (单位/mg蛋白质) (％)培养上清液 5,940 0.10 100硫酸铵盐析后的透析溶液 4,710 0.19 79.3离子交换柱色谱洗脱物3,200 2.12 53.9亲和柱色谱的洗脱物 2,210 7.55 37.2疏水柱色谱的洗脱物 1,720 10.1 29.0亲和柱色谱的洗脱物 1,320 12.5 22.2注符号″*″意指α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶.
最后纯化的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶样品在用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上进行纯度测定，在凝胶上检测到为单一蛋白质的带，即，一个高纯度的酶样品。实验11-3α-异麦芽糖基转移酶的纯化收集已经在实验11-1中被离子交换色谱与具有α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的组份分离的α-异麦芽糖基转移酶组份，对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去杂质，将所产生的上清液用500ml ″SEPHACRYL HR S-200″(一种由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝胶)进行亲和色谱。所述的酶吸附在凝胶上，然后用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱，导致所说的酶在约0.3M硫酸铵浓度时洗脱。收集具有酶活性的组份。将组份集中，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将所形成的透析溶液离心，以除去杂质，并用380ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 M″凝胶进行疏水色谱纯化。酶吸附在凝胶上，然后用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱，导致在约0.3M硫酸铵浓度时洗脱。收集有酶活性的组份，对10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析，离心透析溶液除去杂质，将所产生的上清液用380ml″SUPER Q-TOYOPEARL 650C″凝胶(日本东京Tosoh公司出售)进行离子交换色谱。酶不吸附在凝胶上，作为非吸附组份被洗脱，然后收集并集中，获得最终纯化的酶制剂。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表12中显示。
表12纯化步骤 酶*活性(单位) 酶*的比活性产率(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液 19,000 0.33 100硫酸铵盐析后的透析溶液 15,700 0.64 82.6离子交换柱色谱洗脱物 12,400 3.56 65.3亲和柱色谱的洗脱物 8,320 11.7 43.8疏水柱色谱的洗脱物 4,830 15.2 25.4离子交换柱色谱洗脱物 3,850 22.6 20.3注符号″*″意指α-异麦芽糖基转移酶.
最后纯化的α-异麦芽糖基转移酶样品在用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上进行纯度测定，在凝胶上检测到为单一蛋白质的带，即，一个高纯度的酶样品。实验12α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的性质实验12-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质对在实验11-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约136,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司,Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有7.3±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响依据酶活性测定方法测定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下测定温度的影响。这些结果显示在图21(温度影响)和图22(pH影响)中。当分别在缺乏和在存在1mMCa2+下，在pH6.0下温育60分钟时，酶的最适温度是约50℃和约55℃。当在35℃下温育60分钟时，酶的最适pH是约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在存在或缺乏1mM Ca2+时在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图23(热稳定性)和图24(pH稳定性)中显示。结果，在缺乏和存在1mMCa2+时，酶分别具有不超过约45℃和约50℃的热稳定性，约5.0到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响。结果在表13中显示。
表 13金属离子 相对活性(％) 金属离子 相对活性(％)无 100 Hg2+1Zn2+82 Ba2+84Mg2+96 Sr2+85Ca2+108 Pb2+86Co2+93 Fe2+82Cu2+7 Fe3+93Ni2+93 Mn2+120Al3+98 EDTA 35如表13的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制。也发现酶被Ca2+和Mn2+活化。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO11的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的组氨酸-缬氨酸-丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-亮氨酸。
N-末端区上述部分氨基酸序列与来源于实验8-1中圆孢芽孢杆菌C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的序列比较揭示它们具有相对高的同源性，但在氨基酸残基1，4和9上不同。实验12-2α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的性质对在实验11-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约112,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有7.8±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响依据酶活性测定方法测定。这些结果显示在图25(温度影响)和图26(pH影响)中。酶的最适温度是约50℃。当在35℃下温育30分钟时，酶的最适pH是约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图27(热稳定性)和图28(pH稳定性)中显示。结果，酶具有不超过约45℃的热稳定性，约4.5到约10.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响。结果在表14中显示。
表14金属离子 相对活性(％) 金属离子 相对活性(％)无 100 Hg2+0.5Zn2+75 Ba2+102Mg2+95 Sr2+91Ca2+100 Pb2+69Co2+92 Fe2+97Cu2+15 Fe3+90Ni2+91 Mn2+101A13+94 EDTA92如表14的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。也发现酶不被Ca2+活化和不被EDTA抑制。
由″蛋白质测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO3的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的异亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸-组氨酸-丙氨酸-脯氨酸-酪氨酸-甘氨酸。
N-末端区部分氨基酸序列与来源于实验8-2中圆孢芽孢杆菌C9的α-异麦芽糖基转移酶的序列比较揭示它们在其N-末端区具有SEQ ID NO4所示的相同氨基酸序列异亮氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-酪氨酸-组氨酸-丙氨酸-脯氨酸。实验13α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的内部氨基酸序列实验13-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的内部氨基酸序列将以实验11-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化的样品对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析，用新制备的相同缓冲液稀释透析溶液，以给出每毫升约一毫克的浓度。将作为待试样品的一毫升稀释物与日本东京Wako纯化化学工业公司出售的″赖氨酰内肽酶″20μg混合，使其在30℃反应24小时以形成肽。对所产生的混合物进行反相HPLC以分离肽，其中使用直径3.9mm、长度150mm的″μ-Bondapak C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美国的产品)，在室温下，以0.9毫升/分钟的流速，并且采用0.1％(v/v)三氟乙酸中乙腈在120分钟内从8％(v/v)增加至36％(v/v)的线性梯度。从柱上洗脱的肽经监测在210nm波长的吸光度检测。将已经与其它肽充分分离的命名为PN59(约59分钟的保留时间)，PN67(约67分钟的保留时间)以及PN87(约87分钟的保留时间)三个肽样品分别收集并在真空中干燥，然后溶解在200μl 0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。对每一个肽样品进行蛋白质测序，以分析多达八个氨基酸的氨基酸序列，获得SEQ ID NO12到14的氨基酸残基。所分析的内部部分氨基酸序列在表15中显示。
表15肽名称 内部部分氨基酸序列PN59天冬氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-脯氨酸-苏氨酸-缬氨酸PN67酪氨酸-苏氨酸-缬氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸PN87酪氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丙氨酸-谷氨酸-亮氨酸实验13-2α-异麦芽糖基转移酶的内部氨基酸序列将以实验11-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶的纯化的样品对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析，用新制备的相同缓冲液稀释透析溶液，以给出每毫升约一毫克的浓度。将作为待试样品的一毫升稀释物与日本东京Wako纯化化学工业公司出售的″赖氨酰内肽酶″20μg混合，使其在30℃反应24小时以形成肽。对所产生的混合物进行反相HPLC以分离肽，其中使用直径3.9mm、长度150mm的″μ-Bondasphere C18柱″(Div.，MILLIPORE Corp.，Milford，美国的产品)，在室温下，以0.9毫升/分钟的流速，并且采用0.1％(v/v)三氟乙酸中乙腈在90分钟内从4％(v/v)增加至42.4％(v/v)的的线性梯度。从柱上洗脱的肽经监测在210nm波长的吸光度检测。将已经与其它肽充分分离的命名为PN21(约21分钟的保留时间)，PN38(约38分钟的保留时间)以及PN69(约69分钟的保留时间)三个肽样品分别收集并在真空中干燥，然后溶解在200μl0.1％(v/v)三氟乙酸和50％(v/v)乙腈溶液中。对每一个肽样品进行蛋白质测序，以分析多达八个氨基酸残基的氨基酸序列，但对PN21分析多达六个氨基酸残基，获得SEQ ID NO15到17的氨基酸残基。所分析的内部部分氨基酸序列在表16中显示。
表16肽名称 内部部分氨基酸序列PN21 天冬酰胺-色氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-赖氨酸PN38 苏氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-缬氨酸-色氨酸PN69 天冬酰胺-异亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-天冬氨酸实验14从球形节杆菌A19(菌株A19)产生α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶将由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，淀粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一种酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体培养基以分别100ml的量置于500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种球形节杆菌A19菌株，FERM BP-7590的贮存培养物，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时进行培养以用作种子培养物。
将约20L用于上述种子培养的新制备的相同液体培养基置于30L发酵罐，加热灭菌，然后冷却到27℃，用1％(v/v)种子培养物接种，接着在通气搅拌条件下于27℃和pH 6.0-9.0培养48小时。将具有约1.1单位/ml α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，约1.7单位/ml α-异麦芽糖基转移酶活性以及约0.35单位/ml环四糖形成酶活性的所形成的培养物在10,000rpm下离心30分钟，以获得18L上清液。上清液测定表明，其具有约1.06单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性，即，约19,100单位的总酶促活性；约1.6单位/mlα-异麦芽糖基转移酶活性，即，约28,000单位的总酶促活性；以及约0.27单位/ml环四糖形成酶活性，即，约4,860单位的总酶促活性。
来源于球形节杆菌A19的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的活性按照实验3的方法进行类似的测定，除了采用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.4)用作底物缓冲液外。实验15从球形节杆菌A19制备酶将实验14获得的上清液18L用60％饱和硫酸铵盐析，使其在4℃下静置24小时，对所形成的沉淀在10,000rpm下由离心30分钟收集，溶解在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，对新制备的相同缓冲液透析，以获得约850毫升粗酶溶液，发现该溶液具有8,210单位的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，15,700单位的α-异麦芽糖基转移酶和约20,090单位的环四糖形成酶。接着对其进行采用380毫升″DEAE-TOYOPEARL 650S″凝胶的离子交换色谱。当用氯化钠从0M增加至0.5M的线性梯度洗脱时，上述酶和α-异麦芽糖基转移酶分别从凝胶洗脱，前者在约0.2M氯化钠浓度时洗脱，而后者在约0.3M氯化钠浓度时洗脱。在这些条件下，将具有本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的组份和具有α-异麦芽糖基转移酶活性的那些分别分级分离和收集。由于这一柱色谱的任何组份中没有发现任何环四糖形成活性的事实，并且通过混合α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两种组份获得的酶溶液显示出环四糖形成活性，这表明由淀粉部分水解物形成环四糖的活性由本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶协同发挥。
下列实验描述用于分别纯化本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的方法实验15-2α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化收集具有本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的以上组份，然后对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将透析溶液离心除去杂质，并进行采用″SEPHACRYL HR S-200″凝胶的亲和色谱。酶吸附在凝胶上，然后由硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱。结果，吸附在凝胶上的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶在约0.2M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份。将组份集中，用作最终的纯化样品。在每一纯化步骤中的α-α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶酶活性，比活性以及产率的数量在表17中显示。
表17酶*活性(单位) 酶*的比活性 产率纯化步骤(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液 19,100 0.11100硫酸铵盐析后的透析溶液 8,2100.4843.0离子交换柱色谱洗脱物 6,8904.1836.1亲和柱色谱的洗脱物 5,22035.127.3注符号″*″意指α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶.
最后纯化的α-异麦芽糖基转移酶样品在用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶凝胶电泳上进行纯度测定，在凝胶上检测到为单一蛋白质的带，即，高纯度的酶样品。实验15-3α-异麦芽糖基转移酶的纯化收集已经在实验15-1中被离子交换色谱与具有α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的组份分离的α-异麦芽糖基转移酶组份对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去不溶性杂质，将所产生的上清液用500ml″SEPHACRYL HR S-200″(一种由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售的凝胶)进行亲和色谱。酶吸附在凝胶上，然后由硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱，导致酶在0M硫酸铵时洗脱，其后收集有酶活性的组份用作部分纯化样品。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基转移酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表18中显示。
表18纯化步骤酶*活性(单位)酶*的比活性产率(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液28,800 0.18 100硫酸铵盐析后的透析溶液 15,700 0.97 54.5离子交换柱色谱洗脱物 7,130 4.01 24.8亲和柱色谱的洗脱物 1,800 11.9 6.3注符号″*″意指α-异麦芽糖基转移酶.
用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶在凝胶电泳上对部分纯化的α-异麦芽糖基转移酶样品进行纯度测定，作为主要蛋白质带与三个次要蛋白质带一同在凝胶上检测到。实验16α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的性质实验16-1α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质对在实验15-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约94,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有4.3±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶活性的影响依据酶活性测定方法测定，其中在存在或缺乏1mM Ca2+下测定温度的影响。这些结果显示在图29(温度影响)和图30(pH影响)中。分别在缺乏和在存在1mM Ca2+下，酶的最适温度是约60℃和约65℃。当在35℃下温育60分钟时，酶的最适pH是约8.4。酶的热稳定性通过以下方法测定在存在或缺乏1mMCa2+时在所设定的温度下温育在20mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH8.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到8.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图31(热稳定性)和图32(pH稳定性)中显示。结果，分别在缺乏和存在1mM Ca2+时，酶具有不超过约55℃和约60℃的热稳定性，约5.0到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响。结果在表19中显示。
表13金属离子 相对活性(％) 金属离子 相对活性(％)无 100 Hg2+0Zn2+56 Ba2+99Mg2+97 Sr2+102Ca2+106 Pb2+43Co2+93 Fe2+36Cu2+0Fe3+35Ni2+46 Mn2+98Al3+37 EDTA2如表19的结果所显示的，酶活性大大地被Hg2+，Cu2+和EDTA抑制。
由″PROTEIN测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO18的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-苯丙氨酸-谷氨酰胺-丝氨酸-甘氨酸。实验16-2α-异麦芽糖基转移酶的性质使用在实验15-3的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶的部分纯化样品，温度和pH对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响依据酶活性测定方法测定。这些结果显示在图33(温度影响)和图34(pH影响)中。当在pH6.0下温育30分钟时，酶的最适温度是约50℃。当在35℃下温育30分钟时，酶的最适pH是约6.5。酶的热稳定性通过以下方法测定在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图35(热稳定性)和图36(pH稳定性)中显示。结果，酶具有不超过约45℃的热稳定性，约4.5到约9.0的pH稳定性。实验17从分枝节杆菌S1(菌株S1)产生α-异麦芽糖基转移酶将由4.0％(w/v)″PINE-DEX#4″，淀粉部分水解物，1.8％(w/v)″ASAHIMEAST″(一种酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体培养基以分别100ml的量置于500-ml锥形瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却，然后接种分枝节杆菌S1菌株，FERM BP-7592的贮存培养物，接着在旋转振荡条件下于27℃和230rpm培养48小时进行培养以用作种子培养物。
将约20L用于上述种子培养的新制备的相同液体培养基置于30L发酵罐，加热灭菌，然后冷却到27℃，用1％(v/v)种子培养物接种，接着在通气搅拌条件下于27℃和pH 6.0-8.0培养48小时。将具有约0.45单位/ml α-异麦芽糖基转移酶活性的所形成的培养物在10,000rpm下离心30分钟，以获得具有约0.44单位/mlα-异麦芽糖基转移酶活性和约7,920单位总酶促活性的18L上清液。实验18来源于分枝节杆菌S1的α-异麦芽糖基转移酶的纯化将实验17获得的上清液18L在4℃下用80％饱和硫酸铵盐析24小时，对所形成的沉淀在10,000rpm下由离心30分钟收集，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析，以获得380毫升具有6,000单位α-异麦芽糖基转移酶的粗酶溶液。将粗酶溶液对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。所产生的透析溶液经离心除去杂质，将所产生的上清液用500ml″SEPHACRYL HR S-200″进行亲和色谱。所述的酶吸附在凝胶上，然后用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度和麦芽四糖从0％(w/v)增加到5％(w/v)的线性梯度依次洗脱。导致所说的酶在约2％(w/v)麦芽四糖浓度时从凝胶洗脱，收集具有酶活性的组份。将组份集中，并对包含1M硫酸铵的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)透析。将所形成的透析溶液离心以除去杂质，并用380ml″BUTYL-TOYOPEARL 650M″凝胶进行疏水色谱纯化。当用硫酸铵从1M减少至0M的线性梯度洗脱时，α-异麦芽糖基转移酶吸附在凝胶上，在约0.3M硫酸铵时被洗脱，其后收集有酶活性的组份用作纯化酶样品。在每一纯化步骤中的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的酶活性，比活性以及产率的数量在表20中显示。
表20酶*活性(单位) 酶*的比活性 产率纯化步骤(单位/mg蛋白质) (％)培养上清液 7,920 0.47 100硫酸铵盐析后的透析溶液 6,000 3.36 75.8亲和柱色谱的洗脱物 5,270 29.9 66.5疏水柱色谱的洗脱物 4,430 31.1 55.9注符号″*″意指α-异麦芽糖基转移酶.
用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶在凝胶电泳上对本实验中纯化的α-异麦芽糖基转移酶样品进行纯度测定，并且作为单一蛋白质带，即高纯度的酶样品被检测。实验19α-异麦芽糖基转移酶的性质对在实验18的方法获得的α-异麦芽糖基转移酶纯化样品用7.5％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，通过与平行电泳标准分子标记(由比利时布鲁塞尔的Bio-Rad实验室公司出售)的动力学比较确定分子量，说明酶具有约116,000±20,000道尔顿的分子量。
新制备的上述纯化的样品的用包含2％(w/v)两性电解质的凝胶(由Amersham公司，Div.Amersham International，Arlington Heights，IL，USA出售)进行等电聚焦电泳，然后测定蛋白质带与凝胶的pH以测定酶的等电点，揭示酶具有4.2±0.5的等电点。
温度和pH对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响依据酶活性测定方法测定。这些结果显示在图37(温度影响)和图38(pH影响)中。当在pH6.0下温育30分钟时，酶的最适温度是约50℃。当在35℃下温育30分钟时，酶的最适pH是约约6.0。酶的热稳定性通过以下方法测定在所设定的温度下温育在20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的待试酶溶液60分钟，以水冷却所产生的酶溶液，测定每一溶液的剩余酶活性。酶的pH稳定性通过以下方法测定在4℃在具有所设定的pH的50mM缓冲液中保持待试酶溶液24小时，调节每一种溶液的pH到6.0，测定每一种溶液的剩余酶活性。这些结果分别在图39(热稳定性)和图40(pH稳定性)中显示。结果，酶具有不超过约45℃的热稳定性，约3.6到约9.0的pH稳定性。
根据酶活性测定法，在存在1mM各种金属离子的情况下测定金属离子对α-异麦芽糖基转移酶活性的影响。结果在表21中显示。
表21金属离子相对活性(％) 金属离子相对活性(％)无 100 Hg2+0.1zn2+78 Ba2+97Mg2+99 Sr2+101Ca2+103 Pb2+85Co2+91 Fe2+105Cu2+2 Fe3+75Ni2+87 Mn2+98Al3+93 EDTA 91如表21的结果所显示的，其揭示酶活性大大地被Hg2+抑制，也被Cu2+抑制。
由″PROTEIN测序仪473A型″(一种美国Foster市应用生物系统公司的仪器)进行的酶的N-末端氨基酸序列的序列分析揭示酶具有SEQ ID NO19的一部分氨基酸序列，即，在N-末端区中的天冬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-脯氨酸。实验20对糖的作用试验了糖是否可以用作α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的底物。为此目的，制备了麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽六糖，麦芽七糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，潘糖，异潘糖，海藻糖，曲二糖，黑曲糖，新海藻糖(neotrehalose)，纤维二糖，龙胆二糖，麦芽糖醇，maltotriitol，乳糖，蔗糖，erlose，selaginose，麦芽糖基葡糖苷，或异麦芽糖基葡糖苷的溶液。
向每种上述溶液中添加每克底物2单位的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品，所说的酶是实验4-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌C9的，实验7-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌C11的，实验11-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌N75的，或实验15-2的方法获得的来源于球形节杆菌A19的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。将所形成的各溶液调节到给定的2％(w/v)的底物浓度，并且在30℃和pH6.0下温育24小时(除了采用pH8，4，用于球形节杆菌A19外)。在酶促反应之前和之后分别在实验1中公开的TLC上分析酶溶液，以证实所说的酶是否作用在这些底物上。结果示于表22中。
表22酶促活性底物菌株C9的酶 菌株C11的酶 菌株N75的酶 菌株A19的酶麦芽糖 + + + +麦芽三糖 ++ ++++ ++麦芽四糖 ++++++ +++ +++麦芽五糖 ++++++ +++ +++麦芽六糖 ++++++ +++ +++麦芽七糖 ++++++ +++ +++异麦芽糖 - - - -异麦芽三糖 - - - -潘糖 - - - -异潘糖 ++ ++++ ++海藻糖 - - - -曲二糖 + + + +黑曲糖 + + + +新海藻糖 + + + +纤维二糖 - - - -(续表22)酶促活性底物菌株C9的酶菌株C11的酶 菌株N75的酶 菌株A19的酶龙胆二糖-- - -麦芽糖醇-- - -Maltotriitol++ + +乳糖-- - -蔗糖-- - -Erlose ++ + +Selaginose -- - -麦芽糖基葡糖苷 ++ ++++ ++异麦芽糖基葡糖苷 -- - -注酶促反应之前和之后，符号“-”， “+”，“++”和“+++”分别指其没有显示出变化，其显示了底物颜色点稍微减少和形成其它反应产物，其显示了底物颜色点高度减少和形成其它反应产物，其显示了底物点实质上消失和形成其它反应产物。
如表22显示的，它说明本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶很好地作用于被试糖中具有至少为3的葡糖聚合度和在它们的非还原端具有麦芽糖结构的糖。也发现所说的酶轻微作用于具有二个葡糖聚合度的糖，如麦芽糖，曲二糖，黑曲糖，新海藻糖，maltotriito1以及erlose。实验21麦芽寡糖反应产物实验21-1反应产物的制备向含有百分之一(w/v)作为底物的麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，或麦芽五糖的水溶液中添加实验7-2的方法获得的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品，添加的量是，对麦芽糖和麦芽三糖水溶液是2单位/g固体，对麦芽四糖是0.2单位/g固体，对麦芽五糖是0.1种单位/g固体，接着在35℃和pH6.0下温育八小时。在100℃下温育10分钟之后，暂停酶促反应物。用HPLC分别测定所产生的反应溶液的糖组成，所说的HPLC采用″YMC PACK ODS-AQ303″(一种由日本东京YMC公司出售的柱)，40℃柱温，0.5毫升/分钟水流速，″RI-8012″检测器(一种日本东京Tosoh公司出售的示差折射计)。结果在表23中。
表23底 物作为反应产物的糖麦芽糖 麦芽三糖 麦芽四糖 麦芽五糖葡萄糖8.5 0.1 0.00.0麦芽糖78.0 17.9 0.30.0麦芽三糖 0.8 45.3 22.7 1.9麦芽四糖 0.0 1.8 35.1 19.2麦芽五糖 0.0 0.0 3.534.4麦芽六糖 0.0 0.0 0.04.6异麦芽糖 0.5 0.0 0.00.0葡糖基麦芽糖 8.2 1.2 0.00.0葡糖基麦芽三糖2.4 31.5 6.80.0X0.0 2.1 30.0 11.4Y0.0 0.0 1.426.8Z0.0 0.0 0.01.7其它 0.6 0.1 0.20.0注表中，葡糖基麦芽糖意指α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名62-O-α-葡糖基麦芽糖或潘糖；葡糖基麦芽三糖意指α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名63-O-α-葡糖基麦芽三糖；X意指实验11-2中的α-异麦芽糖基麦芽三糖，别名64-O-α-葡糖基麦芽四糖；Y意指实验11-2中的α-异麦芽糖基麦芽四糖，别名65-O-α-葡糖基麦芽五糖；Z意指一种未鉴别的糖。
如表23的结果所显示的，其揭示在本发明的酶作用后，从作为底物的麦芽糖主要形成葡萄糖和α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名62-O-α-葡基麦芽糖或潘糖；主要形成麦芽糖和α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名63-O-α-葡糖基麦芽三糖，伴随少量的葡萄糖，麦芽四糖，α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名62-O-α-葡基麦芽糖或潘糖，以及产物X。它也说明从作为底物的麦芽四糖主要形成麦芽三糖和产物X，伴随少量麦芽糖，麦芽五糖，α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名63-O-α-葡基麦芽三糖；和产物Y；以及从作为底物的麦芽五糖主要形成麦芽四糖和产物Y，伴随少量的麦芽三糖，麦芽六糖以及产物X和Z。
按如下方法分离和纯化产物X(作为从底物麦芽四糖一种主要产物)和产物Y(作为从底物麦芽五糖的主要产物)X和Y产品在用″YMC PACKODS-A R355-15S-15 12A″(一种由日本东京YMC有限公司出售的分离型HPLC柱)的HPLC上分别纯化，以从麦芽四糖的反应产物以约8.3％d.s.b的产率分离具有至少99.9％的纯度的产物X的样品，以及从麦芽四糖的反应产物以约11.5％d.s.b的产率分离具有至少99.9％的纯度的产物Y的样品。实验21-2反应产物的结构分析用在实验21-1的方法获得的产物X和Y，以通常的方式对它们进行甲基分析和NMR分析。它们的甲基分析结果显示在表24中。对它们的NMR分析结果而言，图41是产物X的1H-NMR光谱，图42是产物Y的。产物X和Y的13C-NMR光谱分别在图43和44中显示。X和Y产物的测定结果在表25中列出。
表24分析的甲基化合物 比率产物X 产物Y2，3，4-三甲基化合物 1.00 1.002，3，6-三甲基化合物 3.05 3.982，3，4，6-四甲基化合物 0.82 0.85
基于这些结果，从麦芽四糖经由本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的作用形成的产物X被证明为五糖，其中，葡萄糖残基经由α-连接键结合到麦芽四糖非还原端的葡萄糖的OH-6上，即，由式1代表的α-异麦芽糖基麦芽三糖，别名64-O-α-葡糖基麦芽四糖。式1α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp从麦芽五糖形成的产物Y被证明为六糖，其中，葡糖基残基经由α-连接键结合到麦芽五糖的OH-6上，即，由式2代表的α-异麦芽糖基麦芽四糖，别名65-O-α-葡糖基麦芽五糖非还原端的葡萄糖。式2α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
表25

基于这些结果，可以得出结论本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶如以下显示作用于麦芽寡糖上(1)该酶作用于作为底物、具有经由α-1，4连接键连接的至少为2的葡糖聚合度的麦芽寡糖上，以以下方式催化分子间6-葡糖基转移反应将在麦芽寡糖分子非还原端的葡糖基残基转移到其它麦芽寡糖分子的非还原端的C-6上，以形成α-异麦芽糖基葡糖基糖，别名6-O-α-葡糖基麦芽寡糖(其具有6-O-α-葡糖基残基，并且与完整底物比较具有高一级的葡糖聚合度)和麦芽寡糖(与完整底物比较，具有低一级的葡糖聚合度)两者；以及(2)该酶稍微催化4-葡糖基转移反应，形成与完整底物比较具有高一级的葡糖聚合度的麦芽寡糖和与完整底物比较具有低一级的葡糖聚合度的麦芽寡糖两者。实验22还原力形成试验进行下列试验以研究本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶是否具有形成还原力的能力。向作为底物的麦芽四糖的1％(w/v)水溶液中添加以下任一α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品0.25单位/g底物(d.s.b.)在实验4-2的方法所获得的来源于圆孢芽孢杆菌C9的，在实验7-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌C11的，在实验11-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌N75的，在实验15-2的方法所获得的来源于球形节杆菌A19的。在35℃和pH6.0下温育(除pH 8.4用于来源于球形节杆菌A19的酶外)。在酶促反应期间，在所规定的时间间隔对每一反应溶液取一小部分样，在100℃下保持所取样品溶液10分钟暂停酶促反应后，测定还原力。在酶促反应之前或之后，用Somogyi-Nelson’s法和蒽酮-硫酸反应法分别定量测定还原糖含量和总糖含量。形成的还原力的百分比由下列等式计算等式形成还原力的百分比(％)＝(AR/AT-BR/BT)×100AR在酶促反应之后还原糖含量。
AT在酶促反应之后总糖含量。
BR在酶促反应之前还原糖含量。
BT在酶促反应之前总糖含量。结果在表26中显示。
表26反应时间(小时)形成还原力的百分比(％)菌株C9的酶 菌株C11的酶菌株N75的酶菌株A19的酶0 0.0 0.0 0.00.01 0.0 0.1 0.10.02 0.1 0.0 0.00.14 0.1 0.1 0.00.08 0.0 0.0 0.10.1如表26所显示的，它说明本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶当作为底物作用于麦芽四糖时，实质上不增加反应产物的还原力；酶没有水解活性或仅具有不可检测到的水平的该活性。实验23葡聚糖形成试验为了研究本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶是否具有形成葡聚糖的能力，按照Bioscience Biotechnology and Biochemistry，Vol.56，pp.169-173(1992)的方法进行试验。向作为底物的麦芽四糖的1％(w/v)水溶液中添加以下任一α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品0.25单位/g底物(d.s.b.)在实验4-2的方法所获得的来源于圆孢芽孢杆菌C9的，在实验7-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌C11的，在实验11-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌N75的，在实验15-2的方法所获得的来源于球形节杆菌A19的。在35℃和pH6.0下温育(除pH 8.4用于来源于球形节杆菌A19的酶外)4或8小时。在酶促反应完成之后，通过在100℃加热15分钟暂停反应。各取五十微升反应混合物置于离心管中，然后与3倍体积乙醇一起充分搅拌，接着在4℃下静置30分钟。然后将各反应混合物溶液在15,000rpm下离心五分钟，在除去上清液后，将所产生的沉淀与75％(w/w)乙醇溶液一毫升混合之后，搅拌洗涤。将所形成的各溶液离心，除去上清液，在真空中干燥，然后与去离子水一毫升混合和充分搅拌。用苯酚-硫酸法定量测定每一种所产生的溶液以葡萄糖表示的总糖含量。作为对照，除了采用在100℃下灭活10分钟的来源于圆孢芽孢杆菌C9，圆孢芽孢杆菌C11，圆孢芽孢杆菌N75以及球形节杆菌A19的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶纯化样品外，用类似以上的方法测定总糖含量。由下列等式计算所形成的葡聚糖含量等式所形成的葡聚糖含量(mg/ml)＝[(待试样品的总糖含量)]-[(对照样品的总糖含量)]×20结果在表27中显示。
表27反应时间所形成的葡聚糖含量(mg/ml)(小时) 菌株C9的酶菌株C11的酶菌株N75的酶菌株A19的酶4 0.00.0 0.0 0.08 0.00.0 0.0 0.0如表27所显示的，它说明本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶实质上没有形成葡聚糖的作用或仅具有不可检测水平的这样的活性，因为当作用在麦芽四糖上时，它没有形成葡聚糖。实验24转移受体特异性用不同的糖，试验被检验糖是否用作本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的转移受体。制备D-葡萄糖，D-木糖，L-木糖，D-半乳糖，D-果糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-岩藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，L-鼠李糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，N-乙酰基-葡糖胺，山梨糖醇，海藻糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，纤维二糖，龙胆二糖，甘油，麦芽糖醇，乳糖，蔗糖，α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，或L-抗坏血酸的溶液。
向每一种1.6％糖浓度的溶液中添加″PINE-DEX#100″，一种淀粉部分水解物，作为糖供体，给出4％的浓度，与以下任一α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品以一单位/g糖供体d.s.b.混合在实验4-2的方法所获得的来源于圆孢芽孢杆菌C9的，在实验7-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌C11的，在实验11-2的方法获得的来源于圆孢芽孢杆菌N75的，在实验15-2的方法所获得的来源于球形节杆菌A19的。在30℃和pH 6.0下温育(除pH 8.4用于来源于球形节杆菌A19的酶外)24小时。对酶促反应后的反应混合物在气相色谱(下文简化为″GLC″)上分析作为受体的单糖和二糖，用HPLC分析作为受体的三糖，以确认这些糖是否可以用作它们的转移受体。在进行GLC时，使用下列仪器和条件GLC仪，日本东京Shimadzu公司出售的″GC-16A″；柱，日本东京GL科学公司出售的不锈钢柱，直径3mm长2m，填装2％″硅氧烷OV17/CHROMOSOLV W″；载气，在从160℃增加到320℃，增温速率7.5℃/分钟的温度条件下，流速40毫升/分钟的氮气；检测，氢火焰电离检测器。在HPLC分析的情况下，使用的仪器和条件是HPLC仪，日本东京Tosoh公司出售的″CCPD″；柱，日本东京YMC有限公司出售的″ODS-AQ-303″；洗脱液，流速0.5毫升/分钟的水；检测，示差折射计。结果在表28中显示。
表28转移反应产物糖菌株C9的酶 菌株C11的酶 菌株N75的酶菌株A19的酶D-葡萄糖 + + + +D-木糖 ++ ++ ++ +L-木糖 ++ ++ ++ +D-半乳糖 + + + ±D-果糖 + + + +D-甘露糖 - - - ±D-阿拉伯糖 ± ± ± ±D-岩藻糖 + + + ±D-阿洛酮糖 + + + +L-山梨糖 + + + +L-鼠李糖 - - - -甲基-α-吡喃葡萄糖苷++ ++ ++ ++甲基-β-吡喃葡萄糖苷++ ++ ++ ++N-乙酰基葡糖胺 + + + -(续)山梨糖醇 - - - -海藻糖 ++ ++ ++++异麦芽糖 ++ ++ +++异麦芽三糖 ++ ++ ++±纤维二糖 ++ ++ ++++龙胆二糖 ++ ++ +++甘油 + + + +麦芽糖醇 ++ ++ ++++乳糖 ++ ++ ++++蔗糖 ++ ++ ++++α-环糊精 - - - -β-环糊精 - - - -γ-环糊精 - - - -L-抗坏血酸 + + + +注在表中，符号“-”，“±”，“+”和“++”意指经过向受体的转移反应，没有检测到糖转移产物；经过向受体的转移反应，检测到低于1％量的糖转移产物；经过向受体的转移反应，检测到1％以上但低于10％量的糖转移产物；经过向受体的转移反应，检测到10％以上量的糖转移产物。
如表28所显示的，它说明本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶利用作为转移受体的不同类型的糖；来源于菌株C9，C11和N75的α-异麦芽糖基葡糖基糖特别是有利地转移到D-/L-木糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，海藻糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，纤维二糖，龙胆二糖，麦芽糖醇，乳糖以及蔗糖；然后转移到D-葡萄糖，D-果糖，D-岩藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，N-乙酰氨基葡萄糖，甘油以及L-抗坏血酸；再后转移到D-阿拉伯糖。来源于菌株A19的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶特别是转移到甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，海藻糖，纤维二糖，麦芽醇，乳糖以及蔗糖；然后转移到D-葡萄糖，D-/L-木糖，D-果糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，异麦芽糖，龙胆二糖，甘油以及L-抗坏血酸；并进一步转移到D-半乳糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-岩藻糖以及异麦芽三糖。
将以上所描述的本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的性质与以前报道的具有6-葡糖基转移作用的酶的性质比较一种在″生物科学生物技术和生物化学″Vol.56，pp.169-173(1992)中公开的糊精葡聚糖酶以及一种在″日本Nogeikagaku Kaishi″Vol.37，pp.668-672(1963)中公开的转葡萄糖苷酶。结果在表29中显示。
表29性质本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶 糊精葡聚糖酶 转葡萄糖苷酶菌株C9菌株C11 菌株N75 菌株A19 对照对照水解活性阴性 阴性阴性阴性 阴性主要阳性最适pH 6.0-6.5 6.0 6.08.4 4.0-4.23.5被EDTA抑制 阳性 阳性阳性阳性 阴性阴性如表29所显示的，本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶具有完全不同于已知糊精葡聚糖酶和转葡萄糖苷酶的明显新的物理化学性质。实验25环四糖的形成用糖进行由α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶与α-异麦芽糖基转移酶形成环四糖的试验。为了试验，制备下列物质的溶液麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，直链淀粉，可溶性淀粉，″PINE-DEX#100″(由日本东京Matsutani化学公司出售的一种淀粉部分水解物)或日本东京wako纯化化学工业有限公司出售的来源于牡蛎的糖原。
向各自具有0.5％浓度的这些溶液的每一种中加入1单位/g固体的实验7-2的方法获得的来自菌株C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品，10单位/g固体的实验7-3的方法获得的来自菌株C11的α-异麦芽糖基转移酶的纯化样品，将所产生的混合物在30℃，pH 6.0下进行酶促反应。酶促条件是下列四个系统(1)在使α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用于糖溶液24小时后，通过加热灭活酶，然后使α-异麦芽糖基转移酶作用于所产生的混合物24小时，通过加热灭活；(2)在使α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶共同作用于糖溶液24小时后，通过加热灭活酶；(3)在仅使α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用于糖溶液24小时后，通过加热灭活酶；以及(4)在仅使α-异麦芽糖基转移酶作用于糖溶液24小时后，通过加热灭活酶。
为了在加热之后测定每一种反应混合物中环四糖的形成水平，用实验1中的类似α-葡萄糖苷酶与葡糖淀粉酶处理反应混合物，以水解剩余的还原寡糖，其后用HPLC定量环四糖。结果在表30中显示。
表30环四糖形成产率(％)底物A B C D麦芽糖 4.0 4.20.00.0麦芽三糖 10.2 12.4 0.00.0麦芽四糖 11.3 21.5 0.00.0麦芽五糖 10.5 37.8 0.00.0直链淀粉 3.5 31.6 0.00.0可溶性淀粉 5.1 38.2 0.00.0淀粉部分水解物 6.8 63.7 0.00.0糖原 10.2 86.9 0.00.0注符号“A”，“B”，“C”和“D”意指使-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶首先作用在底物上，然后使α-异麦芽糖基转移酶作用在底物上；使α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α异麦芽糖基转移酶共同作用在底物上；仅使α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用在底物上；仅使α-异麦芽糖基转移酶作用在底物上。
如表30显示的，在仅α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶或仅α-异麦芽糖基转移酶的作用下无环四糖从受试的任何糖形成，但是环四糖是这些酶的协同作用形成的。
结果说明当使α-异麦芽糖基转移酶在α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用之后作用于糖时，形成水平相当低，约11％之下，而当同时使所述酶同时作用于受试任何糖上时，水平增加，特别是，当使它们分别作用于糖原和淀粉部分水解物时，增加至约87％和约64％。
基于α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的反应性质，估计经由这些酶共同作用的环四糖形成机制如下(1)本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶作用于糖原和淀粉部分水解物等等的α-1，4葡聚糖链的非还原端的葡萄糖残基，葡萄糖残基分子间转移到在其它糖原α-1，4葡聚糖链非还原端上的葡萄糖残基的OH-6，形成在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的α-1，4葡聚糖链；(2)α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有α-异麦芽糖基残基的α-1，4葡聚糖链，分子间转移异麦芽糖基残基至在非还原端具有异麦芽糖基残基的其它α-1，4葡聚糖链的非还原端葡萄糖残基的C-3上，形成在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的α-1，4葡聚糖链；(3)然后，α-异麦芽糖基转移酶作用于在非还原端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基的α-1，4葡聚糖链上，经由分子间转移反应从α-1，4葡聚糖链释放异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基，并将释放的异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基残基环化成环四糖；(4)通过顺序的步骤(1)至(3)，环四糖从释放的α-1，4葡聚糖链形成。这样，估计在如上所述的这种循环方式中，α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶共同作用增加环四糖的形成。实验26淀粉液化度的影响制备15％玉米淀粉悬液，与0.1％碳酸钙混合，调节至pH 6.0，然后每克淀粉与0.2-2.0％″TERMAMYL 60L(一种由丹麦哥本哈根Novo IndutriA/S出售的α-淀粉酶样品)混合，其后在95℃下进行酶促反应10分钟。此后，在120℃的高压灭菌反应混合物20分钟，迅速冷却到约35℃，以获得具有3.2-20.5DE(葡萄糖当量)的液化淀粉。向液化淀粉加入2单位/g固体的在实验7-2的方法中所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品以及20单位/g固体的在实验7-3的方法所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基转移酶的纯化样品，接着在35℃下温育24小时。在反应完成之后，在100℃下加热反应混合物15分钟，以灭活剩余酶。然后，将这样获得的反应混合物以类似于实验1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶处理，以水解剩余的还原寡糖，其后用HPLC定量测定所形成的环四糖。结果在表31中显示。
表31每克淀粉α-淀粉酶的量(％) DE环四糖产率(％)0.2 3.2 54.50.4 4.8 50.50.6 7.8 44.11.0 12.5 39.81.5 17.3 34.42.0 20.5 30.8如表31所显示的，它说明经由α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶共同作用的环四糖形成受淀粉液化度的影响，即，液化度或DE值越低，从淀粉形成环四糖的产率越高。相反，液化度或DE值越高，从淀粉形成环四糖的产率越低。它说明适当的液化程度是约20或更低，优选地是约12或更低，更优选地是约5或更低的DE。实验27淀粉部分水解物浓度的影响制备最终浓度为0.5-40％的″PINE-DEX#100″(一种具有约2到约5 DE值的淀粉部分水解物)的水溶液，分别与1单位/g固体的在实验7-2的方法中所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品以及10单位/g固体的在实验7-3的方法所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基转移酶的纯化样品混合，接着在30℃，pH6.0下使这些酶共同作用48小时。在反应完成之后，在100℃下加热反应混合物15分钟，以灭活剩余酶。然后，将这样获得的反应混合物以类似于实验1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶处理，以水解剩余的还原寡糖，其后用HPLC定量测定所形成的环四糖。结果在表32中显示。
表32PINE-DEX浓度(％) 环四糖形成产率(％)0.563.62.562.05 60.410 57.315 54.620 51.330 45.940 35.9表32所显示的，环四糖的形成产率在0.5％低浓度时是约64％，而在约40％高浓度时是约40％。事实表明环四糖的形成产率依作为底物的淀粉部分水解物的浓度增加。结果说明环四糖的形成产率随淀粉部分水解物的减少而增加。实验28添加环糊精葡聚糖转移酶的影响制备15％″PINE-DEX#100″(一种淀粉部分水解物)的水溶液，与1单位/g固体的在实验7-2的方法中所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品，10单位/g固体的在实验7-3的方法所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基转移酶的纯化样品，0-0.5单位/g固体的来源于微生物嗜热脂肪芽孢杆菌的环糊精葡聚糖转移酶(CGTase)混合，接着在30℃，pH6.0下使这些酶共同作用48小时。在反应完成之后，在100℃下加热反应混合物15分钟，以灭活剩余酶。然后，将这样获得的反应混合物以类似于实验1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶处理，以水解剩余的还原寡糖，其后用HPLC定量测定所形成的环四糖。结果在表33中显示。
表33添加的CGTase的量(单位) 环四糖形成产率(％)054.62.5 60.1563.110 65.2如表33所显示的，添加CGTase增加环四糖形成产率。实验29环四糖的制备制备约100L玉米植物糖原(由日本东京Q.P.公司出售)的4％(w/v)水溶液，调整到pH 6.0和30℃，然后与1单位/g固体的在实验7-2的方法中所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的纯化样品，10单位/g固体的在实验7-3的方法所获得的来源于菌株C11的α-异麦芽糖基转移酶的纯化样品混合，接着温育48小时。在反应完成之后，在100℃下加热反应混合物10分钟，以灭活剩余酶。然后，取出部分反应混合物，用HPLC定量测定环四糖产率，说明它含约84％的环四糖(以糖组合物为基础)。将反应混合物调整到pH 5.0和45 C，以类似于实验1中的α-葡萄糖苷酶和葡糖淀粉酶处理，以水解剩余的还原寡糖，等等。通过添加氢氧化钠将pH调整到5.8，然后在90℃温育1小时，以灭活剩余酶，过滤以除去不溶性物质。用逆渗透膜浓缩滤液，给出约16％(d.s.b.)的浓度，按通常的方式对浓缩物脱色、脱盐、过滤和浓缩，获得具有约3,700g固体含量的糖溶液约6.2kg。
将糖溶液进样到填充有约225L″AMBERLITE CR-1310(Na型)″(一种由日本东京日本Organo公司出售的离子交换树脂)的柱，在60℃柱温和约45 L/h流速下进行色谱。而来源于柱的糖组合物洗脱物如实验1中所描述的由HPLC监测，收集至少98％纯度的环四糖组份，按通常的方式脱盐，脱色，过滤以及浓缩，以获得约2,500g固体含量的糖溶液约7.5kg。糖溶液糖组合物的HPLC测定说明它包含具有约99.5％纯度的环四糖。实验30环四糖在水溶液中的结晶由在实验29的方法获得的具有至少98％纯度的环四糖组份经蒸发浓缩，以给出约50％，d.s.b的浓度。将约5千克浓缩物置于在一圆柱形塑料容器中，通过轻轻旋转条件下约20小时将温度从65℃降低至20℃使其结晶，获得一种白色晶体粉末。图45是最终环四糖的显微照片。经离心滤膜分离上述结晶型浓缩物，获得湿重1,360g的晶体产物，将其进一步在60℃下干燥3小时，获得1,170g环四糖结晶粉末。晶体粉末的HPLC测定说明它含有至少99.9％的非常高纯度的环四糖。
当以粉末x-光衍射分析分析时，晶体粉末形式的环四糖具有图46中特征性主要衍射角度(2θ)10.1°，15.2°，20.3°以及25.5°的衍射光谱。晶体粉末的Karl Fischer法揭示它具有13.0％的水份含量，导致发现其是具有每1摩尔晶体5或6摩尔水的环四糖晶体。
晶体形式环四糖的热重量分析给出图47的热重量曲线。基于重量变化和温度之间的相关性，成功地发现，观察到直到150℃相当于4或5摩尔水的重量降低，在约250℃相当于1摩尔水的重量降低，在280℃或更高的温度下相当于环四糖分解的重量降低。这些结果证实，当在正常压力下加热至150℃时，本发明的环四糖晶体，五或六水合物释放4或5摩尔水变成一水合物晶体，并且直到加热到高达250℃时，进一步释放1摩尔的水变成一种无水晶体。实验31转化成环四糖一水合物将由实验30的方法获得的结晶粉末形式的环四糖五或六水合物置于玻璃容器中并保持在油浴(其已经在140℃预热)中30分钟。与从完整环四糖五或六水合物的粉末x-光衍射分析的结果很不相同，由此获得的环四糖粉末x-光分析给出图48中具有主要衍射角度(2θ)8.3°，16.6°，17.0°以及18.2°的特征性衍射光谱。晶体粉末的Karl Fischer法揭示它具有2.7％的水份含量，导致发现其是具有每1摩尔晶体1摩尔水的环四糖晶体。晶体粉末环四糖的热重量分析给出图49的热重量曲线。基于重量变化和温度之间的相关性，发现，观察到在约270℃相当于1摩尔水的重量降低，进一步观察到在约290℃或更高的温度下相当于环四糖本身分解的重量降低。这些结果证实，这一实验中的环四糖晶体是环四糖一水合物。实验32转化成无水晶体将由实验30的方法获得的结晶粉末形式的环四糖五或六水合物在40℃和120℃下真空干燥16小时。所形成的晶体粉末的Karl Fischer法揭示在40℃干燥的具有4.2％的水份含量，在120℃干燥的具有0.2％的水份含量，表明它基本上是无水的。与环四糖五或六水合物以及真空干燥前的环四糖一水合物的粉末x-光衍射分析的结果很不相同，以上在40℃和120℃下真空干燥过的环四糖的x-光分析在图50中给出具有主要衍射角度(2θ)10.8°，14.7°，15.0°，15.7°和21.5°的特征性衍射光谱。虽然在两种衍射谱之间的峰水平上发现差异，但它们具有实质上相同的峰衍射角度，从晶体照相术上判断它们实质上是相同的晶体一水合物。衍射谱基线显示出类似山的格式，并且晶体一水合物的结晶度低于环四糖五或六水合物以及真空干燥前的环四糖一水合物的结晶度，这些事实揭示存在一种无定形环四糖。基于这些，估计通过在40℃真空干燥获得的具有约4.2％水份含量的环四糖粉末是具有这样水份含量的无定形环四糖与无水晶体环四糖的混合粉末。这些数据说明环四糖五或六水合物被在真空中干燥时转化成无定形和无水形式的环四糖。0.2％水份含量的无水环四糖的热重量分析(如同在实验31中实施的)仅观察到图52所示的重量降低，被认为在约270℃或更高的温度下由热分解引起，如图52所示。实验33环四糖在水中的饱和浓度为了研究10-90℃下环四糖在水中的饱和浓度，将10毫升水置于带密封帽的玻璃容器中，然后以超过各温度下完全溶解水平的过量水平与实验30的方法获得的环四糖五或六水合物混合，密封并搅拌两天，同时保持在10-90℃的各温度下，直到饱和。将所形成的各环四糖饱和溶液进行膜过滤，以除去未溶解的环四糖，经干燥失重法检测保湿含量，以确定环四糖在各温度下的饱和浓度。结果在表34中显示。
表34温度(℃) 饱和浓度(％)10 30.330 34.250 42.670 53.090 70.5实验34热稳定性将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物溶解在水中，配成10％(w/v)的环四糖水溶液，将其8毫升置于玻璃试管中，其后密封试管，在120℃加热水溶液30-90min。在加热之后，将水溶液在大气条件下冷却，测定色度(coloration degree)，并用HPLC测定纯度。基于480nm波长下1cm光通过的池中的吸光度评价色度。结果在表35中显示。
表35加热时间(分钟) 色度(A480nm) 纯度(％)00.00 10030 0.00 10060 0.00 10090 0.00 100如表35所显示的，它说明环四糖是热稳定性糖，因为即使在120℃的高温下加热时环四糖的水溶液不是有色的，并且糖组合物的纯度不降低。实验35pH稳定性将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物溶解在具有不同pH的20mM缓冲液中，配成具有2-10的pH值的4％(w/v)的环四糖水溶液，将其8毫升置于玻璃试管中，其后密封试管，在100℃加热水溶液24小时。在冷却之后，测定各溶液的色度，并用HPLC测定纯度。基于480nm波长下1cm光通过的池中的吸光度评价色度。结果在表36中显示。
表36pH色度 纯度(缓冲液类型) (A480nm) (％)2.0 (乙酸盐缓冲液) 0.00933.0 (乙酸盐缓冲液) 0.00 1004.0 (乙酸盐缓冲液) 0.00 1005.0 (乙酸盐缓冲液) 0.00 1006.0 (Tris-HCl缓冲液)0.00 1007.0 (Tris-HCl缓冲液)0.00 1008.0 (Tris-HCl缓冲液)0.00 1009.0 (铵盐缓冲液)0.00 10010.0(铵盐缓冲液)0.00 100如表36所显示的，即使在2至10宽范围的pH下于100℃加热24小时，环四糖的水溶液也是无色的，在从3至10的pH范围内，糖组合物的纯度一点也不降低，尽管在pH 2下纯度稍有降低。这些事实说明环四糖在比较宽的pH范围内，即，从酸性pH 3至5，中性的pH 6至8，碱性pH 9至10的范围内是高度稳定的。实验36氨基羰基反应将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物溶解在水中，然后，与市售的特等甘氨酸和磷酸缓冲液混合，所形成的混合物用50mM缓冲液调整到pH 7.0，获得包含1％(w/v)甘氨酸的10％(w/v)环四糖溶液。将4毫升置于玻璃试管中，其后密封试管，在100℃加热30-90min。在使其在室温下静置冷却后，测定所形成的各溶液的色度，以测定它们的氨基羰基反应性。基于480nm波长下1cm光通过的池中的吸光度评价色度。结果在表37中显示。
表37加热时间(分钟) 色度(A480nm)00.0030 0.0060 0.0090 0.00如表37所显示的，即使在甘氨酸存在下加热，环四糖也不是有色的，意味着，所说的糖不被甘氨酸诱导褐变，即，环四糖是稳定的糖，其不引起氨基羰基反应，别名Maillard反应。实验37氨基羰基反应将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物和市售的聚胨(Nihonseiyaku K.K.，日本东京)溶解在去离子水中，获得含5％(w/v)聚胨的10％(w/v)环四糖溶液。将4毫升置于玻璃试管中，其后密封试管，在100℃加热30-90min。在使其在室温下静置冷却后，测定所形成的各溶液的色度，以测定它们的氨基羰基反应性。平行对照，提供仅具有聚胨溶液，如上进行类似处理。基于在480nm波长下1cm光通过的池中的测定的吸光度减去对照的吸光度评价色度。结果在表38中显示。
表38加热时间(分钟) 色度(A480nm)0 0.00300.00600.00900.00如表38所显示的，它说明当在聚胨存在下加热时，环四糖不被聚胨诱导褐变，即，糖是稳定的糖，其实质上不引起氨基羰基反应。实验38包含作用将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物溶解在去离子水中，获得20％(w/v)环四糖水溶液。向100g水溶液中添加将要由环四糖包含的2g甲醇，3g乙醇，或4.6g乙酸。此后，将所产生的各溶液过滤，以除去非包含产物，在真空中干燥滤液。作为对照，经使用″ISLOELITETMP″(由日本东京Maruha K.K.出售的分支环糊精，已知其具有包含能力)制备类似的包含产物。
为了测定在所产生的冻干粉中包含产物的量，将每一种粉末1克溶解在5毫升水中，之后在与5毫升二乙醚混合后抽提。重复抽提，所产生的抽提物以气相色谱定量测定。结果在表39中显示。
表39包含产物 包含量(mg/g冻干粉)环四糖 ISOELITE P(对照)甲醇6.71 2.92乙醇17.268.92乙酸67.7430.57如表39所显示的，它说明环四糖具有比分支环糊精高2倍的包含能力。实验39甜化能力将实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物溶解在去离子水中，获得环四糖的10-30％(w/v)水溶液，用作甜化试验的受试溶液。用市售的颗粒糖的6％(w/v)水溶液作为标准，用八个专门小组进行感官试验，结果，环四糖的甜化能力是蔗糖的约27％。实验40消化试验使用实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物，按照K.Okada等在日本营养和食品科学学会杂志(Journal of Japanese Society ofNutrition and Food Science)，Vol.43，No.1，pp.23-29(1990)中报道的方法进行环四糖体外唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶以及肠粘膜酶可消化性试验。作为对照，使用已知基本上不被消化的麦芽糖醇。结果在表40中显示。
表40消化酶 消化酶的分解比例(％)环四糖 麦芽糖醇(对照)唾液淀粉酶 0.0 0.0合成胃液 0.0 0.0胰淀粉酶 0.0 0.0小肠粘膜酶 0.74 4.0如表40所显示的，环四糖完全不被唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶被消化，但是稍微被肠粘膜酶消化，低至0.74％，相当于对照的1/5。这些结果证实环四糖是一种高度不可消化的糖。实验41发酵试验使用实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物，按照T.Oku在日本营养科学和食品科学学会杂志(Journal of Nutritional Scienceand Vitaminology)，Vol.37，No.1，pp.529-544(1991)中的方法进行环四糖由大鼠盲肠内含物可发酵性的试验。经以乙醚麻醉Wister雄性大鼠使大鼠死去收集大鼠盲肠内含物，在厌氧条件下收集内含物，用4倍体积的0.1M碳酸氢钠水溶液悬浮内含物。添加重量为7％的环四糖到盲肠内含物中，用气相色谱定量分析刚添加内含物后和添加12小时后仍然剩余的环四糖的含量。结果，前者和后者环四糖的含量分别是每1克大鼠盲肠内含物68.0mg和63.0mg。这些数据证实环四糖实质上是不可发酵的糖。实验42同化试验使用实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物，按照“A ColorAtlas of Anaerobic Bacteria”(由Tomotari MITSUOKA编辑，由日本东京Kabushiki Kaisha Sobunsha出版，(1984))公开的方法研究环四糖被大鼠盲肠内含物的同化。将约107CFU(集落形成单位)的预培养的新鲜微生物接种到5毫升与0.5％环四糖混合的PYF培养基中，在厌氧条件下37℃培养4天。作为对照，将葡萄糖用作易同化的糖。当后培养物具有pH 6.0或更高时，判断可同化性为阴性，当后培养物具有低于6.0的pH时，判断可同化性为阳性。可同化性的判断通过用采用蒽酮法测定降低的糖水平来测定保持在培养物中的糖含量证实。结果在表41中显示。
表41肠内微生物菌株 可同化性环四糖葡萄糖(对照)普通拟杆菌JCM 5826- +青春双歧杆菌JCM 1275 - +产气荚膜梭菌JCM 3816 - +大肠杆菌IFO 3301 - +产气假杆菌ATCC 25986 - +嗜酸乳杆菌JCM 1132- +
如表41所显示的，证实环四糖不被所有受试菌株同化，但是作为对照的葡萄糖被所有受试菌株同化。这样，证实环四糖是高度不被肠内微生物同化的糖。实验43急性毒性试验实验30的方法获得的晶体环四糖五或六水合物的急性毒性经口服施用到小鼠进行试验。结果说明环四糖具有比较低的毒性，没有引起小鼠死亡，即使以最高的可能的剂量施用时。基于这一点，环四糖的LD50是至少50g/kg小鼠体重，尽管数据不那么精确。
基于实验40至43的结果，口服施用环四糖时，其实质上不被活体同化或吸收，可以预期以食物甜味剂，具有相当高的甜化能力的甜味剂添加剂，粘性剂，药膳添加剂和主料被用作非-或低热可食用原料以及可以进一步地用作替代脂肪的可食用纤维与食品原料。
以下实施例A描述环四糖和产生包含它的糖组合物的方法，实施例B描述了包含环四糖或糖组合物的组合物实施例A-1依据实验3中方法在发酵罐中培养微生物圆孢芽孢杆菌C9(FERMBP-7143)48小时。在培养完成之后，对所形成的培养物用SF膜过滤，以除去细胞，收集18L培养上清液。然后，用UF膜浓缩培养上清液，以收集约一升包含8.8单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和26.7单位/mlα-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。
将土豆淀粉制备成约2％的淀粉悬液，与氯化钙混合，给出1mM终浓度，调节至pH 6.0，95℃加热约20分钟以胶化淀粉。然后将所产生的混合冷却至35℃，与0.25ml上述浓缩酶溶液(对每1克淀粉(d.s.b.))混合，接着在pH 6.0和35℃下进行酶促反应48小时。将反应混合物加热，并在95℃下保持10分钟，然后冷却和过滤。滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，进一步浓缩和喷雾干燥，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得包含环四糖的粉末。
因为产物包含(基于干固体重)0.7％葡萄糖，1.4％异麦芽糖，11.1％麦芽糖，62.1％环四糖以及24.7％其它糖，并具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂以及粉碎基质。实施例A-2将土豆淀粉制备成约6％悬液，与碳酸钙混合，给出0.1％的终浓度，调整到pH 6.0，进一步与0.2％/g淀粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一种丹麦哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-淀粉酶)混合，然后在约95℃加热10分钟。此后将混合物在120℃下高压灭菌20分钟，迅速冷却到约35℃，以获得具有约4的DE(葡萄糖当量)的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g淀粉(d.s.b.)的实施例A-1的包含α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。在pH 6.0和35℃下进行酶促反应48小时。加热反应混合物，在95℃保持10分钟，然后冷却和过滤。滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)浓缩成60％的环四糖糖浆。
因为产物包含(基于干固体重)0.9％葡萄糖，1.5％异麦芽糖，11.3％麦芽糖，60.1％环四糖以及26.2％其它糖，并具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂和包含剂。实施例A-3依据实验6中方法在发酵罐中培养微生物圆孢芽孢杆菌C11(FERMBP-7144)48小时。在培养完成之后，对所形成的培养物用SF膜过滤，以除去细胞，收集18L培养上清液。然后，用UF膜浓缩培养上清液，以收集约一升包含9.0单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和30.2单位/mlα-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。将木薯淀粉制备成约25％淀粉悬液，然后与0.2％/g淀粉(d.s.b.)的″NEO-SPITASE″(一种日本京都Nagase生物化学有限公司出售的α-淀粉酶)混合。此后，将反应混合物在120℃下高压灭菌20分钟，迅速冷却到约35℃，以获得具有约4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g淀粉(d.s.b.)的上述包含α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液，并进一步添加10单位/g淀粉(d.s.b.)的CGTase(日本Okayama的Hayashibara生化实验室公司出售)。接着在pH 6.0和35℃下进行酶促反应48小时。加热反应混合物，在95℃保持30分钟，然后冷却和过滤。调整到pH 5.0和50℃，与300单位/g淀粉(d.s.b.)的″TRANSGLUCOSIDASEL AMANOTM″(一种由日本Aichi的Amano药物公司出售的α-葡萄糖苷酶)混合，其后进行24小时的酶促反应。进一步将反应混合物与30单位/g淀粉(d.s.b.)的″GLUCOZYME″(一种由日本京都Nagase生物化学公司出售的葡糖淀粉酶制剂)混合，然后进行酶促反应17小时。对这样获得的反应混合物加热，在95℃保持30分钟，接着冷却和过滤，以获得滤液。所形成的滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)浓缩成60％的环四糖糖浆。
因为产物包含(基于干固体重)38.4％种葡萄糖，58.1％环四糖以及3.5％其它糖，并具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂和包含剂。实施例A-4将土豆淀粉制备成约20％悬液，与碳酸钙混合，给出0.1％的终浓度，调整到pH 6.5，进一步与0.3％/g淀粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一种丹麦哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-淀粉酶)，然后在约95℃进行酶促反应15分钟。此后将混合物在120℃下高压灭菌20分钟，迅速冷却到约35℃，以获得具有约4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.25ml/g淀粉(d.s.b.)的实施例A-3的包含α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。在pH 6.0和35℃下进行酶促反应48小时。加热反应混合物，在95℃保持30分钟，调整到pH 5.0和50℃，在加入300单位/g淀粉(d.s.b.)的″TRANSGLUCOSIDASE LAMANOTM″(一种由日本Aichi的Amano药物公司出售的α-葡萄糖苷酶)后进行24小时的酶促反应。接着在加入30单位/g淀粉(d.s.b.)的″GLUCOZYME″(一种由日本京都Nagase生物化学公司出售的葡糖淀粉酶制剂)后进行酶促反应17小时。对这样获得的反应混合物加热，在95℃保持30分钟，接着冷却和过滤，以获得滤液。所形成的滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)浓缩成60％的环四糖糖浆。
因为产物包含(基于干固体重)34.2％葡萄糖，62.7％环四糖以及3.1％其它糖，并具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂和包含剂。实施例A-5对在实施例A-3的方法所获得的环四糖糖浆用″AMBERLITE CR-1310(Na型)″(由日本东京日本Organo公司出售的一种强酸性阳离子交换树脂)进行柱色谱，将树脂填充到具有5.4cm直径的四个外套不锈钢柱中，然后系列级联它们给出20m的总凝胶床宽度。在保持内部柱温60℃的条件下，将糖浆以5％(v/v)体积上样到柱上，经以0.13的SV(空速)加入加热到60℃的热水到柱上进行分级分离，同时用HPLC检测洗脱物的糖组成，以获得高环四糖含量的组份，然后纯化组份，以约21％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得高环四糖含量溶液。溶液包含约98％(d.s.b.)的环四糖。
浓缩溶液，给出约70％的浓度，然后置于结晶器中，与2％的晶体环四糖五或六水合物混合，逐渐冷却，获得约45％结晶度的糖膏。将糖膏以150kg/cm2高压从装备在干燥塔顶端上的喷管喷射。同时将空气加热到85℃，使所加热的热空气从干燥塔的上部吹出，所产生的晶体粉末收集到在塔底部提供的输送线运输机上，从塔逐渐移出，同时向其上吹加热到45℃的热空气。将所产生的晶体粉末注射到熟化塔熟化10小时，同时将热空气吹到内含物上以完成结晶和干燥，获得环四糖五或六水合物的晶体粉末。
因为产物具有比较低的还原性，既不引起氨基羰基反应也不显示吸水性，并具有令人满意的可操作性，适当的低甜度，足够的粘性，水份保持能力，包含能力，实质上的不可消化性，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，相对低热量食品原料，风味和味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂和以及粉碎基质。实施例A-6为了增加实施例A-4的方法所获得的环四糖糖浆中的环四糖含量，依据实施例A-5的方法用强酸性阳离子交换树脂对作为原料糖溶液的糖浆进行柱色谱，其后收集和纯化高环四糖含量的组份，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得高环四糖含量的溶液。
浓缩溶液，给出约85％浓度，然后逐渐冷却，同时搅拌以进行结晶。将所产生的物质转移到一塑料容器，使其在室温下静置结晶，并熟化内含物。所产生的块用刀具研磨成粉末，获得环四糖五或六水合物的晶体粉末。
因为产物实质上没有吸水性，并具有令人满意的可操作性，适当的低甜度，足够的粘性，水份保持能力，包含能力，实质上的不可消化性，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，相对低热量食品原料，风味和味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂和以及粉碎基质。实施例A-7使实施例A-6的方法获得的高环四糖含量的溶液继续结晶，同时浓缩。所产生的糖膏由悬筐型离心机分离，以获得晶体，然后与少量的水喷雾，以约55％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得高纯度的环四糖五或六水合物。
因为产物包含至少98％(d.s.b.)的高纯度的晶体环四糖五或六水合物，具有比较低的还原性，实质上既不引起氨基羰基反应也不显示吸水性，并具有令人满意的可操作性，适当的低甜度，足够的粘性，水份保持能力，包含能力，实质上的不可消化性，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，相对低热量食品原料，风味和味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂和以及粉碎基质。实施例A-8将由5.0％(w/v)玉米植物糖原，1.0％(w/v)″ASAHIMEAST″(一种酵母提取物)，0.1％(w/v)磷酸氢二钾，0.06％(w/v)磷酸钠十二水合物，0.05％(w/v)硫酸镁六水合物，和水组成的液体营养培养基以20L的量置于30L发酵罐中，121℃高压灭菌20分钟，冷却到27℃，然后接种1.0％(w/v)圆孢芽孢杆菌C11菌株(FERM BP-7144)的按照实验6的方法制备的种子培养物，在通气和搅拌条件下于27℃和pH 6.0-7.0培养72小时。所产生的培养物通过在121℃加热20分钟灭菌，冷却离心。收集上清液，并用UF膜过滤。所产生的滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，以约40％(d.s.b.)的产率(对原料植物糖原而言)获得环四糖。这样获得的溶液包含约87％(d.s.b.)的环四糖。
使上述溶液继续结晶，同时浓缩。所产生的糖膏由悬筐型离心机分离，以获得晶体，然后与少量的水喷雾，以约25％(d.s.b.)的产率(对原料植物糖原而言)获得具有至少98％纯度的环四糖五或六水合物。
因为产物高纯度环四糖五或六水合物具有比较低的还原性，实质上既不引起氨基羰基反应也不显示吸水性，并具有令人满意的可操作性，适当的低甜度，足够的粘性，水份保持能力，包含能力，实质上的不可消化性，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，相对低热量食品原料，风味和味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂和以及粉碎基质。实施例A-9依据实验10中方法在发酵罐中培养微生物圆孢芽孢杆菌N75(FERMBP-7591)48小时。在培养完成之后，对所形成的培养物用SF膜过滤，以除去细胞，收集18L培养上清液。然后，用UF膜浓缩培养上清液，以收集约800毫升包含6.0单位/m1本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和20.0单位/mlα-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。将玉米淀粉制备成约30％的淀粉悬液，与碳酸钙混合，给出0.1％的浓度，调节至pH 6.5，与0.3％/g淀粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一种丹麦哥本哈根NovoIndustri A/S出售的α-淀粉酶)混合，在95℃进行酶促反应15分钟。此后将混合物在120℃下高压灭菌20分钟，迅速冷却到约51℃，以获得具有约4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.4ml/g淀粉(d.s.b.)的上述包含α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液以及3单位/g淀粉(d.s.b.)的CGTase(日本Okayama的Hayashibara生化实验室公司出售)。接着在pH 5.5和51℃下进行酶促反应48小时。此后加热反应混合物，在95℃保持30分钟，调整到pH 5.0和50℃，在加入300单位/g固体的″TRANSGLUCOSIDASE L AMANOTM″(一种由日本Aichi的Amano药物公司出售的α-葡萄糖苷酶)后进行24小时的酶促反应。然后在加入20单位/g固体的″GLUCOZYME″(一种由日本京都Nagase生物化学公司出售的葡糖淀粉酶制剂)后进行酶促反应17小时。对这样获得的反应混合物加热，在95℃保持30分钟，冷却和过滤。所形成的滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，获得含有44.0％(d.s.b.)的环四糖糖浆。为了增加环四糖含量，依据实施例A-5的方法用强酸性阳离子交换树脂对作为原料糖溶液的糖浆进行柱色谱，其后收集和纯化高环四糖含量的组份，接着浓缩和喷雾干燥所述组份，以约45％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得含有环四糖的粉末。
因为产物包含(基于干固体重)3.7％葡萄糖，80.5％环四糖以及15.8％其它糖，并具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂，包含剂以及粉碎基质。实施例A-10依据实验14中方法在发酵罐中培养微生物圆孢芽孢杆菌A19(FERMBP-7590)48小时。在培养完成之后，对所形成的培养物用SF膜过滤，以除去细胞，收集18L培养上清液。然后，用UF膜浓缩培养上清液，以收集约1升包含15.2单位/ml本发明的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和23.0单位/mlα-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液。
将土豆淀粉制备成约5％的淀粉悬液，然后与碳酸钙混合，给出0.1％的浓度，调节至pH 6.0，与0.2％/g淀粉(d.s.b.)的″TERMAMYL 60L″(一种丹麦哥本哈根Novo Industri A/S出售的α-淀粉酶)混合，在95℃进行酶促反应10分钟。此后将混合物在120℃下高压灭菌20分钟，迅速冷却到约40℃，以获得具有约4的DE的液化溶液。向液化溶液中添加0.5ml/g淀粉(d.s.b.)的由上述方法获得的包含α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶的浓缩酶溶液，接着在pH 6.0和40℃下进行酶促反应48小时。加热反应混合物，在95℃保持10分钟，冷却和过滤。所形成的滤液按常规方式用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换剂脱盐和纯化，以约90％(d.s.b.)的产率(对原料淀粉而言)获得含有70％(w/v)环四糖的糖浆。
因为产物包含(基于干固体重)2.5％葡萄糖，6.3％异麦芽糖以及30.1％环四糖，具有适合的甜度，足够的粘性，水份保持能力以及包含能力，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，味道改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，脱色阻止剂，填充剂以及包含剂。实施例B-1甜味剂向0.8重量份的实施例A-7的方法获得晶体四糖五或六水合物均匀加入0.2重量份的″TREHA″(由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的一种晶体海藻糖水合物)，0.01重量份的″αGSWEETTM″(由日本东京Toyo糖精炼公司出售的α-葡基斯替维苷)以及0.01重量份的″ASPALTAME″(L-天冬酰基-L-苯基丙氨酸甲酯)，将所形成的混合物加入到造粒机中，获得颗粒状的甜味剂。产物具有令人满意的甜度和高于蔗糖2倍的甜化能力。因为晶体的环四糖五或六水合物简直不被消化和发酵，并且实质上无卡路里，就甜化能力而言，产物的卡路里是蔗糖的约1/10。此外，在室温贮存时，产物实质不变质并且稳定。这样，产物可以适合地用作高质低热和少热的甜味剂。实施例B-2硬糖果100重量份的55％(w/v)蔗糖溶液在加热的同时与50重量份的实施例A-2的方法获得的环四糖的糖浆混合。然后通过在减压下加热浓缩混合物，给出不到2％的水份含量，将浓缩物与0.6重量份的柠檬酸和充足量的柠檬香料混合，其后以通常的方式将其制备成所需产物。产物是稳定的高质硬糖，具有令人满意的口感，味道和香味，很少吸附吸收水份，并且既不引起蔗糖结晶也不引起熔化。实施例B-3口香糖将3重量份的口香糖基料加热熔化至柔软的程度，与2重量份的无水晶体麦芽醇，2重量份的木糖醇，2重量份的实施例A-7的方法获得的晶体环四糖五或六水合物混合，并且进一步与1重量份的海藻糖以及适量的香料和颜料混合。以通常的方式滚动捏制混合物，造型并包装，获得所需产物。这样获得的产物是具有令人满意的质地，味道和香味的相对低产热和热值的口香糖。实施例B-4甜化牛奶在100重量份的新鲜的牛奶中溶解2重量份的实施例A-5的方法获得的环四糖五或六水合物的晶体粉末以及2重量份的蔗糖，采用板式加热器加热灭菌溶液，然后浓缩，给出70％的浓度。将浓缩物无菌罐装，获得所需产物。因为产物具有适当的甜度以及令人满意的风味与味道，它可以任意用于给水果，咖啡，可可及茶调味。实施例B-5乳酸饮料将175份脱脂奶粉，130重量份的实施例A-4的方法获得的包含环四糖的糖浆，50重量份的″NYUKAOLIGO@″(一种由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的高乳蔗糖含量粉末)溶解在1,150重量份的水中。将所产生的溶液在65℃下灭菌30分钟，然后冷却到40℃，以通常的方式接种30重量份的作为引酵物的乳酸菌，在37℃下培养8小时，获得具有乳酸菌的饮料。产物适于用作乳酸饮料，其具有令人满意的风味与味道，包含寡糖和环四糖，稳定地保持乳酸菌，并且具有促进细菌生长以及控制肠内状况的作用。实施例B-6果汁粉33重量份的经喷雾干燥制备的橙汁粉在搅拌下与50重量份的实施例A-7的方法获得的环四糖五或六水合物，10重量份的无水晶体麦芽糖醇，0.65重量份的无水柠檬酸，0.1重量份的苹果酸，0.2重量份的2-O-α-D-葡糖基-L-抗坏血酸，0.1重量份的柠檬酸钠，0.5重量份的支链淀粉以及适量的粉状香料充分混合。将混合物研磨成细粉，然后置于硫化床造粒机中(调整到吹空气至40℃)，用适量的浓缩溶液(富含作为结合剂的实施例A-5的方法获得的环四糖)喷射造粒30分钟，称重，包装，获得所需产物。产物是具有约30％水果汁含量的果汁粉。产物也具有作为一种高质低热汁的高产量，因为它不具有任何不愉快的味道与气味。实施例B-7乳蛋糕奶油将100重量份的玉米淀粉，100重量份的实施例A-2的方法获得的环四糖，60重量份的海藻糖，40重量份的蔗糖以及1重量份的盐充分混合，然后进一步与280重量份的鲜蛋混合，其后搅拌。向所产生的混合物中逐渐混于1,000重量份的煮沸的牛奶。在火上进一步搅拌混合物，在玉米淀粉完全成胶状后，全部内含物为半透明时停止加热，其后冷却所形成的物质，将其与香草香料混合，然后称量，注入以及包装，获得所需产物。产物是一种高质乳蛋糕奶油，具有优雅的光泽，令人满意的风味和味道，并且很好地抑制淀粉老化。实施例B-8巧克力将40重量份的可可糊状物，10重量份的可可黄油以及50重量份的实验24的方法获得晶体环四糖一水合物混合，将混合物置于精炼机，降低颗粒大小，然后置于巧克力搅拌揉捏机中，在50℃下揉两天两夜。在进行加工期间，加入0.5重量份的卵磷脂，充分分散到所揉的混合中。此后，用热控制器将所产生的混合物调整到31℃，然后恰好在黄油凝固之前倾入模具中，脱空气，包装以及经穿过保持在10℃的冷道固化。从模具除去固化的内含物，包装，获得所需产物。产物实质上无任何吸水性，有令人满意的颜色，光泽以及内部结构；在口中流利地溶解；并且具有高质量的甜度和温和的风味与味道。产物也可以用作低致热和低热值巧克力。实施例B-9uiro-no-moto(uiro(甜米冻)的预混物)向90重量份的米粉中加入20重量份的玉米淀粉，70重量份的无水晶体麦芽醇，50重量份的包含实施例A-1的方法获得的环四糖的粉末以及4重量份的支链淀粉，将所产生的混合物均匀混合成uiro-no-moto预混物，将该预混物与适量的matcha(绿茶粉末)和水充分揉和，然后置于容器中蒸60分钟，获得具有matcha的uiro。产物具有令人满意的光泽，口感，味道和香味，它可以适于用作长货架寿命的低热量uiro，其中淀粉的老化受到充分抑制。实施例B-10An(大豆酱)10重量份的大豆在加入水后以通常方式煮沸，除去收敛性物质，灰汁以及水溶性杂质，获得约21重量份的颗粒形式的粗大豆酱。向粗大豆酱加入14重量份的蔗糖，5重量份的包含实施例A-3的方法获得的环四糖的糖浆，4重量份的水，将所产生的混合物煮沸，与少量的色拉油混合，然后揉制，获得约35重量份的所需产物。因为产物具有令人满意的稳定性，口感，味道和香味，并且实质上没有烘烤的脱水收缩和额外颜色，其可以任意地用作糖食原料，如bean jam bun，″manju″(一种具有大豆酱的日本糖食)，充有大豆酱的薄饼，以及冰淇淋/糖果原料。实施例B-11面包向100重量份的小麦面粉，2重量份的酵母，5重量份的蔗糖，1重量份的包含实施例A-1的方法获得的环四糖的粉末，0.1重量份的酵母食品，以通常的方式用水揉捏，在26℃下发酵两小时，熟化30分钟，然后烘烤。产物是一种具有令人满意的颜色和结构以及充分弹力和适当甜度的高质面包。实施例B-12火腿向1000重量份的火腿肉片加入15重量份的盐和3重量份的硝酸钾，研磨均匀，将所形成的肉片堆叠，并使其在冷库中静置一天一夜。此后，首先将所产生的片在冷库中浸泡在盐溶液中，该溶液含有500重量份的水，100重量份的盐，3重量份的硝酸钾，40重量份的包含实施例A-5的方法获得的环四糖五或六水合物的粉末以及适量的肉片，然后以通常方式以冷水洗涤，用线系好，烟熏，煮，冷却以及包装，获得所需产物。
产物是一种具有令人满意的色彩，味道和香味的高质火腿。实施例B-13粉末状肽将1重量份的40％″HINUTE S″(一种由日本东京富士油业公司出售的可食用酱油大豆肽溶液)与2重量份的包含实施例A-6的方法获得环四糖五或六水合物的粉末混合，将所产生的混合物置于塑料容器中，在50℃下真空干燥，并研磨成粉，获得粉末状肽。具有令人满意的风味与味道的产物可以任意用作糖食原料，如premixes，冰糕以及冰淇淋的原料，用作实质上不可消化的可食用纤维和控制肠内状况的物质(其用于口服及插管摄食的液体饮食)。实施例B-14粉末状蛋黄经平板加热器在60-64℃下灭菌从新鲜蛋制备的蛋黄，将1重量份的所形成的液体与4重量份的包含依据实验25的方法获得的无水晶体环四糖末粉的粉末。将所产生的混合物转移到容器中，使其静置一夜，形成块，同时使环四糖转化成环四糖五或六水合物，将这样获得的块用刀具研磨成粉末状蛋黄粉末。
产物可以任意用作糖食原料，如premixes，冰糕以及冰淇淋的原料，用作实质上不可消化的可食用纤维和控制肠内条件的物质(其用于口服及插管摄食的液体饮食)。产物也可以任意用作美肤剂，生发剂，等等。实施例B-15浴盐将1重量份的″yuzu″(一种中国柠檬)皮汁与10重量份的包含依据实验25的方法获得的无水晶体环四糖的粉末。其后结晶以形成晶体环四糖五或六水合物，熟化所形成的晶体，研磨熟化的晶体，获得含有yuzu皮提取物的晶体环四糖五或六水合物的粉末。
通过将5重量份的上述粉末与90重量份的烤盐，2重量份的含水晶体海藻糖，1重量份的硅酸酐，0.5重量份的″αG HESPERIDIN″(由日本Okayama Hayashibara Shoji公司出售的α-葡基橙皮甙)混合获得浴盐。
产物是一种高质量的浴盐，其富含yuzu香味，经以热水稀释100-10,000倍使用，其滋润和光滑皮肤，在洗浴后不使人感觉到冷。实施例B-16化妆用油膏将2重量份的聚氧乙烯二醇一硬脂酸酯，5重量份的自乳化型甘油一硬脂酸酯，2重量份的实施例A-8的方法获得晶体环四糖五或六水合物粉末，1重量份的″αG RUTIN″(由日本Okayama的Hayashibara Shoji公司出售的α-葡基芸香甙)，1重量份的液态矿脂，10重量份的甘油三-2-乙基己酸酯以及适量的防腐剂以通常方式加热溶解。将所产生的溶液与2重量份的L-乳酸，5重量份的1，3-丁二醇以及66重量份的精制过的水混合，经匀浆器乳化所产生的混合物，与适量的香料搅拌混合，获得化妆用油膏。产物表现出抗氧化剂活性并具有比较高的稳定性，这些使得其作为高质遮光剂、皮肤护理剂和皮肤增白剂非常有用。实施例B-17牙膏通过混合45重量份的磷酸氢钙，1.5重量份的月桂基硫酸钠，25重量份的甘油0.5重量份的聚氧化乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯，15重量份的包含实施例A-2的方法获得的环四糖的糖浆，0.02重量份的糖精，0.05重量份的防腐剂以及13重量份的水获得牙膏。产物在使用之后具有改进的味道和满意的感觉，而不降低表面活性剂的洗涤效果。实施例B-18流食的固体制剂将100重量份的实施例A-6方法获得的晶体环四糖五或六水合物，200重量份的含水晶体海藻糖，200重量份的高麦芽四糖含量粉末，270重量份的蛋黄粉末，209重量份的脱脂奶粉，4.4重量份的氯化钠，1.8重量份的氯化钾，4重量份的硫酸镁，0.01重量份的硫胺素，0.1重量份的L-抗坏血酸钠，0.6重量份的维生素E乙酸盐以及0.04重量份的烟酰胺混合。将所产生的组合物的25克小份注射进防水薄小袋中，加热密封，获得所需产物。
产物是一种富含实质上不可消化的可食用纤维(由于环四糖)并具有令人满意的肠内控制作用的流食。将一袋产物溶解在约150-300ml水中成为流食，经口头使用或者插管到鼻腔，胃部，肠部等任意使用，以补充机体能量。实施例B-19片剂将50重量份的阿斯匹林与14重量份的实施例A-7的方法获得的晶体环四糖五或六水合物粉末，4重量份的玉米淀粉混合。经压片机按通常的方式将所形成的混合物压片，各获得各680mg，5.25mm厚度的片。
采用环四糖的填料赋予能力加工成的该片剂实质上不具有吸水性，有足够的机械强度以及十分令人满意的可降解性。实施例B-20糖衣片作为核心(150mg重)的粗片用第一溶液进行糖涂布，所说的第一溶液含有40重量份的实施例A-7的方法获得的晶体环四糖五或六水合物粉末，2重量份的支链淀粉(具有200,000的平均分子量)，30重量份的水，25重量份的滑石，3重量份的氧化钛，直到重量达到约230mg。然后所产生的物质用第二溶液进行糖涂布，所说的第二溶液含有65重量份的结晶环四糖五或六水合物的相同粉末，1重量份的支链淀粉以及34重量份的水；用液态蜡上光，获得了具有令人满意的光泽和外观的糖衣片。产物具有比较高的冲击耐受性，并在长时间保持高的质量。实施例B-21治疗创伤的软膏向100重量份的实施例A-7的方法获得的晶体环四糖五或六水合物的粉末和300重量份麦芽糖中加入50重量份溶于3重量份碘中的甲醇，进一步加入200重量份的10％(w/v)含水支链淀粉溶液，获得具有适度延伸性和胶粘性的所需产物。产物是高质软膏，其中碘和甲醇的分散被环四糖很好地抑制，并且在贮存期间具有相对低的变化。
因为产物发挥碘的灭菌作用，并且基于麦芽糖，起到对活细胞的能量补充作用，故它缩短医治时间，并很好地治疗受患病部位和表面。
工业实用性如以上描述的，本发明涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶以及其制备方法和用途，更具体地说，涉及一种新的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其制备方法，产生该酶的微生物，使用酶的α-葡糖基转移方法，用于形成α-异麦芽糖基葡糖基糖的方法，产生具有环{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)结构的环四糖的方法，包含由此获得的糖的组合物。根据本发明，一种工业上有用的具有环{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)结构的环四糖以及包含它的组合物可以以工业规模、以相对低的成本产生。因为这些环四糖和包含它的组合物实质上没有或有低的还原性，实质上不引起氨基羰基反应，实质上也不表现出吸水性，具有容易处理性，具有适当的甜度，足够的粘性，水份保持能力，包含能力以及实质上不可消化性，它可以有利地用于各种组合物，如食品，化妆品以及药物，作为甜味剂，低热食品原料，味道改善剂，风味改善剂，质量改善剂，脱水收缩阻止剂，稳定剂，填充剂，包含剂以及粉碎基质。具有这些显著功能和作用的本发明对本领域的巨大贡献是明显重要的。
序列表序列表<110>Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo<120>α-异麦芽糖葡糖基糖形成酶，其制备方法和用途<130>WO854<150>233,364/00<151>2000-8-1<150>234,937/00<151>2000-8-2<160>19<210>1<211>9<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)<400>1Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>2Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Asn Gly1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>3Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro Tyr Gly1 5 10<210>4<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>4Ile Asp Gly Val Tyr His Ala Pro1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>5Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr1 5<210>6<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>6Trp Ser Leu Gly Phe Met Ash Phe1 5<210>7<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>7Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe1 5<210>8<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>8Gly Asn Glu Met Arg Asn Gln Tyr1 5<210>9<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>9Ile Thr Thr Trp Pro Ile Glu Ser1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>10Trp Ala Phe Gly Leu Trp Met Ser1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>11His Val Ser Ala Leu Gly Ash Leu Leu1 5<210>12<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>12Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val1 5<210>13<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>13Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala1 5<210>14<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>14Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu1 5<210>15<211>6<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>15Asn Trp Trp Met Ser Lys1 5<210>16<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>16Thr Asp Gly Gly Glu Met Val Trp1 5<210>17<211>8<212>PRT<213>圆孢芽孢杆菌<400>17Asn Ile Tyr Leu Pro Gln Gly Asp1 5<210>18<211>13<212>PRT<213>球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)<400>18Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly1 5 10<210>19<211>10<212>PRT<213>分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)<400>19Asp Thr Leu Ser Gly Val Phe His Gly Pro1 5 10
权利要求
1.α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其通过催化从具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖转移α-葡糖基，形成具有至少为3的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖，而实质上不增加还原力。
2.权利要求1的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其实质上不能形成葡聚糖，并且被EDTA抑制。
3.权利要求1或2的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其中所说的具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖是选自下组的一个或多个成员麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，液化淀粉以及糖原。
4.具有下列物理化学性质的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶(1)活性通过催化从具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖转移α-葡糖基，形成具有至少为3的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖，而实质上不增加还原力；(2)分子量当在SDS-PAGE上测定时，具有约74,000到约160,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电聚焦电泳上测定时，具有约3.8到约7.8的等电点。(4)最适温度当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约40℃到约50℃的最适温度；当存在1mM Ca2+、在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃到约55℃的最适温度；当在pH 8.4下温育60分钟时，具有60℃的最适温度；当存在1mM Ca2+、在pH 8.4下温育60分钟时，具有65℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育60分钟时，具有约6.0到约8.4的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+、在pH 6.0下温育60分钟时，具有约50℃或更低温度的热稳定区；当在pH 8.0下温育60分钟时，具有约55℃或更低温度的热稳定区；当存在1mM Ca2+、在pH 8.0下温育60分钟时，具有约60℃或更低温度的热稳定区；和(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有约4.5到约10.0的pH稳定区。
5.权利要求1至4之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其包含选自下组的一个或多个氨基酸序列SEQ ID NO1，SEQ ID NO5到7，SEQ ID NO11到14以及SEQ ID NO18。
6.权利要求1至5之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其被Ca2+和Mn2+稳定和/或活化。
7.权利要求1至6之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，其是纯化的或粗的酶。
8.产生权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的方法，其包括下列步骤在营养培养基中培养能够产生权利要求1至6之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶的微生物；并且从所形成的培养物中收集权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶。
9.权利要求8的方法，其中所说的微生物是芽孢杆菌属或节杆菌属的微生物。
10.权利要求9的方法，其中所说的芽孢杆菌属的微生物是选自下组的微生物圆孢芽孢杆菌C9，FERM BP-7143；圆孢芽孢杆菌C11，FERMBP-7144；圆孢芽孢杆菌N75，FERM BP-7591；和它们的突变体。
11.权利要求9的方法，其中所说的节杆菌属的微生物是选自下组的微生物球形节杆菌A19，FERM BP-7590；和其突变体。
12.一种α-葡糖基转移反应的方法，其包括将权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶与包含糖的溶液接触，所说的糖具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键。
13.权利要求12的方法，其中糖转移产物是在选自下组的一种或多种受体存在下经α-葡糖基转移反应形成的D-葡萄糖，D-木糖，L-木糖，D-半乳糖，D-果糖，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，D-岩藻糖，D-阿洛酮糖，L-山梨糖，甲基-α-吡喃葡萄糖苷，甲基-β-吡喃葡萄糖苷，N-乙酰氨基葡萄糖，海藻糖，异麦芽糖，异麦芽三糖，纤维二糖，龙胆二糖，甘油，麦芽糖醇，乳糖，蔗糖以及L-抗坏血酸。
14.一种用于形成α-异麦芽糖基葡糖基糖的方法，其包括将权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶与包含如下糖的溶液接触，进行α-葡糖基转移反应，所说的糖具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键。
15.权利要求14的方法，其中所说的糖是选自下组的糖麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，液化淀粉以及糖原。
16.具有环{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖或者包含它的糖组合物，其可通过下列方法获得将权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶和α-异麦芽糖基转移酶两者与包含具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖的溶液接触，其中所说的α-异麦芽糖基转移酶特异性地水解在α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶作用下形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖的α-异麦芽糖基部分和其余葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移给受体。
17.权利要求16的环四糖或者糖组合物，其中所说的具有至少为2的葡糖聚合度的糖是选自下组的糖麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，液化淀粉以及糖原。
18.一种具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖或者包含它的糖组合物，其可通过下列方法获得将权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶和α-异麦芽糖基转移酶两者与包含具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖的溶液接触，以获得包含所说的环四糖以及其它糖的溶液；并将所说的溶液进行使用强酸阳离子交换树脂的柱色谱，其中所说的α-异麦芽糖基转移酶特异性地水解在α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶作用下形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖的α-异麦芽糖基部分和其余葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移给受体。
19.权利要求16至18之任一项的环四糖或糖组合物，其含有基于干固体的至少30％(w/w)具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖。
20.权利要求16至19之任一项的环四糖或糖组合物，其是糖浆，糖膏，无定形粉末，无定形固体，晶体粉末，或晶体固体形式的。
21.权利要求20的环四糖或糖组合物，其中所说的晶体是选自下组的一个或多个成员晶体环四糖五或六水合物；晶体环四糖一水合物；无水晶体环四糖，它们都具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构。
22.权利要求20或21的环四糖或糖组合物，其中所说的晶体是通过在水溶液中结晶制备的，不使用任何有机溶剂。
23.权利要求16至22之任一项的环四糖或糖组合物，其中所说的包含环四糖的糖是这样的糖，其含有环{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}和一种或多种选自下组的糖葡萄糖，麦芽糖以及具有至少为3的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖。
24.具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖或者包含它的糖组合物，其可通过下列方法获得在含有具有至少为2的葡糖聚合度、并且在非还原端具有作为连接键的α-1，4糖苷键的糖的营养培养基中培养微生物，所说的微生物能够产生权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶和α-异麦芽糖基转移酶两者，所说的α-异麦芽糖基转移酶特异性地水解α-异麦芽糖基部分和其余α-葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移给受体。
25.环四糖或糖组合物，其中所说的具有至少为2的葡糖聚合度的糖是选自下组的糖麦芽寡糖，麦芽糖糊精，淀粉糊精，直链淀粉，支链淀粉，可溶性淀粉，液化淀粉以及糖原。
26.权利要求24或25的环四糖或糖组合物，其中所说的微生物是芽孢杆菌属或节杆菌属的微生物。
27.权利要求26的环四糖或糖组合物，其中所说的芽孢杆菌属的微生物是选自下组的微生物圆孢芽孢杆菌C9，FERM BP-7143；圆孢芽孢杆菌C11，FERM BP-7144；圆孢芽孢杆菌N75，FERM BP-7591；和它们的突变体。
28.权利要求26的环四糖或糖组合物，其中所说的节杆菌属的微生物是选自下组的微生物球形节杆菌A19，FERM BP-7590；和其突变体。
29.权利要求24至28之任一项的环四糖或糖组合物，其可由以下方法获得把所形成的培养物或可由该培养物获得的糖与选自下组的一种或多种酶接触α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶；并且利用选自下组的一种或多种纯化方法处理所产生的混合物脱色，脱盐，柱色谱分级分离，膜分离，微生物发酵以及碱处理。
30.权利要求16，18或24的环四糖或糖组合物，其中所说的α-异麦芽糖基转移酶具有下列物理化学性质(1)作用从具有至少为3的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖；(2)分子量当在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上测定时，具有约82,000到约136,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电聚焦电泳上测定时，具有约3.7到约8.3的等电点。(4)最适温度当在pH 6.0下温育30分钟时，具有约45℃到约50℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育30分钟时，具有约5.5到约6.5的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度的热稳定范围；(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有约3.6到约10.0的pH稳定范围。
31.一种产生具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖或者包含它的糖组合物的方法，其包括以下步骤将胶化和/或液化淀粉溶液与权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶和α-异麦芽糖基转移酶两者接触，其中所说的α-异麦芽糖基转移酶特异性地水解在α-异麦芽糖基葡糖基糖转移酶作用下形成的α-异麦芽糖基葡糖基糖的α-异麦芽糖基部分和其余葡糖基糖部分之间的连接键，并把释放的α-异麦芽糖基部分转移给受体。
32.权利要求31的方法，其中所说的胶化和/或液化淀粉溶液具有不高于20的DE(葡萄糖当量)。
33.权利要求31或32的方法，其中所说的胶化和/或液化淀粉溶液与权利要求1至7之任一项的α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，α-异麦芽糖基转移酶，和环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，以及可有可无的一种或多种选自下组的酶接触α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡糖淀粉酶以及α-葡萄糖苷酶。
34.权利要求31，32或33的方法，其进一步包括选自下组一种或多种纯化方法脱色，脱盐，柱色谱分级分离，膜分离，微生物发酵处理以及碱处理分解。
35.权利要求31至34之任一项的方法，其含有基于干固体的至少30％(w/w)具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖。
36.权利要求31至35之任一项的方法，其中所说的环四糖或所说的包含它的糖组合物是糖浆，糖膏，无定形粉末，无定形固体，晶体粉末，或晶体固体形式的。
37.权利要求36的方法，其中所说的晶体是通过在水溶液中结晶制备的，不使用任何有机溶剂。
38.权利要求31或33的方法，其中所说的α-异麦芽糖基转移酶具有下列物理化学性质(1)作用从具有至少为3的葡糖聚合度、并且具有作为非还原端连接键的α-1，6糖苷键和作为非还原端连接键以外的连接键的α-1，4糖苷键两者的糖形成具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环四糖；(2)分子量当在十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上测定时，具有约82,000到约136,000道尔顿的分子量；(3)等电点(pI)当用两性电解质在等电聚焦电泳上测定时，具有约3.7到约8.3的等电点。(4)最适温度当在pH 6.0下温育30分钟时，具有约45℃到约50℃的最适温度；(5)最适pH当在35℃温育30分钟时，具有约5.5到约6.5的最适pH；(6)热稳定性当在pH 6.0下温育60分钟时，具有约45℃或更低温度的热稳定范围；(7)pH稳定性当在4℃温育24小时时，具有约3.6到约10.0的pH稳定范围。
39.包含权利要求16至30之任一项的环四糖或者包含它的糖组合物的组合物，所说的环四糖具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构。
40.权利要求39的组合物，其中所说的环四糖或所说的包含它的糖组合物用作具有下列一种或多种性质的糖甜味性，实质性的非发酵性，低生龋性，低热值，渗透压可控性，赋形能力，赋予光泽的能力，保温能力，赋予粘性的能力，防止脱水收缩的能力，防止凝固的能力，包含能力，保持风味的能力，稳定性，防止其它糖结晶的能力，防止淀粉老化的能力，防止蛋白质变性的能力，防止脂质变质的能力，酸耐受性，耐热性以及很少引起氨基羰基反应的能力；或者直接用于以下一个或多个用途甜味剂，低生龋食品材料，低热量食品材料，味道改良剂，风味改良剂，品质改良剂，防止脱水收缩剂，稳定剂，防止脱色剂，赋形剂，包含剂以及粉碎材料。
41.权利要求39或40的组合物，其是食品，化妆品或药物形式的。
42.权利要求39或40的组合物，其包含基于干固体的至少0.1％(w/w)的环四糖。
全文摘要
本发明提供α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，由该酶获得的环四糖，含有该环四糖的糖，及其用途，其中所述酶能从葡糖聚合度至少为2、并具有作为非还原端连接键的α－糖苷键的糖转移α－葡糖基，而实质上不增加还原力，由此形成葡糖聚合度至少为3、并具有作为非还原端连接键的α－1，6糖苷键和作为非还原端以外连接键的α－1，4糖苷键的糖。
文档编号A61Q11/00GK1392900SQ01802974
公开日2003年1月22日 申请日期2001年7月25日 优先权日2000年8月1日
发明者久保田伦夫, 津崎桂二, 东山隆信, 福田惠温, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原生物化学研究所