专利名称：一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。
背景技术：
利用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase，CGTase)可将来源丰富、价格低廉的淀粉类物质转化成β-环糊精(β-CD)。β-CD及其衍生物做为添加剂或包埋材料在食品、医药、农药及环保领域用途广泛且具有无毒副作用、包埋用量大的特点。我国β-CD的生产虽有20多年的历史，但由于生产菌种酶产量不高及β-CD生产成本过高而导致其应用受到限制，因此，选育CGTase高产菌是我国酶制剂研究的一项重要任务。优良的菌种是提高CGTase活力的关键，而适宜的生产方法和培养条件是发挥优良菌种性能、获得高产酶量的保证。环糊精葡萄糖基转移酶可由嗜碱芽孢杆菌发酵生产，但目前微生物发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的产量不高，且发酵时间较长。
离子注入诱变育种是近年来兴起的一种新型诱变育种方法，已在农作物及工业微生物菌种的诱变育种领域取得丰硕成果(汪秀峰，吴敬德。离子注入改良水稻广亲和系02428[J]。安徽农业大学学报，1999，26(4)423-426；桑金隆，竺莉红，李孝辉。离子注入诱变选育之江菌素产生菌[J]。科技通报，2002，18(1)63-66)。注入离子对生物体的作用是集能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用(余增亮，霍裕平。离子注入生物学研究述评[J]。安徽农业大学学报，1994，21(3)221-225)。离子注入对生物细胞既存在着直接作用又存在着间接作用，注入离子的动量传递产生了对细胞的直接作用，其能量沉积显示着对细胞的间接作用。已有研究表明质量沉积作用能诱导注入的生物分子或细胞内生成新产物(邵春林，余增亮。低能离子辐照的刺激效应模型[J]。核技术，1996，19(6)321-325)。生物大分子中不乏氮元素，因此氮离子注入对生物体的诱变作用是多重性的，它与γ-射线或紫外线诱变有所不同，是损伤及修复同时进行的一种复合诱变。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。
本发明所提供的生产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)HA-1，已于2004年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1278。
该菌株的细胞呈杆状，直径小于1μM，孢囊膨大，中生或次端生芽孢，革兰氏染色阳性，菌落圆滑呈黄橙色，好氧，在pH值8.5-9.5条件下生长良好。
本发明所提供的生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，是由嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278发酵得到的。
其中，所述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的发酵培养基包括玉米粉或玉米淀粉1.5％-2.5％，蛋白质含量≥40％的玉米浆5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米浆为体积百分含量外，其余均为质量百分含量。所述玉米粉或玉米淀粉的质量百分含量优选为1.5％-2.0％，蛋白质含量≥40％的玉米浆的体积百分含量优选为5.0％-5.5％。
为了提高环糊精葡萄糖基转移酶的产量，所述发酵培养基还包括质量百分含量为0.2％的K2HPO4，质量百分含量为0.02％的MgSO4·7H2O。
所述发酵的起始pH为8.5-9.5，优选为8.6-9.2，可用Na2CO3调节。
所述嗜碱芽孢杆菌HA-1 CGMCC № 1278的培养温度可为27℃-29℃。
所述发酵的通气量可为0.8-1.2m3/m3/min，优选为1m3/m3/min。
本发明的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278产酶水平高、发酵时间短，且产酶具有传代稳定性，10L发酵罐中发酵24h产酶活力(酶产量)可达到6100U/ml(是原始出发菌株的2倍以上)；5000L发酵罐中发酵20.5h产酶活力可达到6875U/mL。本发明的方法及其专用菌株将在环糊精葡萄糖基转移酶的生产中发挥重要作用，具有广阔的工业应用前景。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法；所提到的百分含量如无特别说明均为质量百分含量。
实施例1、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的获得培养基平板分离及斜面培养基(％)可溶性淀粉2％；聚蛋白胨0.5％；酵母浸膏0.5％；K2HPO40.1％；MgSO4·7H2O0.02％；琼脂3％；灭菌后加入无菌Na2CO3调pH至8.5-9.5。
发酵培养基2.5％玉米粉；5％(V/V)玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自新乡淀粉厂)；0.1％K2HPO4；0.02％MgSO4·7H2O；灭菌后加入无菌Na2CO3调pH至8.5-9.5。
将固体培养基上生长36h的嗜碱芽孢杆菌C(购自郑州市医药科技开发中心)制成菌悬液，取0.1ml均匀涂布于灭菌的平皿，置于28℃培养箱中培养。挑单菌落于平面固体培养基上，待菌长出后，挑选相对菌小圈(淀粉水解圈)大的菌落制成菌悬液，取0.1ml均匀涂布于灭菌的平皿中心一薄层，无菌风干后立即进行诱变处理先进行γ-诱变(0.5Gy)，然后依次进行能量30kev剂量如下的氮离子注入诱变2×1015个氮离子/cm2、1×1015个氮离子/cm2、两轮5×1015个氮离子/cm2、2×1015个氮离子/cm2、1×1016个氮离子/cm2及5×1015个氮离子/cm2的氮离子注入诱变。注入后立即用无菌水洗脱菌斑，稀释(10-1-10-2)后涂皿，置于28℃培养箱中培养。挑单菌落于固体平板培养基上，待菌落长出后，视菌落周围透明圈(淀粉水解圈)的大小进行初筛，挑选相对菌小圈大的菌落接种于斜面，28℃培养1d后挖块接种于装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在200rpm摇床上发酵1-2d，测定发酵液酶活力，进行复筛。参照文献(张树政.酶制剂工业[M].北京科学出版社，1984.549)的方法测定酶活力，具体方法如下取10μl样品(对照不加样品)，加入0.2ml pH9.0的0.2M甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，0.2ml 0.2％马铃薯淀粉溶液(空白不加马铃薯淀粉溶液)，40℃反应10min后加入0.5ml 0.5M醋酸终止反应，加入3ml 0.005％碘液显色，在700nm处测定吸光值(A)，以吸光值下降10％的酶量为1个单位。
计算公式 结果表明嗜碱芽孢杆菌C经自然分离得到的产酶活性(酶产量)较高的0-4菌株38h的产酶活性为2500U/mL，然后对该菌株进行γ-诱变，得到的产酶活性较高的02-1-29菌株40h的产酶活性为3633U/mL；再对02-1-29菌株进行能量为30kev，剂量2×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-2-500菌株41h的产酶活性为7129U/mL；再对02-2-500菌株进行能量为30kev，剂量1×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-3-209菌株46h的产酶活性为4067U/mL；再对02-3-209菌株进行能量为30kev，剂量5×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-4-417菌株40h的产酶活性为6371U/mL；再对02-4-417菌株进行能量为30kev，剂量5×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-5-71菌株(24h的酶活性为2012U/mL，41h的产酶活性为5805U/mL)；再对02-5-71菌株进行能量为30kev，剂量2×1015个氮离子/cm2的离子诱变，对筛选得到的产酶活性较高的菌株再进行能量为30kev，剂量1×1016个氮离子/cm2的离子诱变，再对由该剂量筛选得到的产酶活性较高的菌株进行能量为30kev，剂量5×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到一株酶活性较高的菌株-HA-1菌株，其24h的酶活性为4185U/mL，其41h的酶活性为6500U/mL。以上均为摇瓶发酵结果。
对以上筛选得到的菌株结合遗传稳定性确定最佳菌株，02-2-500虽产酶活力较高，但此菌株传代不稳定，F2代产酶又下降至02-1-29水平。对此菌株继续进行氮离子注入诱变，得到02-3-209，此菌株产酶活力虽然不是同期最高者，但其29hr产酶2487U/ml，为同期复筛中最高者，故以此菌株作为出发株又进行一轮氮离子注入诱变，得到02-4-417，此菌株来自于5×1015个氮离子/cm2剂量诱变，40hr产酶活性6371U/ml为同期最高，但同样具有传代不稳定的特点，再次以此菌株作为出发株进行新一轮氮离子注入诱变，得到02-5-71，该菌株也来自于5×1015个氮离子/cm2剂量诱变，41hr产酶活性5805U/ml为同期最高。02-5-71菌株具有较好的传代稳定性，与F1代相比较，F2、F3、F4、F5代的产酶活性分别是F1代的96.66％、103.02％、99.11％、101.46％。为了得到发酵时间较短，且产酶活性较高的菌株，再对02-5-71菌株进行能量为30kev，剂量2×1015个氮离子/cm2的离子诱变、筛选，能量为30kev，剂量1×1016个氮离子/cm2的离子诱变、筛选，及能量为30kev，剂量5×1015个氮离子/cm2的离子诱变、筛选，得到一株产酶活性较高且发酵时间较短的菌株-HA-1菌株，其24h的产酶活性为4185U/mL，其41h的酶活性为6500U/mL。HA-1菌株具有较好的传代稳定性，与亲代相比较，F1、F2、F3、F4、F5代的产酶活性分别是亲代的108％、110％、98％、111％、107％。
实施例2、发酵条件的筛选应用正交实验法制成四因素三水平正交表L9(34)进行HA-1菌株和02-5-71菌株发酵条件的筛选表1 02-5-71菌株实验因素水平表 表2 02-5-71菌株一级发酵39h正交设计实验数据
表3 应用营养物不同比例搭配配方HA-1菌株发酵结果
以含有K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％的培养基中玉米粉、玉米浆百分含量及发酵的pH、温度为考察因素，各取3个水平(表1)，确定02-5-71菌株的适宜发酵条件。由斜面菌种直接接种于含30ml发酵培养基的250ml三角瓶中，02-5-71菌株200rpm一级发酵39h，以发酵液酶活力为考察指标，结果如表2所示，表明4个考察因素中发酵温度及培养基中玉米浆含量对发酵产酶影响较大。发酵液的酸碱度对菌种产酶影响较大，pH小于8或大于10产酶量均较低，为了进一步确定最佳pH，实验选择pH8.5-9.5作为正交实验的其中一因素三水平，结果表明，pH在8.5、9、9.5三个水平虽然极差最小，但发现02-5-71菌株pH为9时产酶较高，经正交法筛选的02-5-71菌株的适宜发酵条件为玉米粉2％，玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自新乡淀粉厂)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，初始pH9，培养温度28℃；在此发酵液配方的基础上进一步优化HA-1菌株的适宜发酵配方，摇瓶发酵结果如表3所示，表明HA-1菌株的适宜发酵配方为玉米粉1.5％-2.5％，玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40，购自新乡淀粉厂)5.0％-6.5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，灭菌后用无菌的Na2CO3调初始pH为8.6-9.0。以上除玉米浆为体积百分含量外，其余均为质量百分含量。培养温度27℃-29℃。
应用HA-1菌株的适宜发酵培养基配方玉米粉2.0％，玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自新乡淀粉厂)5.0％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％)在种龄为23-26h、接种量8％、初始pH8.9-9.0、培养温度27-29℃、装罐量75％、通气量(每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液体积的比值)为1m3/m3/min的发酵条件下，于10L发酵罐中发酵24小时，0-4菌株、02-5-71菌株与HA-1菌株产酶活力分别为2600U/ml发酵液、3573U/ml发酵液和6100U/ml发酵液。
在培养基中添加无机盐的研究表明添加K2HPO4(0.2％)和MgSO4·7H2O(0.02％)对发酵产酶有利，不加此两种无机盐或添加其它无机盐将导致酶大幅度减产或不产酶。因此这两种无机盐在菌种发酵产酶中非常关键。
实施例3、利用嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278生产环糊精葡萄糖基转移酶将嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278菌种接入300L种子罐(培养基为玉米粉2％，玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自孟州金玉米有限公司)5％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，灭菌后加入无菌的Na2CO3溶液将培养基的pH调到8.6))，27-29℃培养24h后以5％的接种量接入5000L发酵罐(培养基玉米粉2.3％，玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自孟州金玉米有限公司)5.6％，K2HPO40.2％和MgSO4·7H2O 0.02％，灭菌后加入无菌的Na2CO3溶液将培养基的pH调到8.8)中，通气量(每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液体积的比值)为1m3/m3/min，27-29℃培养，结果表明在5000L发酵罐中发酵20.5h产酶活力就可达到6875U/mL。
权利要求
1.嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278。
2.一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，是由嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278发酵得到的。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的发酵培养基包括玉米粉或淀粉1.5％-2.5％，蛋白质含量≥40％的玉米浆5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米浆为体积百分含量外，其余均为质量百分含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中玉米粉或玉米淀粉的质量百分含量为1.5％-2.0％，蛋白质含量≥40％的玉米浆的体积百分含量为5.0％-5.5％。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基还包括质量百分含量为0.2％的K2HPO4，质量百分含量为0.02％的MgSO4·7H2O。
6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基起始pH为8.5-9.5。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵培养基起始pH为8.6-9.2。
8.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的培养温度为27℃-29℃。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述发酵的通气量为0.8-1.2m3/m3/min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述发酵的通气量为1m3/m3/min。
全文摘要
本发明公开了一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。本发明所提供的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC № 1278可用于发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶。嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA－1 CGMCC №1278产酶水平高、发酵时间短，且产酶具有传代稳定性，10L发酵罐中发酵24h产酶活力(酶产量)可达到6100U/ml；5000L发酵罐中发酵20.5h产酶活力就可达到6875U/ml。本发明的方法及其专用菌株将在环糊精葡萄糖基转移酶的生产中发挥重要作用，具有广阔的工业应用前景。
文档编号C12P21/02GK1796541SQ200410102569
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月27日 优先权日2004年12月27日
发明者王雁萍, 秦广雍, 段宇珩, 许平辉, 陈林海, 李宗伟, 苏明杰, 谈重芳, 李宗义, 霍裕平 申请人:郑州大学