由海洋微生物菌株Y112制备α-环糊精葡萄糖基转移酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及海洋微生物领域，特别是涉及一种由海洋微生物菌株Y112制备a-环 糊精葡萄糖基转移酶的方法。
【背景技术】
[0002] 环糊精（cyclodextrin，缩写CD)是由a-1，4-糖苷键相连而成的，环状的，无还原 端的麦芽低聚糖。环糊精通常由6、7或8个葡萄糖残基组成，分别被称为a-、|3-、或y-环 糊精。除了这三种常用的环糊精外，还有S-、e-、G-和n-环糊精（分别由9~12个葡 萄糖单元组成）。环糊精具有能够将多种化学物质全部或部分封装入空腔内的能力，从而 改变了这些化合物的物理和化学性质。环糊精是由环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase)作用 于淀粉转化而成，主要产物为a-、0-、y-环糊精。由于环糊精分离提纯工艺非常复杂， 因此寻找能催化产生特定环糊精的CGTase的产生菌非常重要。目前，研究报道主要集中在 0 -CGTase产生菌株上，而有关a-、y-CGTase产生菌的研究报道却很少。几乎很少有主 要产a-或y-环糊精的CGTase报道。枯草芽孢杆菌BacillussubtilisNo. 313、嗜碱 芽抱杆菌Bacillusstrain290-3、芽抱杆菌Bacillussp.AL-6 和短杆菌Brevibacterium sp.No9605是目前已知的产y-CGTase的菌株。
[0003]目前环糊精的制备主要是采用酶法合成的，化学合成法并不常用，而酶法制备会 产生多种环糊精的混合物，不利于单一环糊精的分离纯化，这极大限制了环糊精的应用。因 此，成为当今世界开发寻求一种能够生产特定单一环糊精的CGTase的生产菌，降低环糊精 分离纯化成本所关注的焦点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术酶法产生多种环糊精的混合物的不足，经发明 人长期开发研究海洋微生物及其酶产物和生产实践，开发提供一种新的由海洋微生物菌 株Yl12制备a-环糊精葡萄糖基转移酶的方法。
[0005] 本发明提供一种新的a_环糊精葡萄糖基转移酶的方法，包括下列步骤：
[0006] 1、由海洋微生物菌株Yl12制备粗酶液
[0007] 在三角瓶中装种子培养基液30mL接种海洋微生物菌株Y112后，30°C、200r/min下 活化22h，以4% (V/V)的接种量接种至装有25mL发酵培养基的三角瓶中，27°C、230r/min 培养50h，收集发酵液在1000 Og的离心力条件下离心15min，上清为粗酶液。
[0008] 所述种子培养基的组成：每升培养基含可溶性淀粉10g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g， K2HPO4Ig,MgSO4?7H200?15g，NaCl50g，121。。灭菌 20min〇 所述发酵培养基的组成：每升 培养基含玉米淀粉l〇g，蛋白胨5g，酵母浸粉5g，K2HPO4lg，MgSO4?7H200?15g，NaCl50g， 121°C灭菌 20min。
[0009] 本发明中酶活的测定采用甲基橙褪色法。该酶活单位定义为上述条件下生成 Iyga-环糊精所需的酶量。
[0010] 生物量的测定：采用比浊法测定生物量。
[0011] 蛋白含量的测定；蛋白浓度的测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋 白。
[0012] 2、乙醇分级沉淀
[0013] 一级沉淀：向步骤1的粗酶液中徐徐加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数为 20% - 40%，优选为40%，静置，离心取上清液，上清液的酶比活力最高，纯化倍数为1. 25， 回收率为95. 5%。
[0014] 二级沉淀：向一级沉淀得上清液中继续加入无水乙醇，使乙醇的最终体积分数为 40% -55%，优选为40% -50%，静置，离心，待沉淀风干后用磷酸缓冲液溶解成溶液，纯化 倍数为3. 42,酶活回收率为90. 1 %。
[0015] 3、凝胶层析
[0016]先用pH7. 2磷酸钠缓冲液平衡Superdex200分子筛层析柱（如2. 6X60cm)，将步 骤2得到的酶液上样，然后用相同缓冲液进行洗脱，流速为2mL/min，得到若干洗脱峰，其中 只有主峰有活性，对其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。
[0017] 4、DEAE-Sepharose离子交换层析
[0018] 先用pH7. 2磷酸钠缓冲液平衡DEAE-S印harose离子交换层析柱（如 I. 6XIOcm)，将步骤3得到的酶液上样，然后用含0~lmol/L的相同缓冲液进行线性梯度 洗脱，流速为2mL/min，得到三个洗脱峰，其中穿透峰较小无活性，仅第二洗脱峰有活性，对 其进行收集浓缩，测定总酶活力及总蛋白含量。
[0019] SDS-PAGE电泳
[0020] SDS-PAGE电泳采用10%分离胶和5%浓缩胶，控制恒定电压160V。对纯化过程中 的样品进行适当浓缩，选用10%的分离胶进行SDS-PAGE，结果显示呈现单一的条带，说明 本发明由海洋微生物菌株Yl12制备a-环糊精葡萄糖基转移酶方法得到的a-环糊精葡 萄糖基转移酶产品单一纯度高。
[0021] 本发明由海洋微生物菌株Y112制备a-环糊精葡萄糖基转移酶结果列于下表
[0022]
[0023] 本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备a-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法中，由菌株Y112制备a-环糊精葡萄糖基转移酶得到的a-环糊精葡萄糖基转移酶 产品单一纯度高，纯度提高了 12. 4倍，回收率为57. 5%。
[0024] 本发明提供一种新的由海洋微生物菌株Y112制备a-环糊精葡萄糖基转移酶的 方法中，所述产a-环糊精葡萄糖基转移酶的海洋微生物菌株Y112来自黄海海域的一株 产a-CGTase的海洋微生物菌株Y112,其16SrDNA序列长度约1420bp左右。经过16S rDNA序列分析结合其生理生化特征，该菌株被鉴定为芽孢杆菌属（Bacillussp.)。该产a-CGTase的海洋微生物菌株Y112于2015年7月13日保藏于中国武汉中国典型培养物保 藏中心（简称CCTCC)，保藏号为CCTCCNO:M2015447。
[0025] 海洋微生物菌株Yl12的形态和生理生化特征：
[0026] 菌株Yl12的形态特征：
[0027] 菌株Y112为不规则短杆状，革兰氏阳性，菌落在琼脂培养基上呈现圆形，乳白色， 表面平坦、边缘不整齐。
[0028] 菌株Yl12生理生化特征：
[0029] 菌株Y112能在pH8. 0-11.0的条件下生长，最适生长pH为10 ;生长的温度范围为 10-45°C，最适生长温度33°C;最高能耐受16wt%的NaCl，在含有5%WtNaCl条件下生长量 最高