高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用微生物菌株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农作物病害防治领域，特别是一种高效防控西瓜枯萎病的方法及其专 用菌株。
【背景技术】
[0002] 西瓜是一种深受人们欢迎的水果，随着社会需求量的增加，西瓜的种植面积也不 断扩大，而西瓜枯萎病的发生也越来越普遍而严重，成为世界范围内毁灭性的土传真菌病 害，该病害的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum F0N)，病 原菌以菌丝、分生孢子、厚垣孢子和菌核能够在土壤或未腐熟的带菌肥料、病残株、种子和 土壤中越冬，在离开寄主的情况下也能存活5 - 6年，少部分病菌甚至可以存活10年以上， 一般分布在〇-25cm 土层内，是来年发病的初侵染源，已成为导致西瓜减产的主要因素。目 前，防控西瓜枯萎病的方法主要有化学药剂防控、生物防控、选育抗病品种及农业措施等， 虽然这些方法都不断取得进步与发展，也有不少成功的试验报道，但在生产层面、大面积推 广应用上，至今仍缺乏简便、经济可行和防效稳定的防控措施。
[0003] 土壤调控是指运用物理、化学和生物学的方法改良土壤、杀灭或抑制土传病原菌， 有效改善土壤理化、养分和生物学性状，改善作物生长环境进而达到防控土传病害的目的， 是目前有效防控土传病害的重要手段。常用的土壤调控方法主要有土壤消毒、生物熏蒸、 施用有机物料等.土壤消毒是一种通过杀灭或抑制土壤中有害生物进而达到防控土传病 害的方法，其中以化学熏蒸剂棉隆使用最为广泛。棉隆（dazomet),又名必速灭，二甲噻二 嗪，是一种安全、高效、无残留的新型化学消毒剂，其遇水分解生成异硫氰酸甲酯气体，可迅 速扩散至物料中，杀灭各种病原物和杂草种子，其可有效杀灭枯萎病菌、根腐病菌、立枯丝 核病菌、菌核病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、早晚疫病菌、黄萎病菌、根结线虫和常见杂草种子 等多种有害生物(但对环境中大部分细菌没有抑制作用）。已有报道显示，目前将棉隆用于 土壤消毒的方法均是将棉隆均匀撒施在整块土壤上，然后耕耘、浇水、覆膜保持一定时间进 行土壤消毒，棉隆和塑料薄膜的用量均较大，消毒成本高，不利于大面积推广应用。
[0004] 现有文献表明，土壤消毒虽然可以显著降低土壤中病原菌数量，但由于土壤状况 的复杂性，在田间状态下，任何土壤消毒方法都很难完全消除病原菌；而如果在土壤消毒结 束时短暂的"微生物真空期"（真菌数量极少）立即添加能抑制病原菌生长且在土壤和作物 根际有较强竞争优势和良好定殖能力的有益微生物，将会在土壤和作物根际继续营造不利 于病原菌生存的环境以达到持续控制病害的效果。"棉隆与粉红螺旋聚孢霉67-1协同防治 黄瓜枯萎病的研宄"（田甜等，中国生物防止学报，2014)公开了一种化学熏蒸联合生防菌 剂防控黄瓜枯萎病的方法，其在化学消毒后的微生物真空期内，引入生防菌67-1定植，取 得了较好的黄瓜枯萎病防控效果，然而该方法需将土壤全部统一熏蒸，工作量大；西瓜的种 植密度显著不同于黄瓜，因此，基于西瓜实际的田间种植方式，发明一种适宜的土壤消毒方 法，对防控西瓜土传枯萎病具有重大的生产指导意义；目前未见到将土壤局部土壤消毒后 再施用微生物菌剂防控西瓜土传枯萎病的相关报道。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，提供一种棉隆用量少、覆膜少、操作简便的土壤消毒方法及其专用 微生物菌株，应用于防控西瓜枯萎病，本发明是这样实现的： 一种高效防控西瓜枯萎病的方法，具体步骤如下： (a) 清除前茬作物残体，土壤旋耕20-25cm，施入有机肥和化肥，土壤温度在15°C以上 时，然后以西瓜栽植行为中心、幅宽ll〇cm，按施入量45-50g/m 2均匀撒施棉隆，再将土壤旋 耕20-25cm，调整土壤含水率为20-30% ; (b) 以西瓜栽植行为中心覆盖塑料薄膜，覆盖土壤宽度为100cm，塑料薄膜边缘均埋入 土壤，埋入深度为30cm，消毒12-20d ; (c) 消毒结束后，沿栽植行中部剪开塑料薄膜并揭至两边，通风3-4d ;以45-60g/m2的 施入量均匀撒施木霉固体菌剂，然后旋耕土壤，栽植西瓜苗，最后将塑料薄膜覆盖在西瓜苗 周围； 所述木霉固体菌剂中木霉菌的含量不低于lxl〇9cfu/g。
[0006] 进一步，本发明中，所述的棉隆为50%可湿性粉剂或98-100%微粒剂。
[0007] 进一步，本发明中，所述的塑料薄膜厚度不低于0. 4_。
[0008] 进一步，本发明中所述木霉固体菌剂是这样获得的：将木霉孢子接种到PDA培养 基中活化，28±2°C培养3-5d ;然后将活化后的菌种接种至PDB培养基中，28±2°C，160r/ min摇床培养3-4d ;再将菌种接种至固体培养基中，28±2°C培养6-8d，最后自然风干或 30°C烘干至水分小于10%，即获得木霉固体菌剂，其中木霉菌含量为10 1(H11cfU/g ;所述固体 培养基是由麸皮和稻草粉按质量比为4 :6混合后，调整水分含量为60-65%获得。
[0009] 进一步，本发明所述木霉菌为保藏号为CGMCC No. 9293的绿色木霉（斤 viride^o
[0010] 本发明中，施入的化肥和有机肥均为常规用量，一般有机肥使用为600-800kg/ 亩，化肥用量为50-60kg/亩。
[0011] 西瓜的种植行距一般在17〇-18〇Cm，而依据现有文献记载西瓜整个生育期根系最 大覆盖宽度约100厘米，因此，将西瓜根系周围100厘米的宽度范围的土壤进行消毒，同时 将该部分土壤与未消毒区土壤进行隔离，防止未消毒区土壤中病原菌迀移到消毒土壤中， 不但极大减少棉隆的用量，而且覆盖所需的塑料薄膜也随着减少，操作更为便捷。
[0012] 绿色木霉菌生长速度快、生物量大，具有较强的生态竞争能力、对许多植物病原真 菌的生长抑制作用以及对作物生长的促进作用，已被国内外作为一种重要的防病微生物商 业化生产，并在农业生产上广泛应用。本申请所使用的保藏号为CGMCC No. 9293的绿色木 霉菌，是由江苏省农科院从土壤中筛选到的，该菌对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制效果 且在西瓜根际有良好定殖能力，将该绿色木霉施用于棉隆消毒后的土壤中，抑制病原菌的 生长和侵染，增强对西瓜枯萎病的防控效果。
[0013] 与现有技术相比，本发明采用新型环保、无残留、已被广泛接受的化学熏蒸剂棉隆 对土壤进行消毒处理，最大程度杀灭或降低土壤中病原菌数量；其次，通过对以西瓜栽植行 为中心的局部范围内的土壤进行消毒，可以将棉隆和塑料薄膜用量降低40-60%，减少消毒 剂和薄膜对环境资源的污染；其三，覆盖用的塑料薄膜深埋(深入土壤30cm，而病菌通常分 布在土壤表层0-25cm范围内)到100厘米宽的土壤四周，消毒结束后并不移走，而是起到物 理隔离作用，阻止未消毒区土壤中的病原菌迀移到消毒区土壤中，在西瓜整个生长季节还 可以起到地膜的作用，节省地膜用量；最后，施用的保藏号为CGMCC No. 9293的绿色木霉菌 在土壤中繁殖速度快且对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制作用，可以达到持续抑制病原菌 数量增加、增强病害防控效果的目的；整个防控施用过程易于操作，为西瓜枯萎病及其他土 传病害防控开辟新的途径和提供新的思路。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例不同棉隆用量对西瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌）的生长抑制效果示意 图； 图2为实施例绿色木霉TV41对西瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌）的生长抑制效果示意图。
【具体实施方式】
[0015] 实施例中涉及的培养基： PDA培养基：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，琼脂10克，水500毫升，pH自然。马 铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热煮沸至琼脂溶化， 补足体积至500毫升，冷却备用； PDA平板：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，琼脂10克，水500毫升，pH自然。马铃 薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热煮沸至琼脂溶化，补 足体积至500毫升，平均分装到2个1000毫升三角瓶中，121 °C高压灭菌15min，高压锅取出 后冷却到50°C左右在超净工作台中倒入直径9厘米的无菌培养皿中，每个培养皿倒20毫 升，待培养基冷却后备用； PDB培养基：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，水500毫升，pH自然。马铃薯去皮，切 成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加入葡萄糖，加热煮沸，补足体积至500毫升，适 当冷却后分装到三角瓶中，装液量为80 ml /250 ml三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121°C高压 灭菌15min，冷却后备用； 水琼脂平板：在蒸馏水中加入1%的琼脂粉或者琼脂条，121°C高压灭菌15min，取出后 冷却至55°C左右，在超净工作台中倒入直径为9厘米的无菌培养皿，制备成水琼脂平板备 用； 固体培养基：麸皮：稻草粉质量配比为4 :6 ;在本实施例中，取麸皮4kg，稻草粉6kg均 匀搅拌，加水调整培养基水分含量为60-65%，121°C高压灭菌40min，间隔24小时后在同样 条件重新灭菌一次，冷却后备用； 西瓜枯萎病菌(尖孢镰刀菌）选择性培养基：所用选择性培养基参照Komada H的方法， 其具体配制方法为：将 1.0 g K2HP04、0.5 g MgS04.7H20、0.5 g KCl、0.01gFe-Na-EDTA、 2.0g L-天门冬酰胺（L-asparagine)、20gD_ 半乳糖（D-galactose)溶于约 300ml 水中，定 容至1000ml，加入20g琼脂装瓶灭菌。等培养基冷却至60°C以下，迅速加入1.0 g五氯硝基