苯（每1000 ml培养基加入量，下同）、0· 5g牛胆汁、Ig Na2B407. 10H20、0. 3g硫酸链霉素，再 用10%磷酸将pH调至3. 8-4. 0,然后倒平板备用； 实施例中涉及的试剂、菌种： 棉隆：购买于南通施壮化工有限公司，剂型为98-100%的微粒剂； 西瓜枯萎病菌（/karia? 腫5/7.:由中科院微生物菌种保藏中 心提供； 绿色木霉IV41 :由江苏省农业科学院自行筛选获得，该菌株于2014年6月12日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮政编码：100101，保藏号为CGMCC No. 9293〇
[0016] 实施例1棉隆对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用测试 将西瓜枯萎病菌接种到PDA平板中，28-30°C培养5天后用打孔器打孔获得直径5毫米 的菌丝块备用。
[0017] 在PDA平板培养基中间接种直径为5 mm的菌丝块，往培养皿皿盖中央分别加入 0、0. 2、0. 4、0. 6、l、2、6、10mg/L的棉隆，与无菌水以质量比1:1快速混合，每处理3个重复， 同时设立对照组(不加棉隆）；然后将接种了菌丝块的那一半培养皿倒扣在培养皿盖子上， 用封口膜密封，28°C恒温培养，72h后培养结果如图1所示，测量病原菌的菌落直径，计算棉 隆对菌丝生长的抑制率： 抑制率（％) = [(对照菌落增长直径-处理菌落增长直径）/(对照菌落增长直径 )]X 100%〇
[0018] 图1中，A为没有棉隆的对照，B-F表示棉隆用量依次为0. 01克，0. 015克，0. 02 克，0. 025克，0. 03克；由图1可见，棉隆分解产物对枯萎病菌菌丝生长具有显著的抑制作 用，且随着棉隆用量的增加，抑制作用增强，当棉隆用量为0. 025-0. 03克时，对菌丝生长的 抑制作用达到95%以上。
[0019] 实施例2绿色木霉IV41对西瓜枯萎病菌的生长抑制测试 试验方法：将绿色木霉IV41孢子和西瓜枯萎病菌分别单独接种到PDA平板上，30°C恒 温培养3天后，获得每个菌株的新鲜菌丝块(直径5毫米)，再将绿色木霉与西瓜枯萎病菌菌 丝块接种到同一个PDA平板中（每个平板接种1个绿色木霉菌丝块及1个西瓜枯萎病菌菌 丝块)，两个菌丝块之间相距5厘米，置于30°C恒温箱中培养观察，如图2所示，其中，A为 单独接种的西瓜枯萎病菌；B为同时接种绿色木霉IV41和西瓜枯萎病菌时西瓜枯萎病菌的 生长情况，B培养皿中上部为西瓜枯萎病菌，下部为绿色木霉IV41 ;由图2可见，绿色木霉 IV41对西瓜枯萎病菌有比较明显的生长抑制作用，绿色木霉主要是通过重寄生作用抑制或 杀灭病原菌，即通过分泌多种复合抗菌物质或者能降解病原菌细胞壁的多种酶达到抑制靶 标病原菌生长的效果。
[0020] 实施例3制备绿色木霉IV41固体菌剂 a)菌种的活化 采用试管斜面保藏菌种的活化方法： PDA斜面培养基：向试管中装入5mlPDA培养基，121°C高压灭菌15min，然后摆斜面，斜 面高度不超过试管高度的1/3 ; 将绿色木霉IV41孢子接种到上述PDA斜面培养基中活化，在28±2°C的环境中培养 3-5天，形成菌丝块，以打孔器打孔5mm菌丝块备用。
[0021] b)液体培养 取一个容量为IL的三角瓶，加入250mlPDB培养基，然后加入三块直径5mm的菌块， 将三角瓶置于摇床，摇床的转速160r/min，于28±2°C的环境中培养3-4天后备用； c)固体培养 将液体培养好的250ml绿色木霉IV41培养物接入5kg固体培养基中，即接种量为1:20 (ml/g)，再将固体培养基平铺在浅盘中（浅盘经福尔马林溶液浸泡过夜晾干后使用)，厚度 5-7cm，上面盖上双层经高压灭菌处理的纱布，在28±2°C环境中培养6-8天，每隔2-3天 翻拌一次，同时适当补加无菌水，培养至产孢；最后自然风干或30°C烘干至水分含量小于 10%，即为绿色木霉Tv41固体菌剂，其中绿色木霉Tv41含量为10 1(H11cfu/g菌剂。
[0022] 以上所有接种操作必须在无菌条件下，即在超净工作台的酒精灯旁或经紫外线灭 菌处理1-2小时的房间，固体培养的房间也需事先用紫外线灭菌处理3-5小时。
[0023] 实施例4大棚防控西瓜枯萎病实验 实验在淮安市西瓜连作大棚进行，该大棚连作西瓜多年，枯萎病发生严重。大棚面积为 8米(宽）*40米(长），栽种3行西瓜，实验分三组： 1.对照组：不做任何处理；2.棉隆对照组：棉隆熏蒸；3.实验组：棉隆熏蒸+木霉菌 剂；每处理测1个小区，每组重复三次，每小区面积22平方米(宽2. 2米，长10米)。
[0024] 试验操作如下：在土壤温度高于15°C时，将大棚中前茬作物残体清除干净，每小 区撒施20公斤商品有机肥和2公斤NPK复合肥（15-15-15)，将土壤旋耕20-25厘米深，在 每个小区中间划出1米(宽)*1〇米面积，棉隆对照组和实验组均匀撒施〇. 99公斤棉隆(对照 组不撒施)，再将土壤旋耕，迅速浇水至土壤20厘米耕层内水分含量为30-35%，覆盖厚度不 低于0. 4毫米的塑料薄膜，并且塑料薄膜边缘埋入深度不低于30厘米，覆膜保持15天后， 将塑料薄膜从中间剪开后揭开晾置土壤3-4天，每个小区按照S型取土方法采集土样，采用 选择性培养基对进行西瓜枯萎病菌计数；对照组均匀撒入实施例3获得的绿色木霉IV41固 体菌剂，施入量为45-50g/m 2 (对照组和棉隆对照组不施入)，然后每个小区移栽西瓜苗30 棵，在西瓜收获时调查西瓜发病率和产量，结果如表1、表2所示： 表1大棚条件下不同处理土壤中尖孢镰刀菌的数量
由表1可见，土壤处理15天后，棉隆对照组和实验组中病原菌数量在500-900个CFU/ 克土壤，而对照组土壤中病原菌数量为80000- 90000CFU/克土壤，表明在大田条件下，棉 隆可以几乎100%杀灭土壤中病原菌。
[0025] 表2大棚条件下不同处理的西瓜枯萎病发病率和西瓜产量
由表2可见，西瓜收获时，对照中发病率为80%，而棉隆熏蒸处理中发病率为53. 5%，比 对照降低26. 7%，而棉隆熏蒸后再施用木霉菌剂的处理，发病率显著低于对照和单独棉隆熏 蒸处理，仅为10% ;另外，在西瓜产量上，三个处理也有显著差别，熏蒸后再施用木霉的处理 产量是对照的近7倍，是单独棉隆熏蒸处理的2倍多，可见，棉隆熏蒸后配施木霉菌剂可以 显著减少发病率，增加西瓜产量。
【主权项】
1. 一种高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，具体步骤如下： (a) 清除前茬作物残体，土壤旋耕20-25cm，施入有机肥和化肥，土壤温度在15°C以上 时，然后以西瓜栽植行为中心，幅宽110cm，45-50g/m 2的施入量均匀撒施棉隆，再将土壤旋 耕20-25cm，调整土壤含水率为20-30% ; (b) 以西瓜栽植行为中心覆盖塑料薄膜，覆盖土壤宽度为100cm，塑料薄膜边缘均埋入 土壤，埋入深度为30cm，消毒12-20d ; (c) 消毒结束后，沿栽植行中部剪开塑料薄膜并揭至两边，通风3-4d ;以45-60g/m2的 施入量均匀撒施木霉固体菌剂，然后旋耕土壤，栽植西瓜苗，最后将塑料薄膜覆盖在西瓜苗 周围； 所述木霉固体菌剂中木霉菌的含量不低于lxl〇9cfu/g。2. 根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述的棉隆为50%可 湿性粉剂或98-100%微粒剂。3. 根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述的塑料薄膜厚 度不低于〇. 4mm。4. 根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述木霉固体菌剂 是这样获得的：将木霉孢子接种到PDA培养基中活化，28±2°C培养3-5d ;然后将活化后的 菌种接种至PDB培养基中，28±2°C，160r/min摇床培养3-4d ;再将菌种接种至固体培养基 中，28 ±2°C培养6-8d，最后自然风干或30°C烘干至水分小于10%，即获得木霉固体菌剂，其 中木霉菌含量为l〇1(H11cfu/g ; 所述固体培养基是由麸皮和稻草粉按质量比为4 :6混合后，调整水分含量为60-65%获 得。5. -种用于权利要求1-4任一所述高效防控西瓜枯萎病方法的木霉菌，其特征在于， 所述木霉菌为保藏号为CGMCC No. 9293的绿色木霉（fricAoofe/ma ririofe)。
【专利摘要】本发明公开一种高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用微生物菌株，该方法为：清除土壤中前茬作物残体，旋耕后施入有机肥和化肥，然后撒施棉隆，调整土壤含水率，再以西瓜栽植行为中心覆盖塑料薄膜，薄膜边缘均埋入土壤，消毒后12-20d后剪开塑料薄膜并揭至两边，通风3-4d，再均匀撒施木霉固体菌剂，栽植西瓜苗，将塑料薄膜覆盖在西瓜苗周围；所述木霉固体菌剂是由保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉制备的；本发明既减少棉隆消毒剂和塑料薄膜的使用对环境造成的污染，且对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制作用，可以达到持续抑制病原菌数量增加、增强病害防控效果的目的。CGMCC No. 929320140612
【IPC分类】A01G1/00, A01G13/00, C12N1/14, C12R1/885
【公开号】CN104982198
【申请号】CN201510361863
【发明人】马艳, 王秋君, 王光飞, 郭德杰
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月26日