一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其具体步骤如下所示：首先以外加氯化铵的海水为培养基，进行葡萄球菌WX2701低温厌氧发酵；对获得的发酵液进行无菌过滤，并依次向获得的滤液中加入无色杆菌WX1501和长链脂肪烃(C20?40)单体或混合物进行发酵；从发酵液中分离得到具有高表面活性的环脂肽表面活性；本发明采用两步微生物全合成脂肽表面活性剂，有效避免了微生物菌株之间的相互竞争和极大地减少了代谢产物抑制作用，使得脂肽表面活性剂产量达到了38.7g/L,大大高于单菌发酵生产表面活性剂的产量，有望实现脂肽表面活性剂的产业化。
【专利说明】
一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种生物合成方法，尤其是一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法。 【背景技术】
[0002]现有微生物来源的环脂肽类表面活性剂主要来源于单一微生物菌株的发酵生产。 虽然通过氮源等发酵条件优化可提升脂肽表面活性剂的产量，但由于脂肽类表面活性剂在微生物体内合成步骤多，且受到严格调控，导致单一菌株发酵培养条件要求高、产量低 l〇g/L)，极大地增加了生产成本，在价格上很难取代化学表面活性剂，大规模的推广应用受至IJ限制。
【发明内容】
[0003]为解决以上技术难题，本发明公开了一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其具体步骤如下所示:
[0004](1)以外加氯化铵的海水为培养基，进行葡萄球菌WX2701低温厌氧发酵，按10 % (v/v)的接种量，将葡萄球菌WX2701的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)接入发酵培养基;采用SKY-200B型全温摇床，于10 °C和150rpm的条件下培养48h;
[0005](2)对获得的发酵液进行无菌过滤，并依次向获得的滤液中加入无色杆菌WX1501 和长链脂肪烃(C2Q-4Q)单体或混合物进行发酵；按10% (v/v)的接种量，依次将无色杆菌 WX1501的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)，长链脂肪烃(C2Q-4Q)单体或混合物(总浓度1 〇〇mg/ ml)接入发酵培养基;采用SKY-2102C型恒温摇床，于28 °C和150rpm的条件下培养4d;
[0006](3)从发酵液中分离得到具有高表面活性的环脂肽表面活性；用6M的NaOH将发酵液的pH值调至8.0。于lOOOOrpm下离心分离20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分子量为l〇〇〇〇Da的膜对水相溶液进行过滤，进一步除去杂质，收集透过液；
[0007]用等体积的乙酸乙酯对去除菌体、杂质的发酵液再萃取2次，合并萃取液;将其放入旋转蒸发仪中，于50°C下蒸发去除溶剂，即得粗提物；
[0008]采用湿法装填层析柱的方式，将200-300目硅胶与氯仿混合，装填入玻璃层析柱 (〇2.5 X 400mm)，使娃胶装填率达80%左右;待娃胶沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿对柱子进行平衡处理，封闭层析柱，静置过夜，备用；
[0009]用少量甲醇溶解粗提物，与少量200-300目硅胶混合，拌匀，将其置于50°C下烘干； 将硅胶与少量氯仿混合，加入层析柱，即可完成进样；依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1， v/V)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4: 6，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3:7，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、 氯仿/乙酸乙酯(l:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作为流动相进行洗脱，每种流动相的洗脱体积为300ml，洗脱流速为0.5ml/min;从氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流动相开始收集洗脱液， 每20ml收集1管，用紫外分光光度计在200-280nm的范围内扫描吸收波长，将波形相近的样品合并;真空蒸发去除溶剂，可得初步纯化的样品；
[0010]用甲醇溶解初步纯化的样品;采用反相液相色谱制备生物表面活性剂的纯品(Das et al.，2009);液相色谱制备的条件为:Waters 600HPLC，色谱柱为Xterra Pr印RP180BD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物为流动相，流速为0.5yL/min，检测器波长为256nm。[〇〇11]优选的，所述海水取自浙江舟山普陀东极海域。
[0012]优选的，所述SKY-200B型全温摇床采购于上海苏坤实业有限公司。
[0013]有益效果:本发明采用两步微生物全合成脂肽表面活性剂，有效避免了微生物菌株之间的相互竞争和极大地减少了代谢产物抑制作用，使得脂肽表面活性剂产量达到了 38.7g/L,大大高于单菌发酵生产表面活性剂的产量，有望实现脂肽表面活性剂的产业化。【具体实施方式】
[0014]结合实施例，对本发明做进一步详细说明。
[0015] —种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其具体步骤如下所示:
[0016](1)以外加氯化铵的海水为培养基，所述海水取自浙江舟山普陀东极海域，进行葡萄球菌WX2701低温厌氧发酵，按10%(v/v)的接种量，将葡萄球菌WX2701的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)接入发酵培养基;采用SKY-200B型全温摇床，所述SKY-200B型全温摇床采购于上海苏坤实业有限公司，于l〇°C和150rpm的条件下培养48h;[〇〇17](2)对获得的发酵液进行无菌过滤，并依次向获得的滤液中加入无色杆菌WX1501和长链脂肪烃(C2Q-4Q)单体或混合物进行发酵；按10% (v/v)的接种量，依次将无色杆菌 WX1501的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)，长链脂肪烃(C2Q—4〇)单体或混合物(总浓度1 OOmg/ ml)接入发酵培养基;采用SKY-2102C型恒温摇床，所述SKY-200B型全温摇床采购于上海苏坤实业有限公司，于28°C和150rpm的条件下培养4d;[〇〇18](3)从发酵液中分离得到具有高表面活性的环脂肽表面活性；用6M的NaOH将发酵液的pH值调至8.0。于lOOOOrpm下离心分离20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分子量为l〇〇〇〇Da的膜对水相溶液进行过滤，进一步除去杂质，收集透过液；
[0019]用等体积的乙酸乙酯对去除菌体、杂质的发酵液再萃取2次，合并萃取液;将其放入旋转蒸发仪中，于50°C下蒸发去除溶剂，即得粗提物；
[0020]采用湿法装填层析柱的方式，将200-300目硅胶与氯仿混合，装填入玻璃层析柱 (〇2.5 X 400mm)，使娃胶装填率达80%左右;待娃胶沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿对柱子进行平衡处理，封闭层析柱，静置过夜，备用；[〇〇21]用少量甲醇溶解粗提物，与少量200-300目硅胶混合，拌匀，将其置于50°C下烘干； 将硅胶与少量氯仿混合，加入层析柱，即可完成进样；依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1， v/V)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4: 6，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3:7，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、 氯仿/乙酸乙酯(l:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作为流动相进行洗脱，每种流动相的洗脱体积为300ml，洗脱流速为0.5ml/min;从氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流动相开始收集洗脱液， 每20ml收集1管，用紫外分光光度计在200-280nm的范围内扫描吸收波长，将波形相近的样品合并;真空蒸发去除溶剂，可得初步纯化的样品；
[0022]用甲醇溶解初步纯化的样品;采用反相液相色谱制备生物表面活性剂的纯品(Das et al.，2009);液相色谱制备的条件为:Waters 600HPLC，色谱柱为Xterra Pr印RP180BD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物为流动相，流速为0.5yL/min，检测器波长为256nm。
[0023]上述【具体实施方式】仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围中。
【主权项】
1.一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其特征在于，其具体步骤如下所示:(1)以外加氯化铵的海水为培养基，进行葡萄球菌WX2701低温厌氧发酵，按10%(v/v) 的接种量，将葡萄球菌WX2701的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)接入发酵培养基;采用SKY-200B型全温摇床，于10°C和150rpm的条件下培养48h;(2)对获得的发酵液进行无菌过滤，并依次向获得的滤液中加入无色杆菌WX1501和长 链脂肪烃(C2Q—4〇)单体或混合物进行发酵;按10%(v/v)的接种量，依次将无色杆菌WX1501的 摇瓶种子液(浓度约1 〇 1 〇个/ml)，长链脂肪烃(C2Q-4Q)单体或混合物(总浓度100mg/ml)接入 发酵培养基;采用SKY-2102C型恒温摇床，于28°C和150rpm的条件下培养4d;(3)从发酵液中分离得到具有高表面活性的环脂肽表面活性；用6M的NaOH将发酵液的 pH值调至8.0。于lOOOOrpm下离心分离20min，收集上清液(Xia et al.，2011);采用截留分 子量为lOOOODa的膜对水相溶液进行过滤，进一步除去杂质，收集透过液；用等体积的乙酸乙酯对去除菌体、杂质的发酵液再萃取2次，合并萃取液;将其放入旋 转蒸发仪中，于50°C下蒸发去除溶剂，即得粗提物；采用湿法装填层析柱的方式，将200-300目硅胶与氯仿混合，装填入玻璃层析柱2.5 X 400mm)，使娃胶装填率达80%左右;待娃胶沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿对柱 子进行平衡处理，封闭层析柱，静置过夜，备用；用少量甲醇溶解粗提物，与少量200-300目硅胶混合，拌匀，将其置于50°C下烘干;将硅 胶与少量氯仿混合，加入层析柱，即可完成进样;依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v) 的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3, v/v)的混和液、氯仿/ 乙酸乙酯(6:4，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4:6，v/ v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3: 7, v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8，v/v)的混和液、氯 仿/乙酸乙酯(1:9，v/v)的混和液、乙酸乙酯作为流动相进行洗脱，每种流动相的洗脱体积 为300ml，洗脱流速为0.5ml/min;从氯仿/乙酸乙酯(9:1，v/v)的流动相开始收集洗脱液，每 20ml收集1管，用紫外分光光度计在200-280nm的范围内扫描吸收波长，将波形相近的样品 合并;真空蒸发去除溶剂，可得初步纯化的样品；用甲醇溶解初步纯化的样品；采用反相液相色谱制备生物表面活性剂的纯品(Das et al.,2009);液相色谱制备的条件为:Waters 600 HPLC，色谱柱为Xterra Prep RP18 OBD， 以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物为流动相，流速为0.5yL/min，检测器波长为256nm。2.根据权利要求1所述的一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其特征在于，所述海 水取自浙江舟山普陀东极海域。3.根据权利要求1所述的一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其特征在于，所述 SKY-200B型全温摇床采购于上海苏坤实业有限公司。
【文档编号】C07K1/36GK106086152SQ201610649056
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610649056.9, CN 106086152 A, CN 106086152A, CN 201610649056, CN-A-106086152, CN106086152 A, CN106086152A, CN201610649056, CN201610649056.9
【发明人】肖英平, 吴酬飞, 杨华, 钱鸣蓉
【申请人】浙江省农业科学院