聚合生物表面活性剂的制作方法
【专利说明】聚合生物表面活性剂 本申请是以下申请的分案申请：申请日：2007年5月31日；【申请号】 200780028534. 3 (PCT/US2007/012799);发明名称：同上。 相关申请的交叉参考
[0001] 本申请要求保护2006年6月1日申请的美国临时申请序号60/809, 825的优先权。 联邦资助研究的声明
[0002] 不适用。 发明领域
[0003] 本发明涉及可自组装或自动聚集成聚合胶束结构的生物表面活性剂及其在局部 应用的皮肤病用产品中的用途。具体地说，本发明涉及聚合酰化生物表面活性剂，其在最小 必需培养基中具有低临界胶束浓度（由约l.Oppm至约200ppm)，并具有增加代谢溶解性蛋 白的能力。另外，它们具有相当低的毒性，优选地，在37岁女性成纤维细胞中的LD5。大于 200ppm，以及具有增加胞外皮肤基质蛋白合成和/或增加细胞更新率的能力。 发明背景
[0004] 表面活性剂作为一类分子对局部应用产品的配制人员是众所周知的。生物表面活 性剂是来源于天然原材料的特定表面活性剂类别，易于被蛋白酶降解。和标准表面活性剂 一样，它们在同一分子上既具有水溶性基团，又具有水不溶性基团，一般定义为"头和尾"。 因此，它们对亲水性和亲脂性物质（例如油，对于本发明用途更有意义的是细胞膜）均具有 亲和性；因此，这些分子还被描述为两性分子。本发明的生物表面活性剂对细胞膜具有高度 亲和性，于相似浓度没有与标准表面活性剂相关的明显破坏。它们自身以降低不相适的"头 和尾"之间的表面张力的方式定向。由于生物表面活性剂的浓度增加，交界面变得饱和，直 至达到最小表面张力，即所谓的临界胶束浓度（"CMC")。如果加入的生物表面活性剂大于 CMC，则形成胶束或聚集体。CMC-般以微摩尔（mM)表示，取决于介质的温度和离子强度。 这些聚集物的粒度和形状可变。在本发明范围内的聚合生物表面活性剂聚集体的粒度通常 在约5nm至100nm的纳米范围内。
[0005] 在护肤品中，十二烷基硫酸钠是一种常用的阴离子表面活性剂，用作润湿剂、乳化 剂或清洁剂。其在蒸馏水中的CMC为约8. 13mM(或约2400ppm)。季铵化合物是广泛使用的 阳离子表面活性剂。十二烷基三甲基溴化铵是该类化合物的代表，在蒸馏水中的CMC为约 14. 6mM(或约4300ppm)。为了比较，细胞膜的主要成分一磷脂（例如二酰基磷脂酰胆碱） 的CMC在约5X10_3mM至约4.7X10_7mM(约3ppm至约0.003ppm)的范围内。参见例如 D. Datta, Membrane Biochemistry (1987)。本发明的聚合生物表面活性剂的CMC在代表性 的阴离子和阳离子化合物以及上述细胞膜磷脂之间。
[0006] 但是，常规的表面活性剂已知引起刺激、发炎和其它负面后遗症。这部分归因于使 皮肤脱脂、除去必需的油以及快速渗透入表皮层。令人惊奇并出乎意料的是，本发明的聚合 生物表面活性剂于相似的浓度不具有这些缺点。
[0007] 如下所述，氨基酸序列在护肤品中的应用是本领域已知的。某些这样的序列可作 为酰化部分（例如乙酰、肉豆蔻酰、棕榈酰）获得。一般而言，酰化是本领域技术人员众所 周知的技术，用于增强喜水或亲水成分渗透入皮肤中。正常皮肤表面是高度疏水的，阻止亲 水物质的显著渗透。然而，酰化氨基酸序列的特性就毒性而言可极大改变，这又影响了其最 终的可用性。令人惊讶并出乎意料的是，本发明的许多聚合酰化生物表面活性剂对哺乳动 物细胞的毒性相当低（约LDM> 200)，同时对原核生命形态保持相对高度的毒性。
[0008] 而且，与先有技术的酰化氨基酸序列不同，本发明的聚合生物表面活性剂能够增 加皮肤基质蛋白（例如弹性蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白）的合成和/或增加细胞更新率，同 时没有使降解这些蛋白（例如基质金属蛋白酶）的酶合成协同增加。另外，令人惊奇并值 得注意的是，本发明的生物表面活性剂不引起炎性蛋白增加，特别是白介素6和白介素8。 该特性组合使这些化合物无以伦比地适合于护肤用途。
[0009] 本发明的聚合生物表面活性剂以低CMC有效润湿表面的能力赋予了另一种令 人惊奇并出乎意料的特性一广谱抗微生物活性。本发明的聚合生物表面活性剂能够抑 制多种微生物的生长或杀死多种微生物，所述微生物包括大肠杆菌（E.coli)、绿脓杆菌 (P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌（S. aureus)和白色念珠菌（C. albicans)。
[0010] 在个人护理和皮肤病学领域，一直以来需要高度有效的多功能成分。这类成分的 使用有助于减轻局部皮肤护理制剂常见的问题一例如不稳定性（由于成分的不相适性）， 以及活性成分的效力随时间推移降低（由于成分之间的相互作用）。多功能成分，尤其是引 起刺激、发炎或其它负面后遗症的倾向性低的那些成分，不仅在配制人员当中是高度需要 的，而且在越来越苛求并且成熟的消费者当中也是高度需要的。本发明的聚合生物表面活 性剂的有利特性合在一起使它们成为令人惊讶并出乎意料的多功能成分，该多功能成分满 足了迄今尚未满足的对要求毒性相当低的产品的要求，所述产品既有助于储存、保持和改 善与疾病、衰老和/或环境应激源相关的皮肤病，同时在许多情况下同时抑制微生物生长。
[0011] 在护肤品中伸用的先有抟术的氨基酸序列
[0012] 以下的化妆用成分各自均由2个氨基酸组成，是市售可得的：二肽_1(酪氨酸和精 氨酸残基）；二肽-2 (缬氨酸和色氨酸残基）；二肽_4 (苯丙氨酸和色氨酸残基）。除非另 有指示，否则化妆用成分由其在化妆品、盥洗用品和香水协会（"CTFA"）出版的国际化妆品 成分（INCI)辞典和手册（第10版）中的指定名称描述。INCI辞典未指定氨基酸序列或每 个氨基酸残基的量。如下所述，三肽在INCI辞典中可被描述为含有2个氨基酸残基，而没 有指出2个所列氨基酸之一是否出现两次，或者肽序列中的第三个氨基酸是否选自18个其 它天然氨基酸。
[0013] 美国专利申请公开号2003/0166510教导了使用有效量的离子金属-肽复合物以 重建皮肤并减小或除去皮肤瑕疵。（本文援引的被许可的美国专利和公开的美国专利申请 就以相关程度在此引入作为参考）。在该参考文献中讲述的皮肤瑕疵包括症痕（例如由伤 口、痤疮产生）、皮赘、胼胝、良性皮肤胎块、萎缩纹、面部角质、晒斑或白癜风斑。按照该参考 文献，离子金属-铜（II)、锡（II)、锡（IV)和锌（II)及其盐，与化学合成的二肽、三肽和四 肽复合。Phe-Phe和Gly-Gly被明确地讲述为可与以上列出的离子肽复合的二肽片段。
[0014] 西班牙专利申请公开号ES2020148教导了由9-17个碳原子的饱和或不饱和的脂 肪酸链组成的生物表面活性剂，N-末端连接为L-、D-或DL型中的任一种的精氨酸，后接 选自20个天然氨基酸中的任一个的第二个氨基酸。教导了具体的氨基酸序列Arg-Gly、 Arg-Ser 和 Arg-Phe。
[0015] 三肽-1，含有3个氨基酸残基一甘氨酸、组氨酸和赖氨酸的合成肽以商标 Kollaren C.P.P·由Vincience商购，以及以Kollaren由I.E.B.商购。三肽-1与水、尿 素、葡萄糖和盐酸胍的混合物以Kollaren由Atrium Biotechnologies售卖。Gly-His-Lys 序列在文献中被描述为活性羰基物质（"RCS"）的清除剂，活性羰基物质是细胞代谢过程 (包括脂质过氧化和糖化）的副产物。已经将RCS与胶原交联和伴随的皮肤弹性丧失关联 起来。参见 Puig 等，"Peptides as Active Ingredients in Cosmetics,''Cosmetics and Toiletries Manufacture Worldwide, 121-125 页。该氨基酸序列不具有 CMC。而且，其不 形成聚合体。因此，其不是本发明范围内的生物表面活性剂。
[0016] 乙酰三肽-1是乙酸的反应产物，因此不是本发明范围内的生物表面活性剂。通 常，乙酰化不能给予用作生物表面活性剂所需的足够两性特性。
[0017] 生物素化三肽通过将维生素 Η(生物素）嫁接到三肽Gly-His-Lys上形成。美国专 利申请公开号2006/0067905描述了通过给予齐墩果酸、序菜素和生物素化-Gly-His-Lys 治疗掉发的方法。该生物素化部分不赋予足以产生生物表面活性剂特性的疏水性。
[0018] 棕榈酰三肽-1也被描述为Pal-GKH，是三肽-1和棕榈酸的反应产物。其可依据商 标Lipo-GKH由Sederma获得。当以酸为末端时，该脂-寡肽序列不具有可检测的抗微生物 活性；而且，其于相当低的浓度（例如约50ppm的LDJ对哺乳动物细胞有毒性。由于这些 原因，该脂-寡肽不属于本发明的范围。
[0019] 美国专利申请公开号2004/0120918在段落#0008描述了 Pal-Gly-His-Lys，其以 Biop印tide CL得自Sederma。该三肽的INCI名称为棕榈酰寡肽，其按照INCI辞典为以 下的2个或多个氨基酸残基的合成肽的棕榈酸酯：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨 酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸或缬氨酸。
[0020] 在C末端具有游离酸或酰胺的Pal-Gly-His-Lys在哺乳动物细胞系中表现出显著 毒性（即在37岁女性成纤维细胞中的LD5(]< 100)，因此不属于本发明的范围。
[0021] 美国专利申请公开号2004/0132667教导了 3个氨基酸的序列一甘氨酸、组氨酸和 赖氨酸残基。优选的三肽具有特定的氨基酸序列Gly-His-Lys。其中教导序列的类似物包 括其中3个氨基酸中的一个或多个在序列中重构或重排的那些（例如Gly-Lys-His)。该公 开专利还教导了取代3个氨基酸中的至多2个。其教导可取代Gly的氨基酸具有脂肪族侧 链，例如但不限于0_^1&、413、\%1、1^11、？1'〇和116。其中优选413、1^11和116。其教导取 代Lys或His的氨基酸包括具有于pH约6主要包含带电荷的氮的侧链的那些氨基酸（例如 Pro、Lys、Arg、His、锁链素和异锁链素）。最优选地，用鸟氨酸、精氨酸或瓜氨酸置换Lys。
[0022] ' 667申请进一步教导附着至上述取代的或重排的氨基酸序列的酰基-部分，其 来源于：乙酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、亚油酸、亚麻酸、硫 辛酸、油酸、异硬脂酸、反油酸（elaidoic acid)、2_乙基己酸（2-ethylhexaneic acid)、 椰子油脂肪酸、牛脂酸、硬化牛脂酸、棕榈仁油脂肪酸、羊毛脂酸。这些衍生物被进一步讲 述为直链或支链、长链或短链、饱和的或不饱和的、被羟基、氨基、酰基氨基、硫酸酯基或亚 硫酸酯基取代的或未取代的。据教导优选的酰基包括棕榈酰和肉豆蔻酰。通过讲述用丙 氨酸或精氨酸置换赖氨酸，并用棕榈酰或肉豆蔻酰基团酰化产生的3个氨基酸序列，' 667 公开文献教导了以下的酰化肽：Pal-Gly-His-Arg ;Pal-Arg-His_Ala ;Pal-Arg-His_Gly ; Pal-Ala-His-Arg ；Myr-Gly-His~Arg ；Myr-Arg-His~Ala ；Myr-Arg-His-Gly ； Myr-Ala-His-Arg。然而，该专利出版物没有讲述这些酰化三肽的C末端酰胺化或本发明的 聚合生物表面活性剂的抗微生物、刺激和/或增殖特性。而且，在该公开文献中公开的三肽 于中性pH仅具有1个带正电荷的氨基酸残基。如下所述，本发明的聚合生物表面活性剂大 部分含有2个并且常常是3个带正电荷的氨基酸残基。
[0023] 三肽-2是一种合成肽，依据商标I.E.L.由Vincience获得。根据INCI辞典，其 含有2个氨基酸残基一酪氨酸和缬氨酸。该氨基酸序列不具有CMC，因此不是本发明范围内 的生物表面活性剂。
[0024] 三肽_3具有氨基酸序列Gly-His-Arg，已被Therapeutic Peptides Inc以上市材 料公开。该氨基酸序列不具有CMC，因此不是本发明范围内的生物表面活性剂。
[0025] 科学文献报道，铜三肽Gly-His-Lys-Cu对成纤维细胞的胶原合成具有刺激作 用。参见Maquart FX等，FEBSLett.238(2):343-6(1988)。另参见在美国皮肤医学学会 第 60 届年会上发表的 Oddos T 等，"Requirement of Copper and Tripeptide Glycyl- L-Histidyl-L-Lysine-Cu(GHK)Complex Formation for Collagen Synthesis Activity in Normal Human Dermal Fibroblasts"（New Orleans, LA1，2002 年 2 月）。另外，已报 道该铜三肽促进伤口愈合。参见Fish等，Wounds 3:171(1991) ;Mulder等，WoundRep. andRegen. 2:259(1994) 〇
[0026] Gly-His-Lys-Cu的化妆用途描述于均转让给ProCyte Corporation的美国专利 号5, 135, 913和5, 348, 943。在商业上，该铜三肽用作露得清紧致活力晚霜（Neutrogena Visibly Firm Night Cream)以及 ProCyte Corp.以商标名 Simple _S〇丨UtioilS:⑩抗衰老护 肤品（由水疗师和美容师售卖）和Neova? (由皮肤科医师售卖）提供的产品中的成分。
[0027] 于1993年2月25日公布的德国专利申请DE 4127790A1教导了 Gly-His-Lys的 Mg、Mn、Zn和Ge复合物改善皮肤状况的用途。如在欧洲专利局站点espacenet. net所公布 的，该专利申请的文献数据也教导了三肽，其中该肽的3个组成氨基酸中的每一个均是赖 氨酸、羟赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、甘氨酸或组氨酸中的一个。更具体地说，教导了 符合式B1-B2-B3的三肽，其中B1、B2和B3中的每一个均是以上列出的7个氨基酸之一。
[0028] 德国专利申请DE 4244 418 A1教导了化妆用和药用组合物，其含有1ρΜ-0. 01M浓 度的Gly-His-Lys和Gly-Asp-Ser，它们既是三肽，又是更长肽部分的组成部分。据教导这 些组合物通过用盐酸温和水解胶原、弹性蛋白、角蛋白或结缔组织制备，或者使用溶组织梭 菌（C. histolyticum)胶原酶部分水解制备。其中所公开的抗衰老护肤应用有刺激胶原合 成和清除自由基。
[0029] 法国专利申请FR 2 826 577 A1教导了含有序列Lys-Pro-Val的肽。按照该申请， 局部应用含有该序列的组合物增加编码涉及表皮脂质（即胆固醇、脂肪酸和鞘脂）合成的 酶的基因的表达，由此改善皮肤屏障功能。该公开肽序列不具有CMC，因此不是本发明范围 内的生物表面活性剂。
[0030] 美国专利5, 493, 894教导了用于治疗皮肤皱纹的组合物，其含有由至少3个精氨 酸或赖氨酸残基组成的三、四和五肽部分。其中具体公开的三肽有：（i)H-Arg-Lys-Arg-OH ; (ii)H3C-C(0)_Arg-Lys-Arg-NH2。这两种具体公开的序列不具有CMC，因此不是本发明范围 内的生物表面活性剂。
[0031] 美国专利申请公开号2003/0166510教导了离子金属-三肽复合物的用途，其中铜 (II)、锡（II)、锡（IV)或锌（II)之一与以下氨基酸序列复合：Gly-His-LyS ;Gly-Gly-His ; His-Gly-Gly ;Gly_Gly_Gly ;Ala_Gly_His ;Gly_Cys_Gly ;His_Gly-His。上述金属-三肽复 合物不具有CMC，因此不是本发明范围内的生物表面活性剂。
[0032] 美国专利申请公开2006/0013794教导了化妆用、皮肤病用和/或药用组合物，其 含有包含氨基酸序列Arg-Gly-Ser的三肽、四肽、五肽、六肽、七肽和九肽。
[0033] 四肽-1是含有4个氨基酸残基一亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸和缬氨酸的合成肽的 INCI名称。以商标名I. E. L. Leuococytar弹性蛋白酶抑制剂由Vincience售卖。如上所 述，单独的氨基酸序列不具有足以自聚集的疏水性，因此没有CMC，不是本专利范围内的生 物表面活性剂。而且，在该化合物中的4个氨基酸没有1个带电荷。由于此原因，该化合物 不在本发明的范围内。
[0034] 四肽-4是分配给合成四肽的INCI名称，该合成四肽以商标名Collasyn 4GG由 Therapeutic Peptides Inc.售卖。其含有3个氨基酸残基-甘氨酸、谷氨酸和脯氨酸。更 具体地说，该肽具有序列Gly-Glu-Pro-Gly。由于上述原因，该氨基酸序列不是本发明范围 内的生物表面活性剂（即无 CMC，不自聚集）。
[0035] Therapeutic Peptides Inc.还以商标名 Collasyn 414 GG 公开了酰化氨基酸序 列Myr-Gly-Glu-Pro-Gly。该序列于500ppm以下的浓度不抑制大肠杆菌（E. coli)、痤疮丙 酸杆菌（P. acnes)、绿脓杆菌（P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌（S. aureus)和/或白色念 珠菌（C. albicans)的生长，因此不在本发明的范围内。
[0036] 乙酰四肽-1是乙酸的反应产物，为含有3个氨基酸残基-甘氨酸、组氨酸和赖氨 酸的合成肽。其以商标名Kollaren 6由I.E.B.售卖。由于上述原因，该氨基酸序列不是 本发明范围内的生物表面活性剂（即无 CMC，不自聚集）。
[0037] 乙酰四肽-2是乙酸的反应产物，为含有4个氨基酸残基一天冬氨酸、赖氨 酸、酪氨酸和结I氨酸的合成肽。由I.E.B.生产的产品以商标名Thymulen 4由Atrium Biotechnologies售卖。产品文献描述了为生物模拟肽的Thymulen 4,其由具有皮肤再生 特性的胸腺生成素衍生。由于上述原因，该氨基酸序列不是本发明范围内的生物表面活性 剂（即无 CMC，不自聚集）。
[0038] Rigin是具有序列Gly-Gln-Pro-Arg的四肽，在科学文献中由Veretennikova 等，Int. J. P印tide Protein Res.，17:430(1981)报告。棕榈酰四肽在INCI辞典中被描述 为棕榈酸和含有甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸的合成肽的反应产物。其由Sederma市 售可得。
[0039] 酰化氨基酸序列Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-酸于500ppm以下的浓度时不抑制微生物 的生长，所述微生物包括大肠杆菌（E. coli)和绿脓杆菌（P. aeruginosa)，因此不在本发明 的范围内。而且，该化合物及其以酰胺为末端的类似物在哺乳动物细胞系中表现出显著的 毒性（即在37岁女性成纤维细胞中的LDM< 100)。
[0040] Eyeliss是组合两种肽的原材料浓缩物的商标名，由Sederma销售，有助于减轻浮 肿外貌和黑眼圈。如在国际专利申请PCT FR-03/00441中所述，其为橙皮苷甲基查耳酮和 两个酰化肽片段一缬氨酰-色氨酸和N-棕榈酰-Gly-Gln-Pro-Arg的组合。更一般地，该 PCT申请描述了以C2-C22碳链开始并以序列Pro-Arg-ΟΗ终止的三肽、四肽和五肽。按照美 国专利6, 974, 799, Val-Trp二肽没有显著的胶原刺激活性，其与Gly-Gln-Pro-Arg四肽组 合未使该特性相对于使用单独的四肽实现的水平表现出任何增强。
[0041] Matrixyl 3000 是两个酰化肽 N-棕榈酰-Gly-Gln-Pro-Arg 和 N-棕榈 酰-617-把8-1^8组合的商标。美国专利6,974,799教导了局部组合物，其含有（1)约 0.00001 %至约0.5% (基于组合物总重）的至少一种"基于rigin的四肽"（定义为 Gly-Gln-Pro-Arg)和约0· 00001 %至约1. 0%的至少一种三肽Gly-His-Lys，其中三肽以大 于四肽的量存在，和（ii)至少一种另外的护肤成分。所公开的组合物据教导可用于减少衰 老和萎缩纹的明显征兆以及明显的黑眼圈。
[0042] DE 4127790 教导 了以下的四肽：（i)Gly-His-Lys-Lys ; (ii)Gly-His-Lys-Gly ; (iii)G1y-His-His-Gly ； (iv)Gly-His-His-L